优化的骨采样方案，用于从考古遗迹中提取古代DNA

摘要

该协议提出了一系列最佳实践协议，用于从八个推荐的解剖采样位置（给定骨骼元素上的特定位置）收集骨粉，这些骨粉来自中世纪个体的五个不同骨骼元素（放射性碳可追溯到大约公元 1040-1400 年，校准的 2 西格玛范围）。

摘要

这里介绍的方法旨在最大限度地提高从古代考古遗迹中恢复人类DNA的机会，同时限制输入样本材料。这是通过靶向先前确定的解剖采样位置来完成的，该位置在骨骼DNA回收率的比较分析中产生了最大量的古代DNA（aDNA）。先前的研究表明，这些协议最大限度地提高了从考古遗迹中成功恢复古代人类和病原体DNA的机会。此前，Parker 等人于 2020 年在一项广泛的调查中评估了 DNA 产量，该调查来自从中世纪（放射性碳可追溯到大约（约公元 1040-1400 年，校准的 2 西格玛范围）墓地的 11 个人的多种骨骼元素的 aDNA 保存情况德国佩森附近一个废弃的中世纪定居点。这八个采样点跨越五个骨骼元素（pars petrosa，恒磨牙，胸椎，远端指骨和距骨），成功地产生了高质量的古代人类DNA，其中产量明显高于所有元素和个体的总体平均值。产量足以用于最常见的下游群体遗传分析。我们的研究结果支持优先使用这些解剖采样位置进行大多数涉及考古遗迹中古代人类DNA分析的研究。实施这些方法将有助于最大限度地减少珍贵考古标本的破坏。

引言

为DNA恢复和分析目的对古代人类遗骸进行采样本质上具有破坏性¹，²，^3，4。样品本身是珍贵的标本，应尽可能保存形态。因此，必须优化取样做法，以避免对不可替代材料进行不必要的破坏，并最大限度地提高成功的可能性。目前的最佳实践技术基于一小部分研究，仅限于法医调查⁵，⁶，对古代标本的研究，其中最佳采样的发展不是研究^的直接目标7^，或利用非^人类遗骸8或针对非常小的解剖采样位置的专门研究（此处用于表示骨骼元素的特定区域，骨粉来自， 用于下游DNA分析，生成）^9，10。这里介绍的采样方案在第一次大规模系统研究中优化了来自多个个体的多个骨骼元素的DNA保存¹¹。所有样本均来自从德国萨克森–安哈尔特州佩森附近废弃的中世纪定居点克拉考尔贝格（Krakauer Berg）的教堂墓地挖掘出的11个人的骨骼元素（详细的样本人口统计数据见表1），因此，可能需要修改以用于此地理/时间范围之外的样本。

个人	性	估计死亡年龄	14C 日期 （CE， Cal 2-sigma）
KRA001	雄	25-35	1058-1219
克拉002	女性	20-22	1227-1283
克拉003	雄	25	1059-1223
克拉004	雄	15	1284-1392
克拉005	雄	10-12	1170-1258
KRA006	女性	30-40	1218-1266
克拉007	女性	25-30	1167-1251
克拉008	雄	20	1301-1402
克拉009	雄	未知	1158-1254
KRA010	雄	25	1276-1383
克拉011	女性	30-45	1040-1159

表1:所有11个采样个体的遗传决定性别，考古确定的估计死亡年龄和放射性碳测年（¹⁴C Cal 2-sigma）。本表改编自帕克等人，2020¹¹。

这些协议允许从五个骨骼元件（包括pars petrosa）的八个解剖采样位置相对直接和有效地生成骨粉，并且实验室诱导的DNA污染有限。在这五个骨骼元素中，在四个骨骼元素上发现的七个解剖采样位置已被确定为岩金字塔破坏性采样的可行替代方案^11，12。这些包括恒磨牙的牙骨质、牙本质和牙髓室;从上椎体切口以及胸椎体收集的皮质骨;皮质骨起源于远端指骨顶端簇和轴的下表面;以及沿塔利外部的致密皮质骨。虽然有几种广泛使用的方法用于对 pars petrosa⁴、¹²、¹³、¹⁴、牙本质和牙髓室^1、2、15 进行取样，但已发表的描述从牙骨质成功生成骨粉的方法¹⁶、椎体、下椎体切迹和距骨可能难以获得。因此，我们在这里演示了岩金字塔的优化采样协议（步骤3.1）;成人磨牙牙的牙骨质（步骤3.2.1）、牙本质（步骤3.2.2）和牙髓（步骤3.2.3）;椎体皮质骨（步骤3.3.1）和上椎弓（步骤3.3.2）;远端指骨（步骤3.4）;和距骨（步骤3.5），以便更广泛地将这些骨骼元件有效地用于aDNA和法医研究。

研究方案

本文介绍的所有研究均按照德国耶拿马克斯普朗克人类历史科学研究所制定的古代人类遗骸指南进行。在执行本协议的任何步骤之前，请确保遵守与获得科学研究许可和使用人类遗骸在您所在地区进行破坏性采样有关的所有地方/州/联邦道德要求。所有程序/化学品储存应根据个别机构的安全指南进行。

1. 样品处理前的注意事项

1. 小心对待样本，因为古代遗骸是一种不可复制和有限的资源（例如，取样应尽可能减少浪费，如果可能的话，所有遗骸都应归还给各自的合法提供者）。
2. 在洁净室环境中执行所有步骤，最好是在专用的古代DNA设施¹⁷，^18，19。使用个人防护装备（PPE），包括带头罩的无菌微孔工作服，无菌手套（两副），外科口罩，防护眼镜和无菌靴或带无菌盖的防滑鞋（见材料表）。经常更换手套，尤其是在样品之间。
3. 尽可能使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线照射（波长:254 nm）（例如钻头、钻头、虎钳/夹具等）彻底清洁和消毒所有设备和表面。最后，强烈建议定期进行符合人体工程学的休息（如果可能，每 2-3 小时一次），以避免由于洁净室环境而导致过度疲惫。
   注意:在取样之前，所有骨骼遗骸都应适当记录（例如，拍照，称重，如果可能，显微CT扫描，3D成像等）（本手稿未涵盖适当记录的方案）。所有采样方案都可以在采样迭代之间暂停，样品可以无限期地储存在干燥、温度受控（25°C）的无菌环境中。

2. 预处理

1. 在骨粉生成之前对所有解剖采样位置进行净化，以最大程度地降低污染风险¹⁸.
   注意:漂白剂和/或表面去除（有关表面去除步骤，请参见步骤3.3.2中的注释）对样品净化的有效性仍然是aDNA^{研究人员争论}的问题8，¹⁹，²⁰，21，²²，²³，²⁴，²⁵，因为两者都可能影响整体DNA产量^，特别是在高度降解的样品中。因此，以下步骤被认为是可选的，并包含在此处，因为它们已用于所有样本中以生成本文中介绍的代表性结果。建议根据每个样品组的分子应用、年龄、稀有性和形态降解水平逐案确定这些预处理方案的使用。
   1. 在配备紫外线的聚合酶链反应（PCR）罩或关闭气流的生物安全柜下的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。
   2. 在处理箔片之前，确保所有骨头碎片都已恢复（用于遣返）。在每个骨骼元件的处理之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
   3. 用不起毛的干燥无菌湿巾轻轻擦拭该区域，从解剖取样位置尽可能多地去除松散的污垢/碎屑（见 材料表）。将湿巾丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
   4. 用蘸有稀释商业漂白剂（~0.01% v / v，用超纯DNase / RNase无水稀释）的无菌擦拭擦拭来净化清洁的表面，并孵育5分钟。将湿巾丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
      注意:漂白剂是一种高腐蚀性和反应性化学物质;因此，在使用前应采取适当的安全预防措施。
   5. 用用超纯脱氧核糖核酸酶/无核糖核酸酶的水润湿的无菌擦拭布从解剖取样位置尽可能多地去除残留的漂白剂。将湿巾丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。
   6. 将所有清洁的解剖采样位置暴露在紫外线辐射下30分钟（波长:254nm），然后在室温下完全干燥。在进行取样或返回储存之前，确保解剖取样位置完全干燥，不仅使骨粉生成更容易，而且防止样本（例如霉菌）进一步降解。
      注意:暴露于紫外线辐射可能对眼睛有害。
   7. 立即在干燥、温度受控（25°C）的无菌环境中取样或储存骨骼元件。

3. 骨粉生成

注意:以下协议旨在用于Dabney等人2019年协议²⁶之后的DNA提取。

1. 抽样 pars petrosa
   注意:本协议改编自Pinhasi等人2019中描述的程序⁴ 为了便于使用，此处提供。该协议不代表当前用于采样的破坏性最小的方法 pars petrosa.因此，建议使用 Sirak 等人描述的协议。 2017¹³ 或奥法努等人 2020¹⁴ 适用于形态保存最为重要的样品。
   1. 在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长:254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。
   2. 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
   3. 使用无菌夹子或虎钳固定干燥、去污的元件。
   4. 使用配备0.6毫米刀片的标准珠宝商锯（见材料表）以中速将石沟沿上岩沟切成两半（见图1），以避免过热（见步骤3.1.6下面的注释）。
      注意: 石油油非常 密集，因此可能难以切割。注意保持元件牢固夹紧，以免受伤。将任何破损的锯片丢弃在适当的锐器容器中。
   5. 从夹子上取下岩质部分。恢复并保存任何松散/多余的材料。
   6. 将秤纸放入无菌称量舟中
   7. 将岩质部分放在秤纸上，切面朝称量托盘倾斜。使用配备小规格钻头的牙钻入面管和乳突窦之间的致密皮质骨（看起来比周围材料更有光泽，见图1），并设置为中速，中等扭矩以产生骨粉。
      注意:钻孔/切割应在中低速下短时间内完成，以避免骨骼过热并可能破坏/破坏DNA。有趣的是，当岩的致密部分开始过热时，可能会观察到一种被称为烹饪培根的气味。立即停止钻孔/锯切，让骨头休息，直到足够冷却后再恢复。
   8. 重复钻孔，直到在称量纸中收集约50-100 mg粉末，使用精确到至少0.01 mg的封闭天平测量（参见 材料表）。
      注意:在可能的情况下，建议收集100毫克骨粉，以便进行两次重复DNA提取，每次50毫克。然而，基于解剖取样位置本身的限制（例如，远端指骨、牙髓室）或形态学保存的需要，这可能并不总是可行的。对于其他位置，例如牙骨质，可用的材料可能远少于50毫克。然而，牙骨质、牙髓室和远端指骨都被证明会产生显着的内源性 DNA¹¹，²⁷，^28，尽管提取过程中骨粉的初始输入较低。
   9. 将粉末从称量纸转移到 2 mL 标记的低结合安全锁定管中进行提取或储存。无限期地将样品储存在-20°C。
   10. 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到可以完成返回/遣返。
   11. 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 净化溶液/乙醇和紫外线（波长:254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。

图1:颞骨，包括 岩部。 （A）显示岩金字塔和 岩沟 位置的样品预切割。（B）岩石部分后切突出要钻探的密集区域。 请点击此处查看此图的大图。

2. 恒磨牙取样
   注意:对于恒磨牙的采样，请预先选择 in situ 臼齿具有融合的根部，理想情况下没有龋齿、牙釉质裂缝或过度磨损以获得最佳效果。取出任何牙结石取样并储存在-20°C，以便将来可能对口腔微生物组进行分析（此处未涵盖的程序）。
   1. 牙骨质取样
      1. 在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长:254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。
      2. 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
      3. 将一张秤纸放入无菌称量托盘中。
      4. 使用手持夹具（如可调节扳手）将去污的磨牙根向下固定在称重托盘上（见 材料表）。
      5. 为牙钻配备金刚石边圆形切割轮。将钻头设置为中等速度/扭矩设置后，以大约 -20° 的角度将钻头边缘轻轻接触根部。
      6. 向下刮入托盘中，从根部（牙骨质）中去除/收集黄色的最外层材料。当牙本质的较浅（白色）材料变得可见时停止收集。
         注意: 重要的是使切割钻头相对于收集盘的旋转方向相匹配，以避免粉末雾化并可能因完全错过托盘而浪费样品。牙骨质的DNA特别丰富;然而，材料的典型产量远小于其他解剖采样位置（~7-20 mg）¹¹，^27，28。
      7. 使用精确到至少0.01 mg的封闭天平记录在秤纸中收集的粉末质量（参见 材料表）。
      8. 将粉末从称量纸转移到 2 mL 低粘合安全锁管中进行提取。无限期储存在-20°C。
   2. 纸浆室取样
      1. 收集牙骨质后（如果需要），使用珠宝商的锯将磨牙沿水泥-牙釉质连接处切片以去除牙冠（见 图 2）。
      2. 将一张新秤纸放入新的称量托盘中。
      3. 将冠部固定在手持式夹具或虎钳中，固定在称量托盘上。保持切割面向下倾斜，并用配备小规格钻头的牙钻（见材料表）沿着牙冠部分内的纸浆室边缘钻孔/刮擦 材料（见 图2）。
         注意:只有牙髓室内部的第一道将被收集并标记为牙髓材料（5-15毫克典型产量），任何深入牙齿的东西都被认为是牙本质。
      4. 将牙齿向下转动，用锤子敲击夹子，然后将释放的粉末收集在秤纸上。
      5. 使用精确到至少0.01 mg的随附天平记录在秤纸中收集的粉末的重量（参见 材料表）。
      6. 将粉末从称量纸转移到 2 mL 低结合安全锁管中进行提取。无限期储存在-20°C。
   3. 牙本质取样
      1. 将一张新秤纸放入新的称量托盘中。
      2. 将冠部放在称量托盘上（按照步骤3.2.2.3），钻出并进一步收集50-100毫克的牙本质，使用精确到0.01毫克的封闭天平以同样的方式从纸浆室内部测量（见材料 表），以进行进一步的牙本质采样（见 图2）。
      3. 将骨粉从秤纸转移到 2 mL 低结合安全锁定管中进行提取。无限期储存在-20°C。
      4. 将剩余的牙片/多余的粉末存放在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到可以完成返回/遣返。
      5. 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线（波长:254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。

图 2:永久性 磨牙预采样。 （A）取样前预处理的磨牙，显示牙冠，牙骨质（根部的淡黄色层）和水泥-牙釉质连接处的切割部位。（B）相同的牙骨质后臼齿集合，显示水泥-牙釉质连接处的切割部位。（C） 磨牙切割后和取样，显示牙髓室和牙冠内牙本质的解剖取样位置。 请点击此处查看此图的大图。

3. 胸椎取样
   1. 椎体取样
      1. 在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长:254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。
      2. 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
      3. 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。
      4. 用夹子或手钳固定椎骨，椎体向外。
      5. 将椎骨放在称重托盘上，椎体向下倾斜。使用配备有设置为低速高扭矩的小规格钻头（见 材料表）的牙钻，沿着椎体松质内组织周围的皮质骨的最外缘（下缘和上缘）钻孔（见 图3）。
      6. 在标准配重托盘上刮擦皮质层，直到收集到50-100 mg的材料，使用精确到0.01 mg的封闭天平测量（参见 材料表）。
      7. 将骨粉从称量纸转移到 2 mL 低结合安全锁管中进行提取。无限期储存在-20°C。
   2. 上椎弓取样
      注意:此步骤是可选的。使用配备有小规格钻头的牙钻（见 材料表）沿表面刮擦，去除并丢弃上椎弓皮质骨的最外层¹⁹。不建议从椎体取样，因为皮质骨层通常非常薄，并且可能在此过程中完全耗尽（见第2节中的注释）。
      1. 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。
      2. 将椎骨固定在手夹/虎钳中，椎突向外，上侧向下。
      3. 在保持椎骨的同时，上侧向下，在称重托盘上，使用具有小规格钻头（见材料表）设置为低速和高扭矩的牙钻，向上钻入由棘突与薄片融合形成的 V 形凹口的中心（见图 3）。
      4. 当阻力明显下降时停止钻孔。稍微改变钻孔位置并重复直到收集50-100mg骨粉，使用精确到0.01mg的封闭天平测量（见 材料表）。
      5. 将骨粉从称量纸转移到 2 mL 低结合管中进行提取。无限期储存在-20°C。
      6. 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到返回/遣返。
      7. 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线（波长:254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。

图3:椎体和胸椎的上椎弓皮质骨解剖采样位置。 请点击此处查看此图的大图。

4. 远端指骨取样
   注意:此步骤是可选的。使用配备有小规格钻头的牙钻沿表面刮擦，去除并丢弃轴和/或顶端簇的皮质骨的最外层¹⁹。对于皮质骨或幼年遗骸过薄的样品，这可能是不可能的（见第2节的注）。
   1. 在专用洁净室中，在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（紫外线波长:254 nm）下进行所有采样，并关闭气流。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。
   2. 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
   3. 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。
   4. 将样品固定在手持式夹具/虎钳中，上侧朝上。
   5. 将样品放在称量托盘上，使用配备小规格钻头的牙钻（见材料表）钻穿最外层致密层（见图4），从顶端簇和轴的下侧从皮质骨中收集骨粉。
   6. 当阻力明显降低时停止钻孔，因为这意味着较轻的松质材料。重复此过程，从初始钻孔向外辐射，直到收集至少50-100mg骨粉，使用精确到0.01mg的封闭天平测量（见 材料表）。
   7. 将骨粉从秤纸转移到 2 mL 低结合安全锁定管中进行提取。无限期储存在-20°C。
   8. 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到返回/遣返。
   9. 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线照射（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。
      注意:对于较小的样本（例如，青少年样本），可用于样本的皮质骨可能远少于建议的50-100毫克皮质骨。然而，即使数量很少，这个解剖采样位置也被证明特别富含DNA¹¹。

图 4:远端指骨，显示沿顶端簇轴和下侧的致密皮质骨的位置。 请点击此处查看此图的大图。

5. 距骨取样
   1. 在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长:254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。
   2. 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。
   3. 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。
   4. 将样品固定在手持式夹具/虎钳中，圆顶向上。
   5. 将距骨、圆顶向上和内侧表面朝向收集器，放在称量托盘上。使用低轨钻头（见材料表）设置为低速和高扭矩的牙钻从距骨颈部刮皮质骨至~1毫米的深度（见图5）。
   6. 稍微改变钻孔位置并重复，直到收集大约50-100mg骨粉，使用精确到0.01mg的封闭天平测量（见 材料表）。
   7. 将骨粉从称量纸转移到 2 mL 低结合管中进行提取。无限期储存在-20°C。
   8. 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到可以完成返回/遣返。
   9. 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 净化溶液/乙醇和紫外线（波长:254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。

图 5:用于皮质骨恢复的距骨采样区域。 请点击此处查看此图的大图。

注意:距骨的皮质骨很少（薄的外层）。材料不仅应从表面收集，还应从松质骨的致密层中收集。

结果

在另一项研究¹¹ 中，使用针对钙^{化组织中的}短片段优化的标准 DNA 提取方案，从 11 个人的每个解剖采样位置生成的骨粉中提取 DNA2。然后产生单链文库²⁸，并在HiSeq 4000（75 bp配对端）上测序，每个样品的深度为~20，000，000个读数。然后使用EAGER 管道²⁹（BWA 设置:种子长度为 32，0.1 错配惩罚，映射质量过滤器 37）评估所得序列数据的内源性人类 DNA 含量。所有代表性结果均使用与Parker等人2020¹¹相同的指标报告，以保持一致性。平均而言，来自pars petrosa粉末部分的文库产生的内源性DNA高于所调查的其他23个解剖采样位置中的任何一个（图6A-B）。该协议中提出的七个额外的解剖取样位置（牙骨质，牙髓室的首过和恒磨牙的牙本质;来自椎体和胸椎上椎弓的皮质骨;来自远端指骨顶端簇的皮质骨;和来自距骨颈部的皮质骨）产生次高的产量（这些解剖采样位置之间没有统计学意义;图 6A-B;补充文件1:内源性DNAPreCap）。这些替代位置都一致地产生足以进行标准群体遗传学分析的DNA产量，例如线粒体分析和单核苷酸多态性（SNP）分析。来自所有解剖采样位置的库中的重复率都很低（平均<聚类因子1.2，计算为所有映射读取与唯一映射读取的比率，表2;补充文件1:ClusterFactor），表明所有筛选的库都具有非常高的复杂性。同样<，除上椎弓（平均估计污染:2.11%，一个样本作为异常值移除;KRA005: 19.52%， 见表2;补充文件1:X污染）。从牙髓室和牙本质收集的材料中，平均片段长度（过滤以去除所有读数< 30 bp）最低，其他解剖采样位置之间没有显着差异（分别为55.14 bp和60.22 bp，而平均中位数为62.87，成对p值<0.019，表2;补充文件 1:平均长度）。此外，牙齿和胸椎都包含多个解剖采样位置，观察到高内源性DNA恢复率，使它们特别适合作为石油的替代品。

图6:所有筛选样本的人类DNA含量。 黑线代表总体平均值，而红线代表中位数（实心:人类DNA比例，虚线:每百万次读取生成的映射人类读取）。在所有分析中，平均人类DNA比例高于总体平均值（8.16%）的单个解剖采样位置均被着色。（A）映射到hg19参考基因组的读段比例。蓝色虚线表示给定管道映射参数的理论最大值（使用 Gargammel³¹ 生成，以模拟来自 hg19 参考基因组的 5，000，000 个读数的随机分布，并模拟损伤）。对于平均人类DNA比例高于总体平均值的样本，报告了个体均值（黑色X）和中位数（红色圆圈）。置信区间指示上限和下限，不包括统计异常值。（B）每百万次测序工作（75 bp配对端）映射到hg19参考基因组的唯一读段数。置信区间指示上限和下限，不包括统计异常值。该数字改编自Parker， C. et al. 2020¹¹. 请点击此处查看此图的大图。

表2:所有解剖采样位置的平均重复水平（映射读取/唯一读取），平均和中位数片段长度以及X染色体污染估计值。 误差报告为平均值的标准误差。本表改编自帕克等人，2020¹¹。

取样地点	平均重复因子（# 映射读取 /# 唯一映射读取）	平均片段长度（bp）	X染色体污染的平均估计比例
岩质金字塔	1.188 ± 0.006	65.40 ± 1.36	0.000 ± 0.003
牙骨质	1.197 ± 0.028	67.28 ± 1.76	0.011 ± 0.003
牙本质	1.188 ± 0.061	60.22 ± 2.37	0.002 ± 0.007
纸浆	1.179 ± 0.024	55.14 ± 2.90	0.013 ± 0.006
远端指骨	1.191 ± 0.049	65.95 ± 1.08	0.013 ± 0.005
椎体	1.194 ± 0.037	66.14 ± 1.03	0.008 ± 0.003
上椎弓	1.19 ± 0.017	63.02 ± 1.23	0.021 ± 0.009*
距骨	1.198 ± 0.010	68.20 ± 1.24	0.011 ± 0.003
*样本 KRA005 在 0.1952 处作为异常值删除

代码可用性
分析本手稿时使用的所有分析程序和 R 模块均可从其各自的作者处免费获得。所有自定义 R 代码均可根据要求提供。

数据可用性
用于计算代表性结果的所有原始数据均可在欧洲核苷酸档案ENA数据存储库（入藏号PRJ-EB36983）或Parker，C.等人的补充材料¹¹中免费获得。

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讨论

目前古代人类群体遗传学的做法是尽可能优先从pars petrosa（步骤2.1）中采样。然而，pars petrosa可能是一个难以获得的样本，因为它对于无数的骨骼评估（例如，人口史³²，死亡时胎儿年龄的估计³³和性别确定³⁴）具有很高的价值，并且从历史上看，用于DNA分析的pars petrosa采样可能具有^{高度破坏性3}，⁴（包括此处介绍的方案^， 尽管新的微创协议^13，14现已被广泛采用以缓解这种担忧）。直到最近，还没有尝试对整个骨骼的人类DNA恢复进行大规模，系统的研究¹¹，这使得在岩金字塔不可用时找到适当的采样策略具有挑战性。

这里介绍的方案通过提供一套优化的程序，从考古/法医骨骼遗骸（包括 pars petrosa ）以及四个额外的骨骼元素的七个备用解剖采样位置进行DNA采样，有助于缓解这一挑战。所包含的关键步骤都是为了尽量减少由于采样效率低下（步骤2.1.6和3.2.1.3）或钻孔/切割过程中样品过热（步骤3.1.6）而导致DNA丢失/损伤的可能性。此外，在整个协议中已经指出，可能需要修改/省略预处理步骤，以确保在高度降解的样品中获得最佳性能。还应该指出的是，即使在这里介绍的选定元素中，仍然存在几种可能的替代采样技术（特别是对于 pars petrosa^13，14），并且有足够的空间进一步优化此处介绍的未充分利用的解剖采样位置（即距骨:步骤2.5和椎骨:步骤2.3）。

同样重要的是要记住，这些协议是使用高质量（良好的形态保存）的古代幼年 - 成年遗骸设计和测试的，用于内源性人类DNA分析。所呈现的结果可能不会扩展到更高度降解的材料、其他保存环境、婴儿遗骸、非人类遗骸或病原体或微生物组的研究，因为仍然需要对这些协议在其他环境中的使用进行更多的探索。此外，这里介绍的替代骨骼元素（牙齿、椎骨、远端指骨和塔利）可能难以在混合遗骸中分配给单个个体，需要从多个元素中采样以确保单一来源。尽管存在这些限制，但广泛提供这些方案可以通过提供一个通用的和定量优化的框架来帮助缓解围绕样品选择和处理的一些异质性，用于未来对人类遗骸的广泛aDNA/法医研究。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#16 Dental Drill Bit	NTI	H1-016-HP	example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade	Fisher Scientific	50-949-097	blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	Dremel cutting attachment
Commercial Bleach	Fisher Scientific	NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil	Fisher Scientific	15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool	Dremel	4300	Example drill
Dremel collet and nut kit	Dremel	4485	Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag	Fisher Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Millipore Sigma	1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask	Fisher Scientific	50-206-0397	PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-041-171X	PPE
Fisherbrand Safety Glasses	Fisher Scientific	19-130-208X	PPE
Granger Stationary Vise	Fisher Scientific	NC1336173	benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water	Fisher Scientific	10-977-023
Jewellers Saw	Fisher Scientific	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet	Fisher Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
Medium weighing boat	Heathrow Scientific	HS120223
MSC 10pc plier/clamp set	Fisher Scientific	50-129-5352	Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019	enclosed balance
Tyvek coveralls with hood	Fisher Scientific	01-361-7X	PPE
Weigh paper	Heathrow Scientific	HS120116