Aislamiento de células endoteliales de la luz de arterias carótidas de ratón para experimentos multiómicos unicelulares

Resumen

Presentamos un método para aislar células endoteliales y núcleos de la luz de arterias carótidas de ratón expuestas a condiciones de flujo estables o alteradas para realizar experimentos ómicos unicelulares.

Resumen

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria de las regiones arteriales expuestas a un flujo sanguíneo alterado (flujo d). El flujo D regula la expresión de genes en el endotelio a nivel transcriptómico y epigenómico, dando lugar a respuestas proaterogénicas. Recientemente, se realizaron estudios de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y ensayo de células individuales para secuenciación de cromatina accesible por transposasa (scATACseq) para determinar los cambios transcriptómicos y de accesibilidad a la cromatina a una resolución de una sola célula utilizando el modelo de ligadura carotídea parcial (PCL) de ratón. Como las células endoteliales (CE) representan una fracción menor de las poblaciones celulares totales en la pared arterial, se utilizó un método de digestión luminal para obtener preparaciones unicelulares enriquecidas con EC. Para este estudio, los ratones fueron sometidos a cirugía de LCP para inducir el flujo d en la arteria carótida izquierda (LCA) mientras usaban la arteria carótida derecha (RCA) como control. Las arterias carótidas se diseccionaron dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP. La luz de cada carótida se sometió a la digestión de colagenasa, y se obtuvieron células individuales enriquecidas endotelialmente o núcleos únicos. Estas preparaciones de una sola célula y de un solo núcleo se codificaron posteriormente utilizando una configuración microfluídica de Genomics 10x. Las células individuales y núcleos únicos con código de barras se utilizaron para la preparación de ARN, la generación de bibliotecas y la secuenciación en un secuenciador de ADN de alto rendimiento. Después del procesamiento bioinformático, los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq identificaron varios tipos de células de la digestión luminal, que consisten principalmente en CE. Las células musculares lisas, los fibroblastos y las células inmunes también estaban presentes. Este método de enriquecimiento de EC ayudó a comprender el efecto del flujo sanguíneo en el endotelio, lo que podría haber sido difícil con el método de digestión arterial total. El método de preparación de células individuales enriquecido con CE se puede utilizar para realizar estudios ómicos de células individuales en ratones EC-knockouts y transgénicos donde no se ha estudiado el efecto del flujo sanguíneo sobre estos genes. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar para aislar células individuales enriquecidas con CE de explantes de arterias humanas para realizar estudios mecanicistas similares.

Introducción

Este laboratorio demostró previamente que la inducción del flujo d conduce al desarrollo rápido y robusto de aterosclerosis en ratones hiperlipidémicos ^1,2. El nuevo modelo de ratón de aterosclerosis inducida por flujo D fue posible mediante cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP) ³. La cirugía de LCP induce una condición de flujo sanguíneo bajo y oscilatorio o flujo D en la arteria carótida izquierda ligada (LCA). En contraste, la arteria carótida derecha contralateral (ACR) continúa enfrentando un flujo laminar estable (flujo s). Anteriormente, para comprender el efecto del flujo d en las células endoteliales, las arterias carótidas se diseccionaron después de la cirugía de ligadura parcial y se enjuagaron con un agente lisante a base de isotiocianato de fenol y guanidina (método de lavado de ARN / ADN luminal)^2,4, que proporcionó ARN o ADN enriquecidos endotelialmente "agrupados". Estos ARN o ADN a granel agrupados se procesaron para estudios transcriptómicos o estudios de metiloma de ADN epigenómico, respectivamente ^4,5,6. Estos estudios ayudaron a descubrir múltiples genes sensibles al flujo y microARN cuyos roles en la biología endotelial y la aterosclerosis fueron ampliamente investigados ^4,6,7.

Sin embargo, a pesar del enriquecimiento endotelial, estos estudios masivos de ARN / ADN no pudieron distinguir el papel específico de cada tipo de célula en la pared arterial en la aterosclerosis inducida por flujo d. Para superar^{esta limitación se} realizó aislamiento unicelular (sc) enriquecido endotelial y estudios de secuenciación de scRNA y scATAC 8. Para esto, los ratones C57Bl6 fueron sometidos a la cirugía PCL para inducir el flujo d en el LCA mientras usaban el RCA expuesto al flujo s como control. Dos días o dos semanas después de la cirugía de LCP, los ratones fueron sacrificados, y las carótidas fueron diseccionadas y limpiadas. La luz de los ACV y los ACR se infundió con colagenasa, y se recogieron los digeridos luminales de colagenasa que contenían CE como una fracción significativa y otras células arteriales. La suspensión de una sola célula (scRNAseq) o la suspensión de un solo núcleo (scATACseq) se prepararon y codificaron con códigos de barras con identificadores únicos para cada célula o núcleo utilizando una configuración genómica 10x. Los ARN se sometieron a la preparación de la biblioteca de ADNc y se secuenciaron.

Los conjuntos de datos scRNAseq y scATACseq se procesaron utilizando el software Cell Ranger Single-Cell y se analizaron posteriormente mediante los paquetes Seurat y Signac R ^9,10. A cada célula y núcleo se le asignó un tipo de célula de estos análisis y se agrupó en el tipo de célula en función de los genes marcadores y los patrones de expresión génica únicos. Los resultados de scRNAseq y scATACseq demostraron que estas preparaciones unicelulares están enriquecidas con CE y también contienen células musculares lisas (SMC), fibroblastos y células inmunes.

Un análisis posterior reveló que la población de EC en la digestión luminal es altamente divergente y plástica (8 grupos diferentes de EC) y responde al flujo sanguíneo. Lo más importante es que estos resultados demostraron que el flujo d reprograma los CE de un fenotipo antiinflamatorio protegido por atero a fenotipos proaterogénicos, incluida la transición proinflamatoria, endotelial a mesenquimal, la transición de células madre / progenitoras endoteliales y, lo que es más sorprendente, la transición de células endoteliales a inmunes. Además, los datos de scATACseq revelan nuevos cambios de accesibilidad a la cromatina dependientes del flujo y sitios de unión al factor de transcripción de una manera genómica completa, que forman la base de varias hipótesis nuevas. La metodología y el protocolo para preparar células endoteliales individuales para estudios multiómicos unicelulares de las arterias carótidas de ratón se detallan a continuación.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales descritos a continuación fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory. Se utilizaron ratones C57BL / 6 no hipercolesterolémicos, emparejados por edad y sexo para mitigar la variación dependiente del sexo y compensar cualquier complicación de las afecciones hipercolesterolémicas.

1. Cirugía de ligadura carotídea parcial (LCP)

NOTA: La ligadura parcial de la arteria carótida de LCA se llevó a cabo como se describió y demostró anteriormente³.

1. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (5% de isofluorano en oxígeno para la inducción y 1,5% después de eso para el mantenimiento) durante todo el procedimiento utilizando un vaporizador anestésico. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una almohadilla isotérmica Deltaphase para evitar la pérdida de calor corporal durante la cirugía.
2. Aplique un ungüento ocular para prevenir la exposición a la queratitis y confirme la profundidad de la anestesia por la ausencia de respuesta de pellizco del dedo del pie.
3. Inyecte buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea para controlar el dolor de forma preventiva. Desinfecte el área depilada aplicando y limpiando con betadina e isopropanol solución tres veces. Asegúrese de que betadine sea el último paso para esterilizar el área de la cirugía, comenzando desde el centro y terminando por los lados.
4. Usando técnicas asépticas, haga una incisión ventral en la línea media (~ 1 cm) en la región del cuello y exponga el punto de ramificación de LCA mediante disección roma.
5. Ligate las arterias carótida interna izquierda, carótida externa y occipital con sutura de seda 6-0; Deje intacta la arteria tiroidea superior.
6. Aproximar la piel y cerrar la incisión con pegamento de tejido y/o suturas.
7. Transfiera el ratón a una jaula de recuperación precalentada (mantenida a 37 °C) y colóquelo sobre una toalla limpia durante un máximo de 1 h para evitar la hipotermia postoperatoria.
   NOTA: En nuestra experiencia, una dosis única preventiva de buprenorfina (0,05 mg/kg) suele ser suficiente para el manejo del dolor postoperatorio. Se puede administrar una dosis repetida de buprenorfina si el animal está en peligro después de las primeras 24 horas. Si se realiza correctamente, no hay mortalidad asociada con este procedimiento, y el estrés postoperatorio para el ratón es mínimo. Los ratones son devueltos a sus respectivas jaulas y monitoreados diariamente después de la cirugía.
8. Prepare la configuración de perfusión.
   1. Use NaCl al 0,9% (solución salina normal) que contenga 10 U/ml de heparina en una bolsa intravenosa. Enganche la bolsa intravenosa a 244-274 cm (8-9 pies) del suelo o aproximadamente 122-152 cm (4-5 pies) más alta que la tabla de disección. Coloque la aguja de mariposa en el extremo de la línea salina y elimine cualquier burbuja de aire de la línea IV.

2. Aislamiento de las arterias carótidas después del sacrificio

1. Sacrificar los ratones por inhalación de_CO2 siguiendo el protocolo institucional IACUC.
2. Rocíe etanol al 70% sobre la piel del ratón y colóquelo en posición supina en la tabla de disección que contiene toallas de papel adsorbentes. Asegure las patas del ratón a las toallas adsorbentes en la tabla de disección con cinta adhesiva o una aguja de 21 G.
3. Usando un par de tijeras estériles, retire la piel del ratón comenzando desde el abdomen hasta la parte superior del tórax.
4. Use un par de tijeras para abrir la pared abdominal debajo de la caja torácica mediante disección roma.
5. Usando las tijeras, haga cuidadosamente una incisión a lo largo del diafragma y continúe a través de las costillas a ambos lados del tórax hasta que se pueda levantar el esternón. Levante suavemente el esternón con un par de fórceps; Después de eso, retire la caja torácica para exponer el corazón.
6. Retire con cuidado el timo y cualquier tejido conectivo sobre el corazón para visualizar los vasos principales.
7. Cortar la vena cava con tijeras para permitir que la sangre salga de la circulación cerrada.
8. Inserte una aguja de mariposa de 21 G conectada a la línea IV a través del ápice del corazón hacia el ventrículo izquierdo y permita la perfusión retrógrada durante 2-3 minutos con solución salina normal a temperatura ambiente. Asegúrese de que se mantenga un caudal constante de solución salina normal manteniendo la bolsa salina a una altura de 8-9 pies del suelo.
   NOTA: Los pulmones y el hígado se vuelven pálidos, lo que indica una perfusión óptima. Se utilizan aproximadamente 20 ml de tampón de perfusión para cada ratón.
9. Retire la piel de la región del cuello y retire toda la grasa, los músculos y los tejidos conectivos para exponer las arterias carótidas (Figura 1A).
   NOTA: El resto del procedimiento se lleva a cabo bajo el microscopio de disección.
10. Ajuste el campo de visión para localizar los sitios de ligadura. Usando las tijeras de microdisección de 10 mm, haga una pequeña incisión debajo del sitio de ligadura en el LCA para permitir la perfusión.
11. Perfundir de nuevo durante 1 minuto adicional a través del ventrículo izquierdo y asegúrese de que el LCA esté bien perfundido y libre de cualquier rastro visible de sangre.
12. Use pinzas de punta fina y tijeras de resorte pequeñas para eliminar cuidadosamente los tejidos periadventicios que rodean las carótidas mientras la carótida está unida al cuerpo.
    NOTA: Tenga mucho cuidado de no apretar o estirar las arterias carótidas durante este paso de limpieza, ya que esto puede aumentar el número de células no viables. Si se realiza correctamente, la viabilidad celular en la suspensión celular final suele ser del >93%.

3. Aislamiento unicelular enriquecido con células endoteliales de ratones carotídeos

NOTA: Los reactivos descritos a continuación pueden prepararse previamente y almacenarse a 4 °C hasta su uso: tampones de lisis de un solo núcleo 1x y 0,1x con los reactivos enumerados en la Tabla 1; tampón de lavado de un solo núcleo con los reactivos enumerados en la tabla 1; receta de tampón de núcleos de un solo núcleo con los reactivos enumerados en la Tabla 1. Las existencias de explotación de estos colchones deben prepararse siguiendo el protocolo del fabricante. Composición del tampón digestivo: colagenasa tipo II 600 U/mL y DNasa I 60 U/mL en suero bovino fetal al 0,5% (FBS) que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS).

1. Mientras las carótidas todavía están unidas, lave el exterior de las arterias carótidas con solución salina normal para eliminar cualquier rastro de sangre.
2. Usando una jeringa de insulina equipada con una aguja de 29 G, inyecte ~ 50 μL del tampón de digestión en el lumen del extremo distal de la arteria carótida izquierda. A medida que el tampón de digestión comienza a llenar la arteria carótida, sujete el extremo proximal de la carótida con un microclip (Figura 1B). Introduzca 15-20 μL adicionales de tampón de digestión en el lumen y recorte el extremo distal para evitar la liberación del tampón de digestión.
3. Explantar cuidadosamente las arterias carótidas del ratón (Figura 1B,C) y colocarlas en platos de 35 mm que contengan solución salina tamponada con Hepes tibia (a 37 °C).
   NOTA: Asegúrese de que ambas abrazaderas estén bien colocadas. Si la pinza se afloja, la solución de digestión puede salir de la luz y afectar el recuento de células obtenidas. Si esto sucede, agregue una solución enzimática adicional utilizando una jeringa de insulina equipada con una aguja de 29 G desde el extremo abierto de la carótida y vuelva a asegurar la pinza (Figura 1D). Si la solución tampón enzimática vuelve a filtrarse, es probable que la carótida se corte durante el proceso de explantación. En este caso, descartar la carótida y excluir la muestra del estudio. El manejo brusco repetido de la carótida disminuirá la viabilidad celular y la calidad de la preparación de una sola célula. Tenga cuidado de identificar y etiquetar correctamente las arterias carótidas izquierda y derecha.
4. Incubar las carótidas explantadas durante 45 min a 37 °C con balanceo intermitente.

4. Lavado de las arterias carótidas

1. Después de completar la digestión enzimática luminal, retire la arteria carótida junto con las pinzas del plato de 35 mm. Retire cuidadosamente cada pinza, teniendo cuidado de que el tampón de digestión no tenga fugas.
2. Sostenga suavemente un extremo de la arteria carótida con fórceps finos sobre un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Insertar una aguja de 29 G equipada con una jeringa de insulina que contenga 100 μL de tampón de digestión caliente (37 °C) en el lumen con la otra mano (Figura 1D).
3. Enjuague rápidamente la luz de la carótida en el tubo de microcentrífuga. Bloquee la reacción enzimática agregando 0.3 ml de FBS en el tubo de 1.5 ml. Coloque el tubo sobre hielo.
   NOTA: El lavado contiene las células de la digestión enzimática luminal. Agregar FBS y reducir la temperatura detiene el proceso de digestión enzimática. Si el número de células en la preparación es alto y contiene desechos o tejido graso, se recomienda encarecidamente el uso de un filtro de células de 50 o 70 μm para filtrar los restos de tejidos no deseados. Para aumentar el recuento de células individuales, se recomienda enjuagar varias carótidas. Aquí, para obtener al menos 5.000 células, se enjuagaron entre 10 y 12 carótidas y se agruparon como una muestra.
4. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo (véase la tabla de materiales).
5. Desechar el sobrenadante y resuspender la gránula celular en un tampón de digestión que contenga el reactivo de disociación celular (ver la Tabla de materiales) durante 5 min a 37 °C para separar todas las células en células individuales.
   NOTA: Si el número de celdas en la preparación es bajo, aumente la velocidad de la centrífuga hasta 2,000-3,000 × g para girar las celdas. Además, el uso de tubos centrífugos de 0,5 ml facilita una mejor visualización del pellet celular en la parte inferior del tubo.
6. Bloquee la reacción enzimática agregando 0.15 ml de FBS en el tubo de 0.5 ml.
7. Centrifugar la suspensión unicelular a 500 × g durante 5 min a 4 °C utilizando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo, como en el paso 4.4.
8. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 100 μL de solución de albúmina sérica bovina (BSA) helada al 1% en PBS en un tubo de microcentrífuga de 0,2 ml.
   NOTA: El uso de tubos centrífugos de 0,2 ml mejora la visualización del pellet de una sola célula en la parte inferior del tubo.

5. Análisis de una sola célula y de un solo núcleo

1. Resuspender y enviar la preparación de una sola célula para scRNAseq.
   1. Resuspender el pellet unicelular con 100 μL de BSA al 1% helada en PBS en un tubo de 0,2 ml.
   2. Después de resuspender las celdas para la encapsulación de una sola célula, proceda inmediatamente a la encapsulación de una sola celda y al código de barras utilizando un sistema de partición y código de barras de una sola célula basado en microfluídica (consulte la Tabla de materiales).
   3. Antes de enviar las muestras al núcleo genómico, cuente e inspeccione las preparaciones unicelulares; asegurar la ausencia de agregados celulares.
      NOTA: La agregación de células individuales se puede minimizar aún más aumentando la cantidad de BSA hasta un 2%.
2. Vuelva a suspender y envíe la preparación de celda única para scATACseq.
   1. Resuspender el pellet de celda en 100 μL de BSA al 0,04% en 1x PBS helado y centrifugar la suspensión unicelular a 500 × g a 4 °C.
   2. Lise la suspensión de una sola celda con tampón de lisis 0.1x helado (Tabla 1) e incubar durante 5 minutos en hielo.
   3. Mezclar el lisado 10 veces con una pipeta P-20 e incubar durante 10 minutos adicionales.
   4. Añadir 500 μL de tampón de lavado refrigerado (Tabla 1) a las células lisadas y mezclar 5 veces con una pipeta.
      NOTA: Utilice un filtro de células de 70 μm para filtrar cualquier residuo de la suspensión celular y transferirlo a un tubo de 2 ml.
   5. Centrifugar el lisado a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el nuclei-pellet en el tampón de núcleos diluidos (150 μL) (ver la Tabla de materiales y la Tabla 1). Contar e inspeccionar las preparaciones de un solo núcleo utilizando un hemocitómetro¹¹.
   6. Envíe la muestra de núcleos únicos al núcleo genómico para la transposición de núcleos únicos, la partición de núcleos, la preparación de bibliotecas y la secuenciación.
      NOTA: Si el número inicial de células es bajo, es común observar restos a lo largo de los núcleos. Por lo tanto, se recomienda comenzar con un alto número de células.

Resultados

Se realizaron cirugías de ligadura carotídea parcial en 44 ratones, y el inicio del flujo d en el LCA se validó mediante la realización de ecografía un día después de la cirugía de ligadura parcial. La cirugía de ligadura parcial exitosa reduce la velocidad del flujo sanguíneo y revierte el flujo sanguíneo (flujo alterado) en el LCA³. Las arterias carótidas se diseccionaron a los dos días o a las dos semanas después de la ligadura. La luz de cada carótida se sometió a la d...

Discusión

Este documento proporciona un protocolo detallado para aislar preparaciones unicelulares de las arterias carótidas del ratón. La influencia del flujo d en las células endoteliales se puede estudiar con precisión si la cirugía de LCP se realiza correctamente. Es crucial identificar correctamente las ramas de la carótida común, como la carótida externa, la carótida interna, la arteria occipital y la arteria tiroidea superior. La validación de los patrones de flujo por ecografía valida aún más el inici...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac