Tek Hücreli Multi-Omik Deneyler için Fare Karotis Arterlerinin Lümeninden Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Tek hücreli omik deneyler yapmak için stabil veya rahatsız edici akış koşullarına maruz kalan fare karotis arterlerinin lümeninden endotel hücrelerini ve çekirdeklerini izole etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Ateroskleroz, bozulmuş kan akışına (d-flow) maruz kalan arteriyel bölgelerin enflamatuar bir hastalığıdır. D-akımı , endoteldeki genlerin ekspresyonunu transkriptomik ve epigenomik seviyelerde düzenler ve proaterojenik yanıtlarla sonuçlanır. Son zamanlarda, fare kısmi karotis ligasyonu (PCL) modeli kullanılarak transkriptomik ve kromatin erişilebilirliği değişikliklerini tek hücreli çözünürlükte belirlemek için Transpozaz Erişilebilir Kromatin dizilimi (scATACseq) için tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve tek hücreli Tahlil çalışmaları yapılmıştır. Endotel hücreleri (ECs), arter duvarındaki toplam hücre popülasyonlarının küçük bir kısmını temsil ettiğinden, EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli preparatlar elde etmek için luminal bir sindirim yöntemi kullanılmıştır. Bu çalışma için fareler, sağ karotis arteri (RCA) kontrol olarak kullanırken, sol karotis arterde (LCA) d-akışını indüklemek için PCL cerrahisine tabi tutuldu. Karotis arterler PCL cerrahisinden iki gün veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreler veya tek çekirdekler elde edildi. Bu tek hücreli ve tek çekirdekli preparatlar daha sonra 10x Genomik mikroakışkan kurulum kullanılarak barkodlandı. Barkodlanmış tek hücreler ve tek çekirdekler daha sonra RNA hazırlama, kütüphane oluşturma ve yüksek verimli bir DNA sıralayıcısında dizileme için kullanıldı. Biyoinformatik işleme sonrası, scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, öncelikle EC'lerden oluşan luminal sindirimden çeşitli hücre tiplerini tanımladı. Düz kas hücreleri, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri de mevcuttu. Bu EC-zenginleştirme yöntemi, toplam arter sindirim yöntemiyle zor olabilecek kan akışının endotel üzerindeki etkisini anlamaya yardımcı oldu. EC ile zenginleştirilmiş tek hücreli hazırlama yöntemi, kan akışının bu genler üzerindeki etkisinin çalışılmadığı EC-nakavtlarda ve transgenik farelerde tek hücreli omik çalışmalar yapmak için kullanılabilir. Önemli olarak, bu teknik, benzer mekanik çalışmalar yapmak için EC ile zenginleştirilmiş tek hücreleri insan arter eksplantlarından izole etmek için uyarlanabilir.

Giriş

Bu laboratuvar daha önce d-flow indüksiyonunun hiperlipidemik farelerde hızlı ve sağlam ateroskleroz gelişimine yol açtığını göstermiştir ^1,2. D-flow kaynaklı aterosklerozun yeni fare modeli, kısmi karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi kullanılarak mümkün olmuştur ³. PCL cerrahisi, bağlı sol karotis arterde (LCA) düşük ve salınımlı kan akımı durumunu veya d-akışını indükler. Buna karşılık, kontralateral sağ karotis arter (RCA) stabil laminer akışla (s-flow) yüzleşmeye devam eder. Önceden, d-akışının endotel hücreleri üzerindeki etkisini anlamak için, karotis arterler kısmi ligasyon ameliyatından sonra diseke edildi ve endotelyal olarak zenginleştirilmiş "havuzlanmış yığın" RNA'ları veya DNA'ları sağlayan bir fenol ve guanidin izotiyosiyanat bazlı lize edici ajan (luminal RNA / DNA yıkama yöntemi)^2,4 ile yıkandı. Bu havuzlanmış toplu RNA'lar veya DNA'lar daha sonra sırasıyla^{transkriptomik} çalışmalar veya epigenomik DNA metilom çalışmaları için işlendi, sırasıyla ^4,5,6. Bu çalışmalar, endotel biyolojisi ve aterosklerozdaki rolleri kapsamlı bir şekilde araştırılan çoklu akışa duyarlı genlerin ve mikroRNA'ların keşfedilmesine yardımcı oldu ^4,6,7.

Bununla birlikte, endotel zenginleştirmesine rağmen, bu toplu RNA / DNA çalışmaları, d-flow kaynaklı aterosklerozda arter duvarındaki her hücre tipinin spesifik rolünü ayırt edememiştir. Bu sınırlılığın üstesinden gelmek için endotelyal zenginleştirilmiş tek hücreli (sc) izolasyon ve scRNA ve scATAC dizileme çalışmaları^{yapılmıştır 8}. Bunun için, C57Bl6 fareleri, s-akışına maruz kalan RCA'yı kontrol olarak kullanırken LCA'da d-akışını indüklemek için PCL ameliyatına tabi tutuldu. PCL ameliyatından iki gün veya iki hafta sonra, fareler kurban edildi ve karotidler diseke edildi ve temizlendi. Hem LCA'ların hem de RCA'ların lümenleri kollajenaz ile aşılandı ve önemli bir fraksiyon olarak ECs içeren luminal kollajenaz sindirimi ve diğer arteriyel hücreler toplandı. Tek hücreli süspansiyon (scRNAseq) veya tek çekirdekli süspansiyon (scATACseq), 10x Genomik kurulum kullanılarak her hücre veya çekirdek için benzersiz tanımlayıcılarla hazırlandı ve barkodlandı. RNA'lar cDNA kütüphanesi hazırlığına tabi tutuldu ve sıralandı.

scRNAseq ve scATACseq veri kümeleri, Cell Ranger Tek Hücreli Yazılım kullanılarak işlendi ve ayrıca Seurat ve Signac R paketleri ^9,10 tarafından analiz edildi. Her hücreye ve çekirdeğe bu analizlerden bir hücre tipi atandı ve işaretleyici genlere ve benzersiz gen ekspresyon modellerine dayanarak hücre tipine kümelendi. ScRNAseq ve scATACseq'in sonuçları, bu tek hücreli preparatların ECs ile zenginleştirildiğini ve ayrıca düz kas hücreleri (SMC'ler), fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri içerdiğini göstermiştir.

Daha ileri analizler, luminal sindirimdeki EC popülasyonunun oldukça farklı ve plastik (8 farklı EC kümesi) olduğunu ve kan akışına duyarlı olduğunu ortaya koymuştur. En önemlisi, bu sonuçlar d-flow'un ECs'leri athero korumalı bir anti-enflamatuar fenotipten, pro-enflamatuar, endotelyal-mezenkimal geçiş, endotel kök / progenitör hücre geçişi ve en şaşırtıcı şekilde, endotelyal-bağışıklık hücresi benzeri geçiş dahil olmak üzere pro-aterojenik fenotiplere yeniden programladığını göstermiştir. Ek olarak, scATACseq verileri, birkaç yeni hipotezin temelini oluşturan genom çapında yeni akışa bağlı kromatin erişilebilirlik değişikliklerini ve transkripsiyon faktörü bağlanma bölgelerini ortaya koymaktadır. Fare karotis arterlerinden tek hücreli multi-omik çalışmalar için tek endotel hücrelerinin hazırlanmasına yönelik metodoloji ve protokol aşağıda detaylandırılmıştır.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hiperkolesterolemik olmayan, yaş ve cinsiyete uygun C57BL / 6 fareleri, cinsiyete bağlı varyasyonu hafifletmek ve hiperkolesterolemik durumların herhangi bir komplikasyonunu dengelemek için kullanıldı.

1. Parsiyel karotis ligasyonu (PCL) cerrahisi

NOT: LCA'nın parsiyel karotis arter ligasyonu daha önce tarif edildiği ve gösterildiği gibi^{gerçekleştirilmiştir 3}.

1. Anestezik buharlaştırıcı kullanarak işlem boyunca fareyi izofluran inhalasyonu (indüksiyon için oksijende% 5 izofloran ve bakım için% 1.5) ile anestezik hale getirin. Ameliyat sırasında vücut ısısı kaybını önlemek için fare sırtüstü yatağını Deltafaze izotermal ped üzerine yerleştirin.
2. Maruz kalma keratiti önlemek için bir oküler merhem uygulayın ve ayak parmağı sıkışma yanıtının yokluğunda anestezi derinliğini onaylayın.
3. Ağrıyı önleyici olarak yönetmek için deri altından 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin. Epilasyonlu bölgeyi betadin ve izopropanol çözeltisi ile üç kez uygulayarak ve temizleyerek dezenfekte edin. Betadinin, ameliyat alanını sterilize etmek için merkezden başlayarak ve yanlarda bitirerek son adım olduğundan emin olun.
4. Aseptik teknikler kullanarak, boyun bölgesinde ventral orta hat insizyonu (~ 1 cm) yapın ve künt diseksiyon ile LCA dal noktasını ortaya çıkarın.
5. Sol internal karotid, eksternal karotis ve oksipital arterleri 6-0 ipek sütür ile bağlayın; superior tiroid arteri el değmeden bırakın.
6. Cilde yaklaşın ve insizyonu doku yapıştırıcısı ve / veya dikişlerle kapatın.
7. Fareyi önceden ısıtılmış bir kurtarma kafesine (37 ° C'de tutulur) aktarın ve ameliyat sonrası hipotermiyi önlemek için 1 saate kadar temiz bir havluya yerleştirin.
   NOT: Deneyimlerimize göre, önleyici tek doz Buprenorfin (0.05 mg / kg) genellikle ameliyat sonrası ağrı yönetimi için yeterlidir. Hayvan ilk 24 saatten sonra sıkıntıdaysa tekrarlanan bir Buprenorfin dozu uygulanabilir. Doğru yapılırsa, bu prosedürle ilişkili ölüm oranı yoktur ve fareye postoperatif stres minimumdur. Fareler kendi kafeslerine geri gönderilir ve ameliyattan sonra günlük olarak izlenir.
8. Perfüzyon kurulumunu hazırlayın.
   1. IV torbada 10 U/mL heparin içeren %0,9 NaCl (normal salin) kullanın. IV torbasını yerden 244-274 cm (8-9 feet) veya diseksiyon tahtasından yaklaşık 122-152 cm (4-5 feet) daha yükseğe bağlayın. Kelebek iğnesini tuzlu su hattının sonuna takın ve hava kabarcıklarını IV hattından temizleyin.

2. Fedakarlık sonrası karotis arterlerin izolasyonu

1. Kurumsal IACUC protokolünü takiben fareleri CO₂ inhalasyonu ile feda edin.
2. Fare derisine% 70 etanol püskürtün ve adsorban kağıt havlu içeren diseksiyon panosu üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Farenin pençelerini, yapışkan bant veya 21 G'lik bir iğne kullanarak diseksiyon panosundaki adsorban havlulara sabitleyin.
3. Bir çift steril makas kullanarak, farenin derisini karından başlayarak ve göğüs kafesinin tepesine kadar çıkarın.
4. Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını künt diseksiyonla açmak için bir çift makas kullanın.
5. Makası kullanarak, diyaframın uzunluğu boyunca dikkatlice bir kesi yapın ve sternum kaldırılana kadar toraksın her iki tarafındaki kaburgalardan devam edin. Sternumu bir çift forseps ile yavaşça kaldırın; Bundan sonra, kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini çıkarın.
6. Büyük damarları görselleştirmek için timüs ve kalp üzerindeki herhangi bir bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.
7. Kanın kapalı dolaşımdan çıkmasına izin vermek için vena kavayı makasla kesin.
8. Kalbin tepesinden IV hattına bağlı 21 G kelebek iğneyi sol ventriküle yerleştirin ve oda sıcaklığında normal salin ile 2-3 dakika boyunca retrograd perfüzyona izin verin. Tuzlu su torbasını yerden 8-9 fit yükseklikte tutarak normal salinin sabit bir akış hızının korunduğundan emin olun.
   NOT: Akciğerler ve karaciğer soluklaşır, bu da optimal perfüzyonu gösterir. Her fare için yaklaşık 20 mL perfüzyon tamponu kullanılır.
9. Cildi boyun bölgesinden çıkarın ve karotis arterleri açığa çıkarmak için tüm yağ, kas ve bağ dokularını çıkarın (Şekil 1A).
   NOT: İşlemin geri kalanı diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilir.
10. Ligasyon alanlarını bulmak için görüş alanını ayarlayın. 10 mm'lik mikro diseksiyon makaslarını kullanarak, perfüzyona izin vermek için LCA'daki ligasyon bölgesinin altında küçük bir kesi yapın.
11. Sol ventrikül üzerinden 1 dakika daha perfüze edin ve LCA'nın iyi perfüze edildiğinden ve görünür kan izlerinden arındırıldığından emin olun.
12. Karotis vücuda bağlıyken karotidleri çevreleyen peri-adventitial dokuları dikkatlice çıkarmak için ince uçlu forseps ve küçük yaylı makas kullanın.
    NOT: Bu temizleme adımı sırasında karotis arterleri sıkmamaya veya germemeye son derece dikkat edin, çünkü bu canlı olmayan hücrelerin sayısını artırabilir. Doğru yapılırsa, son hücre süspansiyonundaki hücre canlılığı genellikle% >93'tür.

3. Farelerin karotidlerinden endotel hücre bakımından zenginleştirilmiş tek hücreli izolasyon

NOT: Aşağıda tarif edilen reaktifler önceden hazırlanabilir ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir: Tablo 1'de listelenen reaktiflerle birlikte 1x ve 0.1x tek çekirdekli lizis tamponları; Tablo 1'de listelenen reaktiflerle tek çekirdekli yıkama tamponu; Tablo 1'de listelenen reaktiflerle tek çekirdekli Çekirdek Tampon tarifi. Bu tamponların çalışma stokları üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlanmalıdır. Sindirim tamponu bileşimi: %0.5 fetal sığır serumu (FBS) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kollajenaz Tip II 600 U/mL ve DNaz I 60 U/mL.

1. Karotidler hala bağlıyken, kan izlerini temizlemek için karotis arterlerin dışını normal salin çözeltisi ile yıkayın.
2. 29 G'lık bir iğne ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanarak, sindirim tamponunun ~ 50 μL'sini sol karotis arterin distal ucunun lümenine enjekte edin. Sindirim tamponu karotis arteri doldurmaya başladığında, karotisin proksimal ucunu bir mikro klipsle sıkıştırın (Şekil 1B). Lümenin içine ilave 15-20 μL sindirim tamponu ekleyin ve sindirim tamponunun salınmasını önlemek için distal ucu klipsleyin.
3. Karotis arterleri fareden dikkatlice çıkarın (Şekil 1B, C) ve bunları ılık (37 ° C'de) Hepes tamponlu salin çözeltisi içeren 35 mm'lik kaplara yerleştirin.
   NOT: Her iki kelepçenin de sağlam bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Kelepçe gevşerse, sindirim çözeltisi lümenden sızabilir ve elde edilen hücre sayısını etkileyebilir. Bu durumda, karotisin açık ucundan 29 G'lık bir iğne ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanarak ek enzimatik çözelti ekleyin ve kelepçeyi tekrar sabitleyin (Şekil 1D). Enzim tampon çözeltisi tekrar sızarsa, ekzotidin ekplantasyon işlemi sırasında kopması muhtemeldir. Bu durumda, karotidi atın ve numuneyi çalışmadan çıkarın. Karotisin tekrarlanan kaba kullanımı, hücre canlılığını ve tek hücreli preparatın kalitesini azaltacaktır. Sol ve sağ karotis arterleri tanımlamaya ve doğru şekilde etiketlemeye özen gösterin.
4. Ekilen karotidleri aralıklı sallanma ile 37 ° C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.

4. Karotis arterlerin yıkanması

1. Luminal enzimatik sindirimi tamamladıktan sonra, karotis arteri kelepçelerle birlikte 35 mm'lik çanaktan çıkarın. Sindirim tamponunun sızmamasına dikkat ederek her kelepçeyi dikkatlice çıkarın.
2. Karotis arterin bir ucunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün üstünde ince forseps ile yavaşça tutun. 100 μL sıcak sindirim tamponu (37 °C) içeren bir insülin şırıngası ile donatılmış 29 G'lık bir iğneyi diğer elinizle lümene yerleştirin (Şekil 1D).
3. Karotisin lümenini mikrosantrifüj tüpüne hızla yıkayın. 1,5 mL tüpe 0,3 mL FBS ekleyerek enzimatik reaksiyonu engelleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Kızarma, luminal enzimatik sindirimden gelen hücreleri içerir. FBS eklemek ve sıcaklığı düşürmek enzimatik sindirim işlemini durdurur. Preparattaki hücre sayısı yüksekse ve döküntü veya yağ dokusu içeriyorsa, istenmeyen doku kalıntılarını filtrelemek için 50 veya 70 μm hücre süzgeci kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Tek hücreli sayımı arttırmak için, birden fazla karotidin yıkanması önerilir. Burada, en az 5.000 hücre elde etmek için, 10-12 karotit yıkandı ve bir örnek olarak toplandı.
4. Sabit açılı rotorla donatılmış bir santrifüj kullanarak hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
5. Süpernatantı atın ve tüm hücreleri tek hücrelere ayırmak için hücre ayrışma reaktifini içeren sindirim tamponunda hücre peletini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de 5 dakika boyunca yeniden askıya alın.
   NOT: Preparattaki hücre sayısı düşükse, hücreleri döndürmek için santrifüj hızını 2.000-3.000 × g'a kadar artırın. Ayrıca, 0,5 mL santrifüj tüplerinin kullanılması, tüpün altındaki hücre peletinin daha iyi görselleştirilmesini kolaylaştırır.
6. 0,5 mL tüpe 0,15 mL FBS ekleyerek enzimatik reaksiyonu engelleyin.
7. Tek hücreli süspansiyonu, adım 4.4'te olduğu gibi sabit açılı rotorla donatılmış bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın.
8. Süpernatantı atın ve hücreleri 0.2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde PBS'de 100 μL buz soğuk% 1 sığır serum albümini (BSA) çözeltisinde yeniden askıya alın.
   NOT: 0,2 mL santrifüj tüplerinin kullanılması, tüpün altındaki tek hücreli peletin görselleştirilmesini artırır.

5. Tek hücreli ve tek çekirdekli analizler

1. scRNAseq için tek hücreli hazırlığı yeniden askıya alın ve gönderin.
   1. Tek hücreli peleti, 0,2 mL'lik bir tüp içinde PBS'de 100 μL buz soğuk% 1 BSA ile yeniden askıya alın.
   2. Hücreleri tek hücreli kapsülleme için yeniden askıya aldıktan sonra, hemen mikroakışkanlar tabanlı tek hücreli bölümleme ve barkodlama sistemi kullanarak tek hücreli kapsülleme ve barkodlama için devam edin (bkz.
   3. Örnekleri Genomik Çekirdeğine göndermeden önce, tek hücreli preparatları sayın ve inceleyin; hücre agregalarının olmamasını sağlamak.
      NOT: Tek hücrelerin toplanması, BSA miktarının% 2'ye kadar arttırılmasıyla daha da aza indirilebilir.
2. scATACseq için tek hücreli hazırlığı yeniden askıya alın ve gönderin.
   1. Hücre peletini buz gibi soğuk 1x PBS'de %0,04 BSA'lık 100 μL'de yeniden askıya alın ve tek hücreli süspansiyonu 4 °C'de 500 × g'de santrifüj edin.
   2. Tek hücreli süspansiyonu buz gibi soğuk 0.1x lizis tamponu ile lize edin (Tablo 1) ve buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   3. Lisatı bir P-20 pipetle 10 kez karıştırın ve 10 dakika daha kuluçkaya yatırın.
   4. Lize edilmiş hücrelere 500 μL soğutulmuş yıkama tamponu (Tablo 1) ekleyin ve pipet kullanarak 5 kez karıştırın.
      NOT: Hücre süspansiyonundaki kalıntıları filtrelemek ve bunları 2 mL'lik bir tüpe aktarmak için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın.
   5. Lisatı 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve çekirdek-peleti seyreltilmiş çekirdek tamponunda (150 μL) yeniden askıya alın (Malzeme Tablosu ve Tablo 1'e bakınız). Bir hemositometre¹¹ kullanarak tek çekirdekli preparatları sayın ve inceleyin.
   6. Tek çekirdekli transpozisyon, çekirdek bölümleme, kütüphane hazırlama ve dizileme için tek çekirdekli örneği Genomik Çekirdek'e gönderin.
      NOT: İlk hücre sayısı düşükse, çekirdekler boyunca enkaz gözlemlemek yaygındır. Bu nedenle, yüksek bir hücre numarası ile başlamanız önerilir.

Sonuçlar

Parsiyel karotis ligasyon ameliyatları 44 fareye uygulandı ve parsiyel ligasyon cerrahisinden bir gün sonra ultrasonografi yapılarak LCA'da d-akımının başlangıcı doğrulandı. Başarılı kısmi ligasyon cerrahisi, kan akış hızının azalmasına neden olur ve LCA^3'teki kan akışını (bozulmuş akış) tersine çevirir. Karotis arterler ligasyondan iki gün sonra veya iki hafta sonra diseke edildi. Her karotidin lümeni kollajenaz sindirimine tabi tutuldu ve endotelyal zengi...

Tartışmalar

Bu yazıda, tek hücreli preparatları fare karotis arterlerinden izole etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. D-flow'un endotel hücreleri üzerindeki etkisi, PCL cerrahisi doğru bir şekilde gerçekleştirilirse doğru bir şekilde incelenebilir. Dış karotid, internal karotid, oksipital arter ve superior tiroid arter gibi ortak karotidin dallarını doğru bir şekilde tanımlamak çok önemlidir. Ultrasonografi ile akış paternlerinin doğrulanması, d-flow koşullarının başarı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac