Оптимизированные протоколы отбора проб костей для извлечения древней ДНК из археологических останков

Резюме

Протокол представляет собой серию протоколов наилучшей практики для сбора костного порошка из восьми рекомендуемых анатомических мест отбора проб (конкретных мест на данном скелетном элементе) по пяти различным скелетным элементам от средневековых людей (радиоуглерод датируется периодом около 1040-1400 н.э., калиброванный диапазон 2-сигма).

Аннотация

Методы, представленные здесь, направлены на максимизацию шансов на восстановление ДНК человека из древних археологических останков при ограничении входного образца материала. Это было сделано путем нацеливания на анатомические места отбора проб, ранее определенные как дающие наибольшее количество древней ДНК (аДНК) в сравнительном анализе восстановления ДНК по всему скелету. Предыдущие исследования показали, что эти протоколы максимизируют шансы на успешное восстановление древней ДНК человека и патогена из археологических останков. Выход ДНК был ранее оценен Parker et al. 2020 в широком обзоре сохранения аДНК через множественные скелетные элементы у 11 особей, извлеченных из средневекового (радиоуглерод, датируемого периодом около (около) 1040-1400 гг. н.э., калиброванный диапазон 2-сигма) кладбища в Кракауэр-Берге, заброшенном средневековом поселении недалеко от Пейсена, Германия. Эти восемь мест отбора проб, которые охватывают пять скелетных элементов (pars petrosa, постоянные коренные зубы, грудной позвонок, дистальная фаланга и таранный пузырь), успешно дали высококачественную древнюю ДНК человека, где урожайность была значительно выше, чем в среднем по всем элементам и отдельным лицам. Урожайность была достаточной для использования в наиболее распространенных популяционных генетических анализах. Наши результаты подтверждают предпочтительное использование этих анатомических мест отбора проб для большинства исследований, включающих анализ древней ДНК человека из археологических останков. Внедрение этих методов поможет свести к минимуму уничтожение драгоценных археологических образцов.

Введение

Отбор проб древних человеческих останков для целей восстановления и анализа ДНК по своей сути является разрушительным 1,2,3,4. Сами образцы являются ценными образцами, и морфологическая сохранность должна быть сохранена везде, где это возможно. Таким образом, крайне важно, чтобы методы отбора проб были оптимизированы таким образом, чтобы избежать ненужного разрушения незаменимого материала и максимизировать вероятность успеха. Современные методы наилучшей практики основаны на небольшой когорте исследований, ограниченных либо судебно-медицинскими обследованиями ^5,6, исследованиями древних образцов, где разработка оптимального отбора проб не является прямой целью исследования⁷, либо специализированными исследованиями, использующими либо нечеловеческие останки⁸, либо нацеленными на очень небольшую выборку анатомических мест отбора проб (используется здесь для обозначения конкретной области скелетного элемента, из которого происходит костный порошок, для использования в последующих анализах ДНК, был сгенерирован)^9,10. Представленные здесь протоколы отбора проб были оптимизированы в первом крупномасштабном систематическом исследовании сохранения ДНК через несколько скелетных элементов у нескольких лиц¹¹. Все образцы были получены из скелетных элементов, извлеченных у 11 человек, раскопанных на церковном кладбище заброшенного средневекового поселения Кракауэр-Берг недалеко от Пейсена, Саксония-Анхальт, Германия (см. Таблицу 1 для подробной демографии выборки) и, как таковые, могут нуждаться в модификации для использования с образцами за пределами этого географического/временного диапазона.

Индивидуальный	Секс	Предполагаемый возраст на момент смерти	14 См. Даты C (CE, Cal 2-сигма)
КРА001	Мужской	25-35	1058-1219
КРА002	Женский	20-22	1227-1283
КРА003	Мужской	25	1059-1223
КРА004	Мужской	15	1284-1392
КРА005	Мужской	10-12	1170-1258
КРА006	Женский	30-40	1218-1266
КРА007	Женский	25-30	1167-1251
КРА008	Мужской	20	1301-1402
КРА009	Мужской	Неизвестный	1158-1254
КРА010	Мужской	25	1276-1383
КРА011	Женский	30-45	1040-1159

Таблица 1: Генетически детерминированный пол, археологически определенный предполагаемый возраст на момент смерти и радиоуглеродное датирование (¹⁴C Cal 2-сигма) для всех 11 отобранных особей. Эта таблица была адаптирована из Parker, C. et al. 2020¹¹.

Эти протоколы позволяют относительно просто и эффективно генерировать костный порошок из восьми анатомических мест отбора проб по пяти скелетным элементам (включая pars petrosa) с ограниченным лабораторным загрязнением ДНК. Из этих пяти скелетных элементов семь анатомических мест отбора проб, обнаруженных на четырех скелетных элементах, были определены как жизнеспособные альтернативы разрушительному отбору проб пирамиды петроуса^11,12. К ним относятся цементная, дентиновая и пульпозная камеры постоянных моляров; кортикальная кость, собранная из верхней позвоночной выемки, а также из тела грудных позвонков; кортикальная кость, вытекающая из нижней поверхности верхушечного пучка и ствола дистальных фаланг; и плотная кортикальная кость вдоль внешней части тали. Хотя существует несколько широко применяемых методов отбора проб парса петроса ^4,12,13,14, дентина и камеры пульпы зубов ^1,2,15, опубликованы методы, описывающие успешное образование костного порошка из цемента¹⁶ , тело позвонка, нижняя позвоночная выемка и таранная раковина могут быть труднодоступны. Таким образом, здесь мы демонстрируем оптимизированные протоколы выборки для пирамиды петроуса (шаг 3.1); цемент (этап 3.2.1), дентин (этап 3.2.2) и пульпа зубов (этап 3.2.3) коренных зубов взрослых особей; кортикальная кость тела позвонка (стадия 3.3.1) и верхняя позвоночная дуга (стадия 3.3.2); дистальная фаланга (шаг 3.4); и осыпь (этап 3.5), с тем чтобы сделать более доступным эффективное использование этих скелетных элементов как для аДНК, так и для судебно-медицинских исследований.

протокол

Все исследования, представленные здесь, были выполнены в соответствии с руководящими принципами, изложенными Институтом макса Планка по науке о человеческой истории, Йена, Германия для работы с древними человеческими останками. Прежде чем выполнять какие-либо шаги этого протокола, убедитесь, что вы придерживаетесь всех местных / государственных / федеральных этических требований, касающихся как получения разрешения на научное исследование, так и использования человеческих останков для разрушительного отбора проб в вашем районе. Все процедуры/хранение химических веществ должны выполняться в соответствии с индивидуальными институциональными руководящими принципами безопасности.

1. Соображения перед обработкой образца

1. Относитесь к образцам с осторожностью, поскольку древние останки являются непоправимым и ограниченным ресурсом (например, отбор проб должен быть как можно более расточительным, и все останки должны возвращаться их соответствующим и законным поставщикам, если это возможно).
2. Выполните все шаги в условиях чистой комнаты, предпочтительно в специальном древнем объекте ДНК 17,18,19. Используйте средства индивидуальной защиты (СИЗ), состоящие из стерильных микропористых комбинезонов с капюшоном, стерильных перчаток (две пары), хирургической маски, защитных очков и стерильных сапог или нескользящей обуви со стерильными чехлами (см. Таблицу материалов). Часто меняйте перчатки, особенно между образцами.
3. Тщательно очистите и продезинфицируйте все оборудование и поверхности с помощью отбеливателя / раствора для обеззараживания ДНК / этанола и ультрафиолетового облучения (длина волны: 254 нм), где это возможно (например, сверла, сверла, тиски / зажимы и т. Д.). Наконец, настоятельно рекомендуется делать регулярные эргономические перерывы (каждые 2-3 часа, если это возможно), чтобы избежать чрезмерного истощения из-за чистой комнаты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все скелетные останки должны быть надлежащим образом задокументированы (например, сфотографированы, взвешены и, если возможно, отсканированы микро-КТ, 3D-изображения и т. Д.) Перед отбором проб (протоколы для соответствующей документации не рассматриваются в этой рукописи). Все протоколы отбора проб могут быть приостановлены между итерациями отбора проб, и образцы могут храниться неограниченное время в сухой, контролируемой температурой (25 °C) стерильной среде.

2. Предварительная обработка

1. Обеззараживание всех анатомических мест отбора проб до образования костного порошка, чтобы свести к минимуму риск загрязнения¹⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность отбеливателя и/или удаления поверхности (см. ПРИМЕЧАНИЕ на этапе 3.3.2 для этапов поверхностного удаления) для обеззараживания образца все еще является предметом споров среди исследователей аДНК ^{8,19,20,21,22,23,24,25}, поскольку оба могут влиять на общий выход ДНК, особенно в сильно деградированных образцах. Таким образом, следующие шаги считаются необязательными и включены здесь, поскольку они использовались во всех выборках для получения репрезентативных результатов, представленных в настоящем документе. Рекомендуется, чтобы использование этих протоколов предварительной обработки определялось в каждом конкретном случае на основе молекулярного применения, возраста, редкости и уровня морфологической деградации каждого набора образцов.
   1. Выполните все отборы проб в специально отведенном чистом помещении под вытяжкой полимеразной цепной реакции (ПЦР), оснащенной ультрафиолетовым светом, или шкафом биобезопасности с выключенным воздушным потоком. Распределите стерильную алюминиевую фольгу по столу, чтобы поймать любой случайный костный порошок / фрагменты.
   2. Убедитесь, что все фрагменты костей восстановлены (для репатриации), прежде чем утилизировать фольгу. Меняйте фольгу между обработками каждого скелетного элемента. Утилизируйте использованную фольгу в автоклавируемом мешке/сосуде для биологической опасности.
   3. Удалите как можно больше рыхлой грязи / детрита из анатомических мест отбора проб, аккуратно протерев область сухой стерильной салфеткой без ворса (см. Таблицу материалов). Утилизируйте салфетки в автоклавируемые пакеты с биологической опасностью или сосуды.
   4. Обеззаражьте очищенную поверхность протиранием стерильной салфеткой, смоченной разбавленным коммерческим отбеливателем (~0,01% v/v, разбавленной сверхчистой водой без ДНКазы/РНКазы) и дайте инкубировать в течение 5 мин. Утилизируйте салфетки в автоклавируемые пакеты с биологической опасностью или сосуды.
      ВНИМАНИЕ: Отбеливатель является высококоррозионным и реакционноспособным химическим веществом; следовательно, перед его использованием должны быть приняты соответствующие меры предосторожности.
   5. Удалите как можно больше остаточного отбеливателя из анатомического места отбора проб стерильной салфеткой, смоченной ультрачистой водой без ДНКазы/РНКазы. Утилизируйте салфетки в автоклавируемые пакеты с биологической опасностью или сосуды.
   6. Подвергайте все очищенные анатомические места отбора проб ультрафиолетовому излучению в течение 30 мин (длина волны: 254 нм), а затем дайте полностью высохнуть при комнатной температуре. Убедитесь, что анатомические места отбора проб полностью высохли, прежде чем приступать к отбору проб или возвращаться на хранение, чтобы не только облегчить образование костного порошка, но и предотвратить дальнейшую деградацию образца (например, плесень).
      ВНИМАНИЕ: Воздействие ультрафиолетового излучения может быть вредным для глаз.
   7. Немедленно перейдите к отбору проб или храните скелетные элементы в сухой стерильной среде с контролируемой температурой (25 °C).

3. Генерация костного порошка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие протоколы предназначены для использования в экстракции ДНК в соответствии с протоколом²⁶ Dabney et al. 2019.

1. Отбор проб pars petrosa
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из процедур, описанных в Pinhasi et al. 2019⁴ и представлен здесь для удобства использования. Этот протокол не представляет собой текущий, наименее разрушительный метод отбора проб pars petrosa. Таким образом, рекомендуется использовать протокол, описанный Sirak et al. 2017¹³ или Orfanou et al. 2020¹⁴ для образцов, где морфологическая сохранность имеет первостепенное значение.
   1. Выполняйте все отборы проб в специально отведенном чистом помещении под вытяжкой ПЦР, оборудованной ультрафиолетовым светом, или шкафом биобезопасности (длина волны: 254 нм) с выключенным воздушным потоком. Распределите стерильную алюминиевую фольгу по столу, чтобы поймать любой случайный костный порошок / фрагменты.
   2. Убедитесь, что все фрагменты кости и как можно больше порошка извлечены (для репатриации) перед утилизацией фольги. Меняйте фольгу между каждым отбором проб. Утилизируйте использованную фольгу в автоклавируемый биологически опасный мешок/сосуд.
   3. Закрепите сухой, обеззараженный элемент с помощью стерилизованного зажима или тиски.
   4. Разрезайте pars petrosa пополам вдоль верхней борозды petrosus (см. Рисунок 1) с помощью стандартной ювелирной пилы, оснащенной лезвием 0,6 мм (см. Таблицу материалов) на средней скорости, чтобы избежать перегрева (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже, шаг 3.1.6).
      ВНИМАНИЕ: Парс петроса очень плотный, и как таковой может быть трудно разрезать. Позаботьтесь о том, чтобы элемент надежно зажимался, чтобы избежать травм. Утилизируйте все сломанные пильные полотна в соответствующем сосуде.
   5. Снимите петроусные части с зажима. Восстановите и сохраните любой рыхлый / избыточный материал.
   6. Поместите весовую бумагу в стерильную весовую лодку
   7. Держите петроусную часть над бумагой для взвешивания, разрезанной стороной, наклоненной к лотку для взвешивания. Просверлите в плотную кортикальную кость между лицевым каналом и сосцевидным антром (кажется более блестящим, чем окружающий материал, см. Рисунок 1) с помощью зубной дрели, оснащенной небольшим калибровочным долотом (см. Таблица материалов) и установленной на среднюю скорость, средний крутящий момент для получения костного порошка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сверление/резка должна выполняться короткими очередями на низких и средних скоростях, чтобы избежать перегрева кости и потенциального разрушения/повреждения ДНК. Как ни странно, когда плотная часть петроуса начинает перегреваться, может наблюдаться запах, описанный как приготовление бекона. Немедленно прекратите сверление / распиловку и дайте кости отдохнуть до достаточного охлаждения перед возобновлением.
   8. Повторное сверление до тех пор, пока в весовой бумаге не будет собрано примерно 50-100 мг порошка, измеренного с использованием закрытых весов с точностью не менее 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там, где это возможно, предлагается собрать 100 мг костного порошка, чтобы обеспечить две реплицированные экстракции ДНК по 50 мг каждая. Однако это не всегда может быть возможно, основываясь либо на ограничении самих анатомических мест отбора проб (например, дистальная фаланга, камера пульпы зуба), либо на необходимости морфологического сохранения. Для других мест, таких как цемент, может быть доступно значительно менее 50 мг материала. Тем не менее, было показано, что цемент, камера пульпы зуба и дистальная фаланга дают значительную эндогенную ДНК 11,27,28, несмотря на более низкий первоначальный вход костного порошка из процесса экстракции.
   9. Перенесите порошок из бумаги для взвешивания в трубку с маркировкой 2 мл с низким уровнем переплета и безопасным замком для экстракции или хранения. Храните образцы при температуре -20 °C, неопределенно долго.
   10. Храните оставшуюся кость/избыток порошка в сухой стерильной среде с контролируемой температурой (25 °C) до тех пор, пока не будет завершена возврат/репатриация.
   11. Утилизируйте все отходы в автоклавируемые биологически опасные мешки или сосуды. Стерилизуйте/обеззараживать все многоразовое оборудование (например, зажимы, сверла, сверла, пилы и т.д.) с использованием отбеливателя/раствора для обеззараживания ДНК/этанола и воздействия ультрафиолета (длина волны: 254 нм), если это применимо, между каждым отбором проб.

Рисунок 1: Височная кость, включая парс петроса. (A) Образец предварительной резки, показывающий расположение пирамиды петроуса и борозды петрозы. (B) Участок Petrous после резки с выделением плотных участков, подлежащих бурению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Отбор проб постоянных коренных зубов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для отбора проб постоянных моляров предварительно выберите in situ коренные зубы со сросшимися корнями и в идеале лишены кариеса, трещин в эмали или чрезмерного износа для достижения наилучших результатов. Удалите любой забор зубного камня и сохраните при -20 ° C для возможных будущих анализов микробиома полости рта (процедура, не описанная здесь).
   1. Отбор проб цемента
      1. Выполняйте все отборы проб в специально отведенном чистом помещении под вытяжкой ПЦР, оборудованной ультрафиолетовым светом, или шкафом биобезопасности (длина волны: 254 нм) с выключенным воздушным потоком. Распределите стерильную алюминиевую фольгу по столу, чтобы поймать любой случайный костный порошок / фрагменты.
      2. Убедитесь, что все фрагменты костей и как можно больше порошка извлечены (для репатриации) перед утилизацией фольги. Меняйте фольгу между каждым отбором проб. Утилизируйте использованную фольгу в автоклавируемом мешке/сосуде для биологической опасности.
      3. Поместите лист бумаги для взвешивания в стерильный лоток для взвешивания.
      4. Удерживайте/закрепляйте обеззараженный моляр эмалью, корнем вниз, над поддоном для взвешивания с помощью ручного зажима, такого как регулируемый гаечный ключ (см. Таблицу материалов).
      5. Оснастите зубную бормашину круглым режущим колесом с алмазной окантовкой. Установив сверло на среднюю скорость/крутящий момент, слегка прикоснитесь краем долота к корню под углом примерно -20°.
      6. Соскоблите вниз в лоток, чтобы удалить / собрать желтый, самый внешний материал из корня (цемента). Прекратите сбор, когда станет виден более светлый (белый) материал дентина.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно соответствовать направлению вращения режущего долота по отношению к лотку для сбора, чтобы избежать аэрозоляции порошка и потенциального истощения образца из-за полного отсутствия лотка. Цемент особенно богат ДНК; однако типичные выходы материала намного меньше, чем в других анатомических местах отбора проб (~7-20 мг)11,27,28.
      7. Регистрируйте массу порошка, собранного в весовой бумаге с использованием прилагаемых весов с точностью не менее 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
      8. Перенесите порошок из бумаги для взвешивания в безопасную запирающую трубку с низким связующим весом 2 мл для экстракции. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
   2. Отбор проб пульповой камеры
      1. После того, как цемент был собран (при желании), разделите моляр вдоль цементо-эмалевого соединения с помощью ювелирной пилы для удаления короны (см. Рисунок 2).
      2. Поместите новый лист бумаги для взвешивания в новый лоток для взвешивания.
      3. Закрепите секцию заводной головки в ручном зажиме или тиски над поддоном для взвешивания. Держите отрезанную сторону наклоненной вниз и сверлите/скребают материал в качестве первого прохода с помощью зубной дрели, оснащенной сверлом малого калибра (см. Таблицу материалов) по краям пульповой камеры в коронковой части (см. Рисунок 2).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Только первый проход внутренней части пульповой камеры должен быть собран и помечен как материал пульпы (типичный выход 5-15 мг), все, что глубже в зуб, считается дентином.
      4. Поверните зуб нижней частью вниз, постучите молотком по зажиму и соберите освобожденный порошок на бумаге для взвешивания.
      5. Запишите вес порошка, собранного в весовой бумаге, используя прилагаемые весы с точностью не менее 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
      6. Перенесите порошок из весовой бумаги в трубку с низким содержанием переплета и безопасным замком объемом 2 мл для экстракции. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
   3. Отбор проб дентина
      1. Поместите новый лист бумаги для взвешивания в новый лоток для взвешивания.
      2. Удерживайте коронковую секцию над лотком для взвешивания (в соответствии с этапом 3.2.2.3), просверлите и соберите дополнительно 50-100 мг дентина, измеренного с использованием закрытых весов с точностью до 0,01 мг (см. Таблицу материалов) из внутренней части пульповой камеры таким же образом для дальнейшего отбора проб дентина (см. Рисунок 2).
      3. Перенесите костный порошок из бумаги для взвешивания в трубку с низким содержанием переплета и безопасным замком объемом 2 мл для извлечения. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
      4. Храните оставшиеся кусочки зуба / избыток порошка в сухой, контролируемой температурой (25 °C) стерильной среде до тех пор, пока не будет завершена возврат/репатриация.
      5. Утилизируйте все отходы в автоклавируемые биологически опасные мешки или сосуды. Стерилизуйте/обеззараживать все многоразовое оборудование (например, зажимы, сверла, сверла, сверла, пилы и т.д.) с использованием отбеливателя/раствора для обеззараживания ДНК/этанола и воздействия ультрафиолета (длина волны: 254 нм) в зависимости от обстоятельств, между каждым отбором проб.

Рисунок 2: Постоянный молярный предварительный отбор проб. (А) Предварительно обработанный моляр перед отбором проб, показывающий коронку, цемент (желтоватый слой корня) и место разреза на цементо-эмалевом соединении. (B) Та же молярная постцементная коллекция, показывающая участок разреза на цементо-эмалевом соединении. (C) Молярный пострез и отбор проб, показывающий анатомические места отбора проб для камеры пульпы зуба и дентина в коронке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Забор грудных позвонков
   1. Забор тела позвонка
      1. Выполняйте все отборы проб в специально отведенном чистом помещении под вытяжкой ПЦР, оборудованной ультрафиолетовым светом, или шкафом биобезопасности (длина волны: 254 нм) с выключенным воздушным потоком. Распределите стерильную алюминиевую фольгу по столу, чтобы поймать любой случайный костный порошок / фрагменты.
      2. Убедитесь, что все фрагменты костей и как можно больше порошка извлечены (для репатриации) перед утилизацией фольги. Меняйте фольгу между каждым отбором проб. Утилизируйте использованную фольгу в автоклавируемом мешке/сосуде для биологической опасности.
      3. Поместите небольшой лист бумаги для взвешивания в стандартный лоток для взвешивания.
      4. Закрепите позвонки зажимом или тиски рук, телом позвонка наружу.
      5. Подержите позвонки над поддоном для взвешивания, наклонив тело позвонка вниз. С помощью зубной дрели, оснащенной сверлом малого калибра (см. Таблицу материалов), установленным на низкоскоростной высокий крутящий момент, сверлите вдоль внешнего обода (нижнего и верхнего) кортикальной кости, окружающей отменную внутреннюю ткань тела позвонка (см. Рисунок 3).
      6. Соскоблите бит о кортикальный слой над стандартным утяжелительным лотком до тех пор, пока не будет собрано 50-100 мг материала, измеренного с использованием закрытого баланса с точностью до 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
      7. Перенесите костный порошок из бумаги для взвешивания в безопасную запирающую трубку с низким связующим весом 2 мл для извлечения. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
   2. Забор верхней позвоночной дуги
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Удалите и отбросьте самый внешний слой кортикальной кости верхней позвоночной дуги с помощью зубной дрели, оснащенной сверлом малого калибра (см. Таблицу материалов), соскоблив его вдоль поверхности¹⁹. Это не рекомендуется для отбора проб из тела позвонка, так как слой кортикальной кости, как правило, очень тонкий и, вероятно, будет полностью истощен этим процессом (см. ПРИМЕЧАНИЕ в разделе 2).
      1. Поместите небольшой лист бумаги для взвешивания в стандартный лоток для взвешивания.
      2. Закрепите позвонки в ручном зажиме / тиски с позвоночным отростком наружу, верхний аспект вниз.
      3. Удерживая позвонки, верхний аспект вниз, над поддоном для взвешивания, сверлите вверх в центр V-образной выемки, образованной слиянием остистого отростка с ламелями (см. Рисунок 3) с помощью стоматологической бормашины с небольшим калибровочным долотом (см. Таблицу материалов), установленной на низкую скорость и высокий крутящий момент.
      4. Прекращайте бурение, когда происходит заметное падение сопротивления. Слегка измените положение сверления и повторяйте до тех пор, пока не будет собрано 50-100 мг костного порошка, измеренного с использованием закрытого баланса с точностью до 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
      5. Перенесите костный порошок из бумаги для взвешивания в трубку с низким содержанием связывания 2 мл для экстракции. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
      6. Хранить оставшуюся кость/избыток порошка в сухой, стерильной среде с контролируемой температурой (25 °C) до возвращения/репатриации.
      7. Утилизируйте все отходы в автоклавируемые биологически опасные мешки или сосуды. Стерилизуйте/обеззараживать все многоразовое оборудование (например, зажимы, сверла, сверла, пилы и т.д.) с использованием отбеливателя/раствора для обеззараживания ДНК/этанола и воздействия ультрафиолета (длина волны: 254 нм), если это применимо, между каждым отбором проб.

Рисунок 3: Тело позвонка и верхняя позвоночная дуга кортикальная кость Анатомические места выборки грудного позвонка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Забор проб дистальной фаланги
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Удалите и отбросьте самый внешний слой кортикальной кости вала и/или апикального пучка с помощью зубной дрели, оснащенной сверлом малого калибра, соскоблив его вдоль поверхности¹⁹. Это может быть невозможно для образцов с чрезмерно тонкой кортикальной костью или ювенильными останками (см. ПРИМЕЧАНИЕ в разделе 2).
   1. Выполняйте все отборы проб в специально отведенной чистой комнате, под УФ-светом, оборудованной вытяжкой ПЦР или шкафом биобезопасности (длина волны ультрафиолета: 254 нм) с выключенным воздушным потоком. Распределите стерильную алюминиевую фольгу по столу, чтобы поймать любой случайный костный порошок / фрагменты.
   2. Убедитесь, что все фрагменты костей и как можно больше порошка извлечены (для репатриации) перед утилизацией фольги. Меняйте фольгу между каждым отбором проб. Утилизируйте использованную фольгу в автоклавируемом мешке/сосуде для биологической опасности.
   3. Поместите небольшой лист бумаги для взвешивания в стандартный лоток для взвешивания.
   4. Закрепите образец в ручном зажиме/тисках, с верхней стороны вверх.
   5. Проведите образец над лотком для взвешивания, соберите костный порошок из корковой кости с нижней стороны апикального пучка и вала, просверлив через самые внешние плотные слои (см. Рисунок 4) с помощью стоматологической дрели, оснащенной сверлом малого калибра (см. Таблицу материалов).
   6. Прекратите бурение, когда наблюдается заметное снижение сопротивления, так как это означает более легкий, складчатый материал. Повторяют этот процесс, излучая наружу от первоначального сверления до тех пор, пока не будет собрано не менее 50-100 мг костного порошка, измеренного с использованием закрытого баланса с точностью до 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
   7. Перенесите костный порошок из бумаги для взвешивания в трубку с низким содержанием переплета и безопасным замком объемом 2 мл для извлечения. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
   8. Храните оставшуюся кость/избыток порошка в сухой стерильной среде с контролируемой температурой (25 °C) до возвращения/репатриации.
   9. Утилизируйте все отходы в автоклавируемые биологически опасные мешки или сосуды. Стерилизуйте/обеззараживать все многоразовое оборудование (например, зажимы, сверла, сверла, сверла, пилы и т.д.), используя отбеливатель/раствор для обеззараживания ДНК/этанол и воздействие ультрафиолета, в зависимости от обстоятельств, между каждым отбором проб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольших образцов (например, ювенильных образцов) может быть значительно меньше, чем предложенные 50-100 мг кортикальной кости, доступные для образца. Однако даже в небольших количествах было показано, что это анатомическое место отбора проб особенно богато ДНК¹¹.

Рисунок 4: Дистальная фаланга, показывающая расположение плотной кортикальной кости вдоль стержня и нижней стороны апикального пучка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Отбор проб талуса
   1. Выполняйте все отборы проб в специально отведенном чистом помещении под вытяжкой ПЦР, оборудованной ультрафиолетовым светом, или шкафом биобезопасности (длина волны: 254 нм) с выключенным воздушным потоком. Распределите стерильную алюминиевую фольгу по столу, чтобы поймать любой случайный костный порошок / фрагменты.
   2. Убедитесь, что все фрагменты костей и как можно больше порошка извлечены (для репатриации) перед утилизацией фольги. Меняйте фольгу между каждым отбором проб. Утилизируйте использованную фольгу в автоклавируемом мешке/сосуде для биологической опасности.
   3. Поместите небольшой лист бумаги для взвешивания в стандартный лоток для взвешивания.
   4. Закрепите образец в ручном зажиме/тисках, купол вверх.
   5. Держите осыпь, купол вверх и медиальную поверхность к коллектору, над поддоном для взвешивания. Соскоблите кортикальную кость с шейки таранной кости на глубину ~ 1 мм (см. Рисунок 5) с помощью зубной бормашины с низкой калибровочной долотой (см. Таблицу материалов), установленной на низкую скорость и высокий крутящий момент.
   6. Слегка измените положение сверления и повторяйте до тех пор, пока не будет собрано примерно 50-100 мг костного порошка, измеренного с использованием закрытого баланса с точностью до 0,01 мг (см. Таблицу материалов).
   7. Перенесите костный порошок из бумаги для взвешивания в трубку с низким содержанием связывания 2 мл для экстракции. Хранить при -20 °C, неопределенно долго.
   8. Храните оставшуюся кость/избыток порошка в сухой стерильной среде с контролируемой температурой (25 °C) до тех пор, пока не будет завершена возврат/репатриация.
   9. Утилизируйте все отходы в автоклавируемые биологически опасные мешки или сосуды. Стерилизуйте/обеззараживать все многоразовое оборудование (например, зажимы, сверла, сверла, пилы и т.д.) с использованием отбеливателя/раствора для обеззараживания ДНК/этанола и воздействия ультрафиолета (длина волны: 254 нм), если это применимо, между каждым отбором проб.

Рисунок 5: Выборочная область таранной кости для восстановления кортикальной кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: У таранной кости очень мало кортикальной кости (тонкий внешний слой). Материал должен быть собран не только с поверхности, но и с нижележащего плотного слоя канцелированной кости.

Результаты

В отдельном исследовании¹¹ ДНК была извлечена из костного порошка, полученного из каждого анатомического места отбора проб у 11 человек, с использованием стандартного протокола экстракции ДНК, оптимизированного для коротких фрагментов из кальцинированной ткани². Затем было создано²⁸ одноцепочечных библиотек и секвенировано на HiSeq 4000 (75 bp paired-end) на глубину ~ 20 000 000 считываний на образец. Полученные данные последовательности затем оценивали на предмет эндогенного содержания ДНК человека с использованием конвейера EAGER²⁹ (настройки BWA: длина семени 32, штраф за несоответствие 0,1, фильтр качества отображения 37). Все репрезентативные результаты сообщаются с использованием тех же показателей, что и Parker et al. 2020¹¹ для согласованности. Библиотеки из порошкообразных частей pars petrosa дали, в среднем, более высокую эндогенную ДНК, чем любое из других 23 исследованных анатомических мест отбора проб (рисунок 6A-B). Семь дополнительных анатомических мест отбора проб, представленных в настоящем протоколе (цемент, первый проход камеры пульпы зуба и дентин постоянных моляров; кортикальная кость из тела позвонка и верхняя позвоночная дуга грудного позвонка; кортикальная кость из апикального пучка дистальной фаланги; и кортикальная кость из шейки таранной кости) дали следующий по величине урожай (без статистической значимости между этими анатомическими местами отбора проб; Рисунок 6А-В; Дополнительный файл 1: EndogenousDNAPreCap). Все эти альтернативные места последовательно продуцируют ДНК, достаточные для стандартных популяционных генетических анализов, таких как митохондриальный анализ и анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Частота дублирования в библиотеках, обусловленных всеми анатомическими местами выборки, была низкой (кластерные коэффициенты < в среднем 1,2, рассчитанные как отношение всех сопоставлений считываний к уникальным показаниям сопоставления, таблица 2; Дополнительный файл 1: ClusterFactor), указывающий на то, что все экранируемые библиотеки имеют очень высокую сложность. Аналогичным образом, средние оценки экзогенного загрязнения ДНК человека были низкими, составляя в среднем < 2% (загрязнение Х-хромосом у мужчин, n = 7, как сообщается в конвейере ANGSD³⁰) во всех анатомических местах отбора проб, за исключением верхней позвоночной дуги (среднее оценочное загрязнение: 2,11%, при этом один образец был удален в качестве выброса; KRA005: 19,52%, см. таблицу 2; Дополнительный файл 1: Загрязнение). Средняя длина фрагмента (после фильтрации для удаления всех показаний < 30 bp) была самой низкой в материале, собранном из камеры пульпы зуба и дентина, без существенных различий между другими анатомическими местами отбора проб (55,14 bp и 60,22 bp, соответственно, по сравнению со средней медианой 62,87, попарные p-значения < 0,019, таблица 2; Дополнительный файл 1: AvgFragLength). Кроме того, зубы и грудные позвонки содержат несколько анатомических мест отбора проб, где наблюдалось высокое эндогенное восстановление ДНК, что делает их особенно подходящими в качестве альтернативы pars petrosa.

Рисунок 6: Содержание ДНК человека для всех проверенных образцов. Черные линии представляют общее среднее значение, в то время как красные линии представляют медиану (сплошная: пропорция ДНК человека, пунктирная: нанесенное на карту человеческое чтение на миллион сгенерированных чтений). Отдельные анатомические места отбора проб со средней долей ДНК человека выше общей средней (8,16%) окрашиваются во всех анализах. (A) Доля считываемых карт с эталонным геномом hg19. Синяя пунктирная линия представляет собой теоретический максимум с учетом параметров отображения конвейера (сгенерированный с использованием Gargammel³¹ для моделирования случайного распределения 5 000 000 считываний из эталонного генома hg19 с смоделированным повреждением). Индивидуальные средства (черный X) и медианы (красный круг) сообщаются для образцов с более высокой средней долей ДНК человека, чем общее среднее значение. Доверительные интервалы обозначают верхнюю и нижнюю границы, исключая статистические выбросы. (B) Количество уникальных считываний, сопоставленных с эталонным геномом hg19 на миллион считываний усилий секвенирования (75 bp парный конец). Доверительные интервалы обозначают верхнюю и нижнюю границы, исключая статистические выбросы. Эта цифра была адаптирована из Parker, C. et al. 2020¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 2: Средние уровни дупликации (картирование считываний/уникальных считываний), средняя и медианная длина фрагментов и оценки загрязнения Х-хромосом для всех анатомических мест выборки. Ошибка, сообщаемая как стандартная погрешность среднего значения. Эта таблица была адаптирована из Parker, C. et al. 2020¹¹.

Место отбора проб	Средний коэффициент дублирования (# сопоставленных чтений /# уникальных сопоставленных чтений)	Средняя длина фрагмента в bp	Средняя оценочная доля загрязнения Х-хромосом
Пирамида Петруса	1.188 ± 0.006	65.40 ± 1.36	0.000 ± 0.003
Цемент	1.197 ± 0.028	67.28 ± 1.76	0.011 ± 0.003
Дентин	1.188 ± 0.061	60.22 ± 2.37	0.002 ± 0.007
Пульпа	1.179 ± 0.024	55.14 ± 2.90	0.013 ± 0.006
Дистальная фаланга	1.191 ± 0.049	65.95 ± 1.08	0.013 ± 0.005
Тело позвонка	1.194 ± 0.037	66.14 ± 1.03	0,008 ± 0,003
Верхняя позвоночная дуга	1.19 ± 0.017	63.02 ± 1.23	0.021 ± 0.009*
Осыпь	1.198 ± 0.010	68.20 ± 1.24	0.011 ± 0.003
*Образец KRA005 удален как выброс при 0,1952

Доступность кода
Все аналитические программы и модули R, используемые при анализе этой рукописи, находятся в свободном доступе у их соответствующих авторов. Весь пользовательский код R доступен по запросу.

Доступность данных
Все исходные данные, используемые при расчете репрезентативных результатов, находятся в свободном доступе в репозитории данных ENA Европейского нуклеотидного архива (номер присоединения PRJ-EB36983) или дополнительных материалах Parker, C. et ^al.11.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Современная практика в древней популяционной генетике человека заключается в том, чтобы предпочтительно отбирать образцы из pars petrosa (шаг 2.1), когда это возможно. Тем не менее, pars petrosa может быть трудной выборкой для получения, поскольку она высоко ценится для множества скелетных оценок (например, история популяции³², оценка возраста плода в³³ года и определение пола³⁴), и, исторически, выборка парс петроса для анализа ДНК может быть очень разрушительной ^3,4 (включая протокол, представленный здесь, хотя новые, минимально инвазивные протоколы^13,14 в настоящее время широко приняты для смягчения этой проблемы). Это усугубляется тем фактом, что до недавнего времени не было предпринято крупномасштабного систематического исследования восстановления ДНК человека по всему скелету¹¹, что затрудняет поиск подходящей стратегии отбора проб, когда пирамида петроуса недоступна.

Протоколы, представленные здесь, помогают облегчить эту проблему, предоставляя набор оптимизированных процедур для отбора проб ДНК из археологических / судебных скелетных останков, включая pars petrosa, а также семь альтернативных анатомических мест отбора проб по четырем дополнительным скелетным элементам. Все включенные критические этапы предназначены для сведения к минимуму возможности потери/повреждения ДНК либо из-за неэффективного отбора проб (этапы 2.1.6 и 3.2.1.3), либо из-за перегрева образцов во время бурения/резки (этап 3.1.6). Кроме того, во всем протоколе было отмечено, что может потребоваться изменить/опустить этапы предварительной обработки для обеспечения наилучшей производительности в сильно деградированных образцах. Следует также отметить, что даже среди отобранных элементов, представленных здесь, остается несколько возможных альтернативных методов отбора проб (в частности, для парса петроса ^13,14), а также достаточно возможностей для дальнейшей оптимизации недостаточно эксплуатируемых анатомических мест отбора проб, представленных здесь (т.е. осыпь: шаг 2.5 и позвонки: этап 2.3).

Также важно иметь в виду, что эти протоколы были разработаны и протестированы с использованием древних ювенильно-взрослых останков высокого качества (хорошая морфологическая сохранность) для целей эндогенного анализа ДНК человека. Представленные результаты могут не распространяться на более сильно деградированные материалы, другие контексты сохранения, останки младенцев, нечеловеческие останки или исследования патогенов или микробиома, поскольку по-прежнему необходимо более тщательное изучение использования этих протоколов в дополнительных контекстах. Кроме того, альтернативные скелетные элементы, представленные здесь (зубы, позвонки, дистальная фаланга и тали), могут быть сложными для присвоения одному человеку среди смешанных останков, что требует отбора проб из нескольких элементов для обеспечения единого происхождения. Несмотря на эти ограничения, обеспечение широкой доступности этих протоколов может помочь смягчить некоторую неоднородность, связанную с отбором и обработкой образцов, обеспечив обобщенную и количественно оптимизированную структуру для использования в широком спектре будущих исследований аДНК/судебно-медицинской экспертизы человеческих останков.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#16 Dental Drill Bit	NTI	H1-016-HP	example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade	Fisher Scientific	50-949-097	blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	Dremel cutting attachment
Commercial Bleach	Fisher Scientific	NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil	Fisher Scientific	15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool	Dremel	4300	Example drill
Dremel collet and nut kit	Dremel	4485	Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag	Fisher Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Millipore Sigma	1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask	Fisher Scientific	50-206-0397	PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-041-171X	PPE
Fisherbrand Safety Glasses	Fisher Scientific	19-130-208X	PPE
Granger Stationary Vise	Fisher Scientific	NC1336173	benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water	Fisher Scientific	10-977-023
Jewellers Saw	Fisher Scientific	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet	Fisher Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
Medium weighing boat	Heathrow Scientific	HS120223
MSC 10pc plier/clamp set	Fisher Scientific	50-129-5352	Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019	enclosed balance
Tyvek coveralls with hood	Fisher Scientific	01-361-7X	PPE
Weigh paper	Heathrow Scientific	HS120116