Mikrofluidische Akustophorese zur Durchflusstrennung gramnegativer Bakterien mittels Aptamer Affinity Beads

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Betrieb von mikrofluidischen akustophoretischen Chips unter Verwendung der mikrofluidischen Akustophorese-Technik und Aptamer-modifizierten Mikroperlen, die zur schnellen und effizienten Isolierung gramnegativer Bakterien aus einem Medium verwendet werden können.

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Betrieb von mikrofluidischen akustophoretischen Chips unter Verwendung einer mikrofluidischen Akustophoresetechnik und Aptamer-modifizierten Mikroperlen, die für die schnelle, effiziente Isolierung gramnegativer Bakterien aus einem Medium verwendet werden können. Diese Methode erhöht die Trenneffizienz durch eine Mischung aus langen, quadratischen Mikrokanälen. Bei diesem System werden die Probe und der Puffer über einen Durchflussregler in den Einlassanschluss injiziert. Für die Perlenzentrierung und Probentrennung wird über einen Funktionsgenerator mit Leistungsverstärker Wechselstrom an den piezoelektrischen Wandler angelegt, um eine akustische Strahlungskraft im Mikrokanal zu erzeugen. Sowohl am Ein- als auch am Auslass befindet sich ein gegabelter Kanal, der eine gleichzeitige Trennung, Reinigung und Konzentration ermöglicht. Das Gerät hat eine Wiederfindungsrate von >98% und eine Reinheit von 97,8% bis zu einer 10-fachen Dosiskonzentration. Diese Studie hat eine höhere Wiederfindungsrate und Reinheit als die bestehenden Methoden zur Trennung von Bakterien gezeigt, was darauf hindeutet, dass das Gerät Bakterien effizient trennen kann.

Einleitung

Mikrofluidische Plattformen werden entwickelt, um Bakterien aus medizinischen und Umweltproben zu isolieren, zusätzlich zu Methoden, die auf dielektrischem Transfer, Magnetophorese, Perlenextraktion, Filterung, zentrifugaler Mikrofluidik und Trägheitseffekten sowie akustischen Oberflächenwellen basieren ^1,2. Der Nachweis pathogener Bakterien wird mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) fortgesetzt, ist aber in der Regel mühsam, komplex und zeitaufwendig ^3,4. Mikrofluidische Akustophoresesysteme sind eine Alternative, um dies durch angemessenen Durchsatz und berührungslose Zellisolierung zu beheben ^5,6,7. Die Akustophorese ist eine Technologie, die Perlen unter Verwendung des Phänomens der materiellen Bewegung durch eine Schallwelle trennt oder konzentriert. Wenn Schallwellen in den Mikrokanal eintreten, werden sie nach Größe, Dichte usw. der Perlen sortiert, und Zellen können nach den biochemischen und elektrischen Eigenschaften des Suspensionsmediums ^7,8 getrennt werden. Dementsprechend wurden viele akustophoretische Studien aktiv durchgeführt 9,10,11, und kürzlich wurden numerische 3D-Simulationen akustophoretischer Bewegungen, die durch grenzgetriebenes akustisches Strömen in der Mikrofluidik der akustischen Wellen stehender Oberfläche induziert wurden^, eingeführt ¹².

Studien in verschiedenen Bereichen untersuchen, wie Antikörper^{ersetzt werden können 2,3}. Aptamer ist ein Zielmaterial mit hoher Selektivität und Spezifität, und viele Studien werden durchgeführt 2,9,10,13. Aptamere haben Vorteile von geringer Größe, ausgezeichneter biologischer Stabilität, niedrigen Kosten und hoher Reproduzierbarkeit im Vergleich zu Antikörpern und werden in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen untersucht ^2,3,14.

Hier beschreibt dieser Artikel ein mikrofluidisches Akustophorese-Technologieprotokoll, das für die schnelle, effiziente Trennung von gramnegativen (GN) Bakterien aus einem Medium unter Verwendung von Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen verwendet werden kann. Dieses System erzeugt eine zweidimensionale (2D) akustische stehende Welle durch einzelne piezoelektrische Betätigung, indem es gleichzeitig zwei orthogonale Resonanzen innerhalb eines langen rechteckigen Mikrokanals stimuliert, um Aptamer-gebundene Mikroperlen an den Knoten- und Antiknotenpunkten für die Trenneffizienz auszurichten und zu fokussieren 2,11,15,16 . Sowohl am Ein- als auch am Auslass befindet sich ein gegabelter Kanal, der eine gleichzeitige Trennung, Reinigung und Konzentration ermöglicht.

Dieses Protokoll kann im Bereich der Früherkennung bakterieller Infektionskrankheiten sowie einer schnellen, selektiven und empfindlichen Reaktion auf pathogene bakterielle Infektionen durch Echtzeit-Wasserüberwachung hilfreich sein.

Protokoll

1. Mikrofluidisches Akustophorese-Chip-Design

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt ein Schema der Trennung und Sammlung von Zielmikroperlen aus Mikrokanälen durch Akustophorese. Der mikrofluidische Akustophorese-Chip ist mit einem CAD-Programm konstruiert.

1. Entwerfen Sie einen mikrofluidischen Akustophorese-Chip, der eine Mischung aus Aptamer-modifizierten Perlen und Streptavidin-beschichteten Polystyrol (PS)-Perlen verwendet, die der Größe von Bakterien entsprechen, um die Trennleistung des Geräts zu untersuchen.
2. Entwerfen Sie einen mikrofluidischen Akustophorese-Chip, der PS-Perlen am Zielausgang sammelt und den Rest durch den Auslass verwirft, nachdem eine PS-Probenmischung in den Probeneinlass injiziert wurde (siehe Abbildung 2 und Tabelle 1).
   HINWEIS: Zu diesem Zweck besteht der akustofluidische Chip aus zwei Einlässen für die Injektion von Proben und Puffer, einem Hauptkanal mit einem angeschlossenen piezoelektrischen Wandler (PZT), damit die Mikroperlen zentral ausgerichtet werden können, und zwei Auslässen, über die Proben gesammelt und Abfälle entladen werden (Abbildung 3A).
3. Entwerfen Sie einen mikrofluidischen Akustophorese-Chip, bei dem Mikroperlen, Puffer, Bakterien und Aptamere den Hauptkanal passieren, wobei die Mikrokügelchen zentral über die durch die PZT induzierte In-Chip-Akustophorese ausgerichtet sind (Abbildung 3B, C)

2. Mikrofluidische Akustophorese-Chip-Herstellung

HINWEIS: Setzen Sie vier Schichten in der folgenden Reihenfolge zusammen: eine Borosilikat-Glas-Silizium-Schicht, eine Siliziumschicht, eine Borosilikatglasschicht und eine PZT-Schicht, wie in Abbildung 3A,B dargestellt.

1. Borosilikatglas (die oberste Schicht) mit Löchern mit 2 mm Durchmesser durch Sandstrahlen¹⁷ am Ein- und Auslass zum Anschluss von Polyetheretherketon (PEEK)-Rohren vorbereiten. Das Borosilikatglas misst 20 × 80 × 0,5 mm³.
2. Es wird eine 200 μm dicke Siliziumkanalschicht mit einem Mikrokanal mit einer Querschnittsfläche von 0,2 × 0,2^mm2 hergestellt, der unter Verwendung eines Fotolacks und eines Siliziummusters gebildet wird, das durch tiefenreaktives Ionenätzen (RIE)¹⁸ erhalten wird. Bohren Sie Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm für die Proben- und Puffereinlasskanäle sowie die Sammel- und Abfallauslasskanäle während des reaktiven Ionenätzens.
   HINWEIS: Hier verwendet das Ionenätzen den RIE-Prozess, um Mikrokanäle zu bilden. Für die Siliziumkanalschicht wurde ein Fotolack in Form eines Kanals auf einen Siliziumwafer aufgebracht. Der PR-beschichtete Siliziumwafer wurde mit Plasma geätzt, das durch Auftragen von 13,56 MHz auf Fluor¹⁸ erzeugt wurde.
3. Es wird ein Chip hergestellt, wobei die Schichten über und unter der Siliziumschicht (20 × 80 × 0,5 mm 3), die in Schritt 2.2 (20 × 80 × 0,5 mm³) hergestellt wurden, mit dem Borosilikatglas in Schritt 2.1 und einer dritten Borosilikatglasschicht unter Eloxierung bei 1.000 V und 400 °C¹⁹ verbunden sind.
4. Befestigen Sie eine PZT (20 × 40 mm²) mit einem Cyanacrylatkleber (10 μL oder weniger) auf der Borosilikatglasschicht entlang des mikrofluidischen Kanals.
   HINWEIS: Tragen Sie den Klebstoff als sehr dünne Schicht mit einem Wattestäbchen in den Kanal auf, um Höhenänderungen zu minimieren. Abbildung 3C zeigt ein Bild des Geräts.

3. Bakterienstämme und Kultur

HINWEIS: Siehe Tabelle 2 , um GN- und grampositive (GP) Bakterien für Experimente auszuwählen und zu inkubieren. Informationen zur Kulturmethode finden Sie in den Schritten 3.1-3.4. Alle Bakterien sollten unter aeroben Bedingungen inkubiert werden, bis eine Absorption von 0,4 bei 600 nm (OD₆₀₀) erreicht ist.

1. Für GN-Bakterien wie Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571 , Sphingomonas insulae und Pseudomonas pictorum und GP-Bakterien wie Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus pasteuri, inkubieren Sie in Luria-Bertani-Medium bei 37 °C und 220 U/min für 16 h.
2. Für Enterobacter (GN) und Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), 16 h in Nährbrühmedium bei 37 °C und 220 U/min inkubieren.
3. Für Enterococcus thailandicus (GP) inkubieren Sie in de Man, Rogosa und Sharpe (MRS) medium bei 37 °C und 220 U/min für 16 h.
4. Bei Listeria grayi (GP) 16 h lang im Hirnherz-Infusionsmedium bei 37 °C und 220 U/min inkubieren.
5. Zentrifugieren (9056 x g) der kultivierten Bakterien für 1 min bei Raumtemperatur (RT), dann zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) Puffer waschen.
6. Bereiten Sie die ausgewählten GN- und GP-Bakterien für die Analyse vor, indem Sie sie im PBS-Puffer resuspendieren.

4. Mikroperlen und Immobilisierung von Aptamer auf Mikroperlen

1. Resuspendieren Sie die mit Streptavidin beschichtete Mikroperlen (10 μm) Mischung (Table of Materials) vor Gebrauch (Mischung durch Vortexing für 20 s).
2. Aptamer durch Denaturierung bei 95 °C für 3 min und anschließendes Rückfalten bei 0 °C für 2 min vorbereiten.
3. 250 μL der resuspendierten Streptavidin-beschichteten Mikroperlenmischung in ein 1,5 ml Röhrchen überführen und mit Tris-HCl-Puffer (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 5 mM_KCL, 100 mM NaCl) bei RT waschen. Dann geben Sie 100 μL biotinyliertes DNA-Aptamer in die Röhre.
4. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für 30 min während des Drehens (25 U/min).
5. Nach der Zentrifugation (9056 x g) wird das Röhrchen zweimal mit 200 μL Tris-HCl-Puffer bei RT gewaschen.
6. 10 μL BSA (100 mg/ml) in das gewaschene Probenröhrchen geben und 30 min bei RT mit Rotation (25 U/min) inkubieren.
7. Zum Schluss werden die Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen zweimal durch Zentrifugation (9056 x g) im Tris-HCl-Puffer bei RT gewaschen.

5. Aufbau und Betrieb der Akustophorese

1. Verbinden Sie PEEK-Röhrchen mit den beiden Einlässen für die Injektion von zwei Proben und Puffer und den beiden Auslässen zum Sammeln und Entladen von Abfällen (Abbildung 4).
2. Füllen Sie den mikrofluidischen Akustophoresekanal manuell mit blasenfreiem demineralisiertem Wasser mit einer 10-ml-Spritze.
3. Bereiten Sie einen Präzisionsdruckregler mit zwei oder mehr Ausgangskanälen vor, um den Flüssigkeitsfluss zu steuern. Füllen Sie dann die Durchstechflaschen zur Hälfte mit der Probe und puffern Sie sie mit jeweils zwei Löchern in den Kappen und verbinden Sie sie mit dem Chipeinlass.
   HINWEIS: Ein Präzisionsdruckregler mit zwei oder mehr Ausgangskanälen kann durch mehrere Präzisionsdruckregler ersetzt werden. Am Puffereinlass wird ein Puffer, der in der Lage ist, eine laminare Strömung zu erzeugen, die verhindert, dass sich die Probe während der Probeninjektion in die Mitte bewegt, durch einen Durchflussregler injiziert.
4. Nach der Vorbereitung des Geräts injizieren Sie die Probe und den Puffer, indem Sie mit dem Präzisionsdruckregelgerät einen Druck von 2 kPa an den Probeneinlass und 4 kPa an den Puffereinlass anlegen.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte für eine glatte laminare Strömung der Injektionsdruck des Puffers höher sein als der Injektionsdruck der Probe. Der Durchfluss wird von einem Durchflussregler gesteuert, der am Ansauger befestigt ist, der mit dem Einlasskanal verbunden ist.
5. Konzentrieren Sie sich auf eine Perle, um sie mit dem PZT in die Mitte des mikrofluidischen Kanals zu bewegen, während Sie durch das Mikroskop prüfen.
   HINWEIS: Je größer die Perle, desto größer der Effekt auf die Wellenform, so dass es einfacher ist, sie am Knotenpunkt auszurichten. Funktionsgenerator mit Verstärker versorgt PZT mit Strom, um Sinuswellen im Mikrokanal zu erzeugen. Da der obere und untere Teil des Mikrokanals aus Glas bestehen, wird die erzeugte Sinuswelle reflektiert und erzeugt einen Knotenpunkt⁷.
6. Erzeugen Sie eine Resonanzfrequenz von 3,66 MHz mit einem einkanaligen Funktionsgenerator und verstärken Sie ein typisches Signal mit einem Leistungsverstärker um 16 dB (etwa das Neunfache) (Abbildung 4).
   HINWEIS: Die Resonanzfrequenz des Aktors muss mit der Größe des Kanals übereinstimmen; Da der Kanal quadratisch ist, arbeitet der PZT mit einer genauen Frequenz, um einen einzelnen Knoten zu erstellen.
7. Beobachten Sie die Trenn- und Anreicherungsprozesse auf dem akustofluidischen Chip mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Hochgeschwindigkeitskamera, die mit 1.200 fps arbeitet.
8. Quantifizieren und analysieren Sie das Vorhandensein oder Fehlen von GN-Bakterien und GP-Bakterien, indem Sie die mit der fluoreszenzmikroskopischen Kamera aufgenommenen Bilder der bakteriengebundenen Perlen und Bakterien überprüfen, die durch die Sammel- und Abfallauslassproben ausgeschieden werden.
   HINWEIS: Mikroperlen mit Puffer, Bakterien und Aptameren passieren den Hauptkanal, und die Mikroperlen werden zentral über die durch die PZT induzierte In-Chip-Akustophorese ausgerichtet. Schließlich werden Mikroperlen, die GN-Bakterien gebunden haben, an der Sammelstelle gesammelt, und die nicht gesammelten Bakterien werden durch den Abfallauslass ausgestoßen.

Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt das Bild des Wulststroms als Funktion der PZT-Spannung (OFF, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). Im Fall des in dieser Studie vorgestellten akustophoretischen Chips wurde bestätigt, dass mit zunehmender Spannung des PZT die zentrale Konzentration der 10 μm großen Perlen zunahm. Die meisten der 10 μm großen Perlen wurden in der Mitte bei 5 V der PZT-Spannung konzentriert. Durch dieses Ergebnis wurde in einem Einkanal-Funktionsgenerator eine Resonanzfrequenz von 3,66 MHz erzeugt und ein...

Diskussion

Wir entwickelten ein mikrofluidisches Schallschwebegerät zum Einfangen und Übertragen von GN-Bakterien aus Kulturproben mit hoher Geschwindigkeit, basierend auf einer kontinuierlichen Laufmethode entsprechend ihrer Größe und Art und Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen. Der lange, quadratische Mikrokanal ermöglicht ein einfacheres Design und eine höhere Kosteneffizienz für die 2D-Akustophorese als bisher berichtet 20,21,22,23,24,25,26.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm polystyrene microbeads	Bang Laboratories	PS04001	Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold	4science	29-03573-01	Components of chip
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'	RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass	Schott	BOROFLOAT 33	Components of chip
Centrifuge	Daihan	CF-10	Wasing particles
Cyanoacrylate glue	3M	AD100	Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Target bacteria
Functional generator	GW Instek	AFG-2225	Generate frequency
High-speed camera	Photron	FASTCAM Mini	Observation of separation
Hot plate	As one	HI-1000	Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe	Koreavaccine	22G-10ML	Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
LB Broth Miller	BD Difco	244620	Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope	Olympus Corp.	IX-81	Observation of separation
PBS buffer	Capricorn scientific	PBS-1A	Wasing bacteria
PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Inject or collect particles
Piezoelectric transducer	Fuji Ceramics	C-213	Generate specific wave in channel
Power amplifier	Amplifier Research	75A250A	Amplify frequency
Pressure controller/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer	invitrogen	15567027	Wasing particles
Tube rotator	SeouLin Bioscience	SLRM-3	Modifiying aptamer and bead