微流体声导术，使用适配子亲和磁珠对革兰氏阴性菌进行流式分离

摘要

本文介绍了使用微流体声传技术以及适配体修饰的微珠的微流控声传导芯片的制造和操作，这些微孔片可用于从培养基中快速，有效地分离革兰氏阴性菌。

摘要

本文介绍了使用微流体声传技术以及适配体修饰的微珠的微流体声传芯片的制造和操作，这些微珠可用于从培养基中快速，有效地分离革兰氏阴性细菌。这种方法使用长方形微通道的混合物提高了分离效率。在该系统中，样品和缓冲液通过流量控制器注入入口端口。对于磁珠定心和样品分离，交流电源通过带有功率放大器的函数发生器施加到压电换能器上，以在微通道中产生声辐射力。入口和出口处都有一个分叉通道，可以同时进行分离、纯化和浓缩。该装置的回收率为>98%，纯度为97.8%，剂量浓度为10倍。这项研究表明，回收率和纯度高于现有的分离细菌方法，表明该装置可以有效地分离细菌。

引言

除了基于介电转移、磁电泳、磁透镜提取、过滤、离心微流体和惯性效应以及表面声波^1，2的方法之外，正在开发微流体平台以从医疗和环境样品中分离细菌。使用聚合酶链反应（PCR）继续检测致病菌，但通常费力，复杂且耗时^3，4。微流体声传导系统是通过合理的通量和非接触式细胞隔离来解决这个问题的替代方案^5，6，7。声光照明是一种利用材料通过声波运动的现象来分离或浓缩磁珠的技术。当声波进入微通道时，根据磁珠的大小、密度等对它们进行分类，细胞可以根据悬浮介质^7、8的生化和电学性质进行分离。因此，^许多声传声学研究已被积极开展^9，10，11，最近，在驻场声波微流体中引入由边界驱动的声流引起的声传运动的3D数值模拟¹²。

各个领域的研究正在研究如何替换抗体^2，3。适配子是一种具有高选择性和特异性的目标材料，许多研究正在进行^{2，9，10，13}。与抗体相比，适配子具有体积小、生物稳定性好、成本低、重现性高等优点，正在诊断和治疗应用中进行研究^2，3，14.

在这里，本文描述了一种微流体声传电技术方案，可用于使用适配体修饰的微珠从培养基中快速，有效地分离革兰氏阴性（GN）细菌。该系统通过单压电致动产生二维（2D）声驻波，方法是同时刺激长矩形微通道内的两个正交共振，以将适配体连接的微珠对准并聚焦在节点和反节点点上，以实现分离效率^{2，11，15，16}.入口和出口处都有一个分叉通道，可以同时进行分离、纯化和浓缩。

该方案有助于细菌性传染病的早期诊断，以及通过实时水监测对致病性细菌感染的快速，选择性和敏感反应。

研究方案

1. 微流控声电穿刺芯片设计

注意: 图1 显示了通过声传电从微通道中分离和收集目标微珠的示意图。微流体声传技术芯片采用CAD程序设计。

1. 设计一种微流控声输电芯片，该芯片使用适配体修饰的磁珠和链霉亲和素包覆的聚苯乙烯（PS）磁珠的混合物，对应于细菌的大小，以研究设备的分离性能。
2. 设计一种微流体声传导芯片，该芯片在目标出口处收集PS磁珠，并在将PS样品混合物注入样品入口后通过出口丢弃其余部分（见 图2 和 表1）。
   注:为此，声控流体芯片由两个用于注入样品和缓冲液的入口、一个带有压电传感器（PZT）的主通道组成，允许微珠集中对齐，以及两个出口，通过该出口收集样品并排出废物（图3A）
3. 设计一种微流体声传导芯片，其中微珠、缓冲液、细菌和适配子穿过主通道，微珠通过 PZT 诱导的片内声传导在中心对齐（图 3B，C）

2. 微流控声导通芯片制造

注:按以下顺序组装四层:硼硅玻璃-硅层、硅层、硼硅酸盐玻璃层和PZT层，如图 3A，B所示。

1. 在入口和出口处通过喷砂¹⁷ 制备具有2毫米直径孔的硼硅酸盐玻璃（最上层），用于连接聚醚醚酮（PEEK）管。硼硅酸盐玻璃尺寸为20×80×0.5毫米³。
2. 制备一个200μm厚的硅通道层，其微通道的横截面积为0.2×^{0.2 mm 2} ，使用光刻胶和通过深度反应离子蚀刻（RIE）¹⁸获得的硅图案形成。在反应离子蚀刻期间，为样品和缓冲液入口通道以及收集和废物出口通道钻1 mm直径的孔。
   注意:在这里，离子蚀刻使用RIE工艺形成微通道。在硅晶片上以通道形状施加光刻胶，用于硅通道层。PR涂层的硅晶圆是用施加13.56 Mhz到氟¹⁸产生的等离子体蚀刻的。
3. 用步骤2.2（20×80×0.5mm³）中制备的硅层（20×80×0.5mm³）的上下层制备芯片，在步骤2.1中与硼硅酸盐玻璃结合，并在1，000 V和400°C¹⁹下使用阳极氧化处理第三个硼硅酸盐玻璃层。
4. 使用氰基丙烯酸酯粘合剂（10μL或更少）沿微流体通道将PZT（²⁰×40mm 2）连接到硼硅酸盐玻璃层上。
   注意:使用棉签将粘合剂作为通道中非常薄的一层涂抹，以尽量减少高度的任何变化。 图3C 是该器件的图片。

3. 细菌菌株和培养物

注意:请参阅 表2 选择并孵育GN和革兰氏阳性（GP）细菌进行实验。有关培养方法，请参阅步骤 3.1-3.4。所有细菌应在好氧条件下孵育，直到在600nm（OD₆₀₀）处获得0.4的吸光度。

1. 对于GN细菌，如 大肠杆菌 DH5α， 大肠杆菌 KCTC2571，鞘 氨酰菌和 苦味假单胞菌和GP细菌，如表皮葡萄球菌和巴氏葡萄球菌，在37°C和220rpm的Luria-Bertani培养基中孵育16小时。
2. 对于 肠杆菌 （GN）和 巨型芽孢杆菌 （GP;KCTC 1021），在营养肉汤培养基中以37°C和220rpm孵育16小时。
3. 对于 泰国肠球菌 （GP），在德曼，罗戈萨和夏普（MRS）培养基中以37°C和220rpm孵育16小时。
4. 对于 灰李斯特菌 （GP），在37°C和220rpm的脑心脏输注培养基中孵育16小时。
5. 在室温（RT）下离心（9056× g）培养的细菌1分钟，然后用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液洗涤两次。
6. 通过在PBS缓冲液中重悬来准备选定的GN和GP细菌进行分析。

4. 微珠和适配体固定在微珠上

1. 使用前重悬链霉亲和素包被的微珠（10μm）混合物（材料表）（通过涡旋混合20秒）。
2. 通过在95°C下变性3分钟，然后在0°C下重折叠2分钟来制备适配子。
3. 将250μL重悬链霉亲和素包被的微珠混合物转移到1.5mL管中，并在室温下用Tris-HCl缓冲液（50mM三，pH 7.4，1mMMgCl₂，5mM KCL，100mM NaCl）洗涤。然后向管中加入100μL生物素化的DNA适配体。
4. 将混合物在室温下孵育30分钟，同时旋转（25rpm）。
5. 离心（9056× g）后，用200μL Tris-HCl缓冲液在室温下洗涤管两次。
6. 向洗涤的样品管中加入10μLBSA（100mg / mL），并在室温下旋转（25rpm）孵育30分钟。
7. 最后，通过在室温下在Tris-HCl缓冲液中离心（9056× g）洗涤适配体修饰的微珠两次。

5. 声波电术的设置和操作

1. 将PEEK管连接到用于注入两个样品和缓冲液的两个入口以及用于收集和排出废物的两个出口（图4）。
2. 使用 10 mL 注射器用无气泡软化水手动填充微流体声导管。
3. 准备一个具有两个或多个输出通道的精密压力控制器来控制流体流量。然后，用样品和缓冲液对样品和缓冲液进行半填充，分别在其盖子上加两个孔，并连接到芯片入口。
   注:具有两个或多个输出通道的精密压力控制器可以替换为多个精密压力控制器。在缓冲液入口处，能够通过流量控制器注入能够产生层流以防止样品在样品进样期间移动到中心的缓冲液。
4. 制备设备后，使用精密压力控制装置向样品入口施加2 kPa的压力，向缓冲液入口施加4 kPa的压力，将样品和缓冲液注入样品和缓冲液。
   注意:此时，为了平滑的层流，缓冲液的进样压力应高于样品的进样压力。流量由固定在连接到入口通道的吸气器上的流量控制器控制。
5. 聚焦在磁珠上，使用PZT将其移动到微流体通道的中心，同时通过显微镜进行检查。
   注:磁珠越大，对波形的影响越大，因此更容易与节点点对齐。带放大器的函数发生器将功率施加到PZT，以在微通道中产生正弦波。由于微通道的上部和下部由玻璃制成，因此产生的正弦波被反射并产生节点点⁷。
6. 使用单通道函数发生器产生3.66 MHz的谐振频率，并使用功率放大器将典型信号放大16 dB（约9倍）（图4）。
   注:执行器的谐振频率必须与通道大小匹配;由于信道是方形的，因此PZT以精确的频率运行以创建单个节点。
7. 使用荧光显微镜和以1，200 fps的高速相机观察声控流控芯片上的分离和富集过程。
8. 通过检查用荧光显微镜相机拍摄的细菌结合珠子和通过收集和废物出口样品排出的细菌的图像，量化和分析GN细菌和GP细菌的存在与否。
   注意:含有缓冲液、细菌和接触剂的微珠通过主通道，微珠通过PZT诱导的片内声传导集中排列。最后，在收集出口收集与GN细菌结合的微珠，并将未收集的细菌通过废物出口排出。

结果

图5 显示了磁珠流与PZT电压（OFF、0.1 V、0.5 V、5 V）的函数关系。在本研究中引入的声传芯片的情况下，证实随着PZT电压的增加，10μm大小的磁珠的中心浓度增加。大多数10μm大小的磁珠集中在PZT电压的5 V的中心。通过这一结果，在单通道函数发生器中产生了3.66 MHz的谐振频率，并使用功率放大器将一般信号放大了16 dB（约9倍）。

表3 显示了将1...

讨论

我们开发了一种声波悬浮微流体装置，用于根据其大小和类型以及适配体修饰的微珠，基于连续运行方法，从培养样品中高速捕获和转移GN细菌。与之前报道的 20、21、^{22、23、24、25}、²⁶ 相比，长方形微通道可实现更简单的 ^2D 声传导术设计和...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm polystyrene microbeads	Bang Laboratories	PS04001	Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold	4science	29-03573-01	Components of chip
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'	RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass	Schott	BOROFLOAT 33	Components of chip
Centrifuge	Daihan	CF-10	Wasing particles
Cyanoacrylate glue	3M	AD100	Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Target bacteria
Functional generator	GW Instek	AFG-2225	Generate frequency
High-speed camera	Photron	FASTCAM Mini	Observation of separation
Hot plate	As one	HI-1000	Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe	Koreavaccine	22G-10ML	Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
LB Broth Miller	BD Difco	244620	Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope	Olympus Corp.	IX-81	Observation of separation
PBS buffer	Capricorn scientific	PBS-1A	Wasing bacteria
PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Inject or collect particles
Piezoelectric transducer	Fuji Ceramics	C-213	Generate specific wave in channel
Power amplifier	Amplifier Research	75A250A	Amplify frequency
Pressure controller/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer	invitrogen	15567027	Wasing particles
Tube rotator	SeouLin Bioscience	SLRM-3	Modifiying aptamer and bead