Aptamer Afinite Boncukları Kullanılarak Gram-Negatif Bakterilerin Akış Yoluyla Ayrılması için Mikroakışkan Akustoforez

Özet

Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır.

Özet

Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, uzun, kare mikro kanalların bir karışımını kullanarak ayırma verimliliğini artırır. Bu sistemde, numune ve tampon bir akış kontrolörü aracılığıyla giriş portuna enjekte edilir. Boncuk merkezleme ve numune ayırma için, AC gücü, mikrokanalda akustik radyasyon kuvveti üretmek için bir güç amplifikatörü ile bir fonksiyon üreteci aracılığıyla piezoelektrik dönüştürücüye uygulanır. Hem giriş hem de çıkışta çatallı bir kanal vardır, bu da aynı anda ayırma, saflaştırma ve konsantrasyon sağlar. Cihaz,% >98'lik bir iyileşme oranına ve% 97.8'lik bir saflığa, 10x doz konsantrasyonuna kadar% 97.8'lik bir saflığa sahiptir. Bu çalışma, bakterileri ayırmak için mevcut yöntemlerden daha yüksek bir iyileşme oranı ve saflık göstermiştir, bu da cihazın bakterileri verimli bir şekilde ayırabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Dielektrik transfer, manyetoforez, boncuk ekstraksiyonu, filtreleme, santrifüjlü mikroakışkanlar ve atalet etkileri ve yüzey akustik dalgaları ^1,2'ye dayalı yöntemlere ek olarak, bakterileri tıbbi ve çevresel örneklerden izole etmek için mikroakışkan platformlar geliştirilmektedir. Patojenik bakterilerin tespiti polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak devam eder, ancak genellikle zahmetli, karmaşık ve zaman alıcıdır ^3,4. Mikroakışkan akustoforez sistemleri, makul verim ve temassız hücre izolasyonu ^5,6,7 yoluyla bunu ele almak için bir alternatiftir. Akustoforez, bir ses dalgası boyunca maddi hareket fenomenini kullanarak boncukları ayıran veya yoğunlaştıran bir teknolojidir. Ses dalgaları mikrokanala girdiğinde, boncukların büyüklüğüne, yoğunluğuna vb. göre sıralanır ve hücreler, süspansiyon ortamı ^7,8'in biyokimyasal ve elektriksel özelliklerine göre ayrılabilir. Buna göre, birçok akustophoretic çalışma aktif olarak 9,10,11 takip edilmiş ve son zamanlarda^, ayakta duran yüzey akustik dalga mikroakışkanlarında sınır güdümlü akustik akış tarafından indüklenen akustophoretik hareketin 3D sayısal simülasyonları tanıtılmıştır ¹².

Çeşitli alanlardaki çalışmalar antikorların nasıl değiştirileceğini incelemektedir ^2,3. Aptamer, yüksek seçiciliğe ve özgüllüğe sahip bir hedef malzemedir ve^{birçok çalışma} 2,9,10,13 yürütülmektedir. Aptamerler, antikorlara kıyasla küçük boyutlu, mükemmel biyolojik stabilite, düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir ve tanı ve tedavi uygulamalarında incelenmektedir ^2,3,14.

Burada, bu makalede, aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak Gram-negatif (GN) bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde ayrılması için kullanılabilecek bir mikroakışkan akustoforez teknolojisi protokolü açıklanmaktadır. Bu sistem, uzun bir dikdörtgen mikrokanal içindeki iki ortogonal rezonansı aynı anda uyararak, ayırma verimliliği için düğüm ve anti-düğüm noktalarında aptamer bağlı mikroboncukları hizalamak ve odaklamak için tek piezoelektrik çalıştırma yoluyla iki boyutlu (^2B) akustik durağan bir dalga üretir ^2,11,15,16 . Hem giriş hem de çıkışta çatallı bir kanal vardır, bu da aynı anda ayırma, saflaştırma ve konsantrasyon sağlar.

Bu protokol, bakteriyel bulaşıcı hastalıkların erken teşhisi ve gerçek zamanlı su izleme yoluyla patojenik bakteriyel enfeksiyonlara hızlı, seçici ve hassas bir yanıt alanında yardımcı olabilir.

Protokol

1. Mikroakışkan akustoforez çip tasarımı

NOT: Şekil 1 , hedef mikroboncukların mikrokanallardan akustoforez ile ayrılması ve toplanmasının bir şemasını göstermektedir. Mikroakışkan akustoforez çipi bir CAD programı ile tasarlanmıştır.

1. Cihazın ayırma performansını incelemek için bakterilerin boyutuna karşılık gelen aptamer modifiye boncuklar ve streptavidin kaplı polistiren (PS) boncukların bir karışımını kullanan mikroakışkan bir akustoforez çipi tasarlayın.
2. PS boncuklarını hedef çıkışta toplayan ve numune girişine bir PS numune karışımı enjekte ettikten sonra geri kalanını çıkıştan atan bir mikroakışkan akustoforez çipi tasarlayın (bkz. Şekil 2 ve Tablo 1).
   NOT: Bu amaçla, akustoakışkan çip, numunelerin ve tamponun enjekte edilmesi için iki girişten, mikroboncukların merkezi olarak hizalanmasını sağlamak için bağlı bir piezoelektrik dönüştürücüye (PZT) sahip bir ana kanaldan ve numunelerin toplandığı ve atıkların boşaltıldığı iki çıkıştan oluşan tasarlanmıştır (Şekil 3A)
3. Mikroboncukların, tamponların, bakterilerin ve aptamerlerin ana kanaldan geçtiği, mikroboncukların PZT tarafından indüklenen çip içi akustoforez yoluyla merkezi olarak hizalandığı bir mikroakışkan akustoforez çipi tasarlayın (Şekil 3B, C)

2. Mikroakışkan akustoforez çip imalatı

NOT: Dört katmanı aşağıdaki sırayla birleştirin: Şekil 3A, B'de gösterildiği gibi bir borosilikat cam-silikon tabaka, bir silikon tabaka, bir borosilikat cam tabaka ve bir PZT tabakası.

1. Polietereterikon (PEEK) tüplerini bağlamak için giriş ve çıkışta¹⁷ kumlama ile 2 mm çapında deliklere sahip borosilikat cam (en üst tabaka) hazırlayın. Borosilikat cam 20 × 80 × 0,5^mm3 ölçer.
2. Bir fotodirenç ve derin reaktif iyon aşındırma (RIE)¹⁸ ile elde edilen bir silikon desen kullanılarak oluşturulmuş 0,2 ×^{0,2 mm2} kesit alanına sahip bir mikrokanala sahip 200 μm kalınlığında bir silikon kanal tabakası hazırlayın. Reaktif iyon aşındırma sırasında numune ve tampon giriş kanalları ile toplama ve atık çıkış kanalları için 1 mm çapında delikler açın.
   NOT: Burada, iyon aşındırma, mikrokanallar oluşturmak için RIE işlemini kullanır. Silikon kanal tabakası için silikon gofret üzerinde bir kanal şeklinde bir fotodirenç uygulandı. PR kaplı silikon gofret, flor^18'e 13.56 Mhz uygulanarak üretilen plazma ile kazındı.
3. Adım 2.1'de borosilikat cama bağlanmış 2.2 (20 × 80 × 0.5 mm 3) 'de hazırlanan silikon tabakanın (20 × 80 × 0.5 mm³) üstündeki ve altındaki katmanlarla bir çip ve 1.000 V ve 400 ° C^19'da eloksal kullanılarak üçüncü bir borosilikat cam tabakası hazırlayın.
4. Bir siyanoakrilat yapıştırıcı (10 μL veya daha az) kullanarak mikroakışkan kanal boyunca borosilikat cam tabakaya bir PZT (20 × 40^mm2) takın.
   NOT: Yükseklikteki herhangi bir değişikliği en aza indirmek için yapıştırıcıyı kanalda çok ince bir tabaka halinde pamuklu çubukla uygulayın. Şekil 3C , cihazın bir resmidir.

3. Bakteri suşları ve kültürü

NOT: Deneyler için GN ve Gram-pozitif (GP) bakterileri seçmek ve inkübe etmek için Tablo 2'ye bakınız. Kültür yöntemi için 3.1-3.4 numaralı adımlara bakın. Tüm bakteriler, 600 nm'de (OD 600₎ 0.4'lük bir absorbans elde edilene kadar aerobik koşullar altında inkübe edilmelidir.

1. Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae ve Pseudomonas pictorum gibi GN bakterileri ve Staphylococcus epidermidis ve Staphylococcus pasteuri gibi GP bakterileri için, Luria-Bertani ortamında 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de kuluçkaya yatırılır.
2. Enterobacter (GN) ve Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de besin suyu ortamında inkübe edin.
3. Enterococcus thailandicus (GP) için, de Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) ortamında 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de inkübe edin.
4. Listeria grayi (GP) için, beyin kalp infüzyon ortamında 37 ° C'de ve 16 saat boyunca 220 rpm'de inkübe edin.
5. Kültürlenmiş bakterileri oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca santrifüj (9056 x g), daha sonra 1x fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile iki kez yıkayın.
6. Seçilen GN ve GP bakterilerini PBS tamponunda yeniden askıya alarak analiz için hazırlayın.

4. Mikroboncuklar ve aptamer'in mikroboncuklar üzerine immobilizasyonu

1. Streptavidin kaplı mikroboncuk (10 μm) karışımını (Malzeme Tablosu) kullanmadan önce tekrar askıya alın (20 saniye boyunca vorteks yoluyla karıştırın).
2. Aptamer'i 3 dakika boyunca 95 °C'de denatüre ederek ve ardından 2 dakika boyunca 0 °C'de tekrar katlayarak hazırlayın.
3. Yeniden askıya alınmış streptavidin kaplı mikroboncuk karışımının 250 μL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de Tris-HCl tamponu (50 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl₂, 5 mM KCL, 100 mM NaCl) ile yıkayın. Daha sonra tüpe 100 μL biyotinillenmiş DNA aptamer ekleyin.
4. RT'de karışımı döndürürken (25 rpm) 30 dakika boyunca inkübe edin.
5. Santrifüjlemeden sonra (9056 x g), tüpü RT'de 200 μL Tris-HCl tamponu ile iki kez yıkayın.
6. Yıkanmış numune tüpüne 10 μL BSA (100 mg/mL) ekleyin ve RT'de rotasyonla (25 rpm) 30 dakika inkübe edin.
7. Son olarak, aptamer modifiye mikroboncukları RT'de Tris-HCl tamponunda santrifüjleme (9056 x g) ile iki kez yıkayın.

5. Akustoforez kurulumu ve çalışması

1. PEEK tüplerini, iki numune ve tampon enjekte etmek için iki girişe ve atıkların toplanması ve boşaltılması için iki çıkışa bağlayın (Şekil 4).
2. Mikroakışkan akustoforez kanalını, 10 mL'lik bir şırınga kullanarak kabarcıksız demineralize su ile manuel olarak doldurun.
3. Sıvı akışını kontrol etmek için iki veya daha fazla çıkış kanalına sahip hassas bir basınç kontrolörü hazırlayın. Ardından, şişeleri sırasıyla kapaklarında iki delik bulunan numune ve tamponla yarı yarıya doldurun ve talaş girişine bağlayın.
   NOT: İki veya daha fazla çıkış kanalına sahip bir hassas basınç kontrolörü, birden fazla hassas basınç kontrolörü ile değiştirilebilir. Tampon girişinde, numune enjeksiyonu sırasında numunenin merkeze hareket etmesini önleyen laminer bir akış oluşturabilen bir tampon, bir akış kontrolörü aracılığıyla enjekte edilir.
4. Cihazı hazırladıktan sonra, hassas basınç kontrol cihazını kullanarak numune girişine 2 kPa ve tampon girişine 4 kPa basınç uygulayarak numuneyi ve tamponu enjekte edin.
   NOT: Şu anda, pürüzsüz laminer akış için, tamponun enjeksiyon basıncı, numunenin enjeksiyon basıncından daha yüksek olmalıdır. Akış, giriş kanalına bağlı aspiratöre sabitlenmiş bir akış kontrolörü ile kontrol edilir.
5. Mikroskoptan kontrol ederken PZT'yi kullanarak mikroakışkan kanalın merkezine taşımak için bir boncuğa odaklanın.
   NOT: Boncuk ne kadar büyük olursa, dalga formu üzerindeki etki o kadar büyük olur, bu nedenle düğüm noktasıyla hizalamak daha kolaydır. Amplifikatörlü fonksiyon üreteci, mikrokanalda sinüs dalgası üretmek için PZT'ye güç uygular. Mikrokanalın üst ve alt kısımları camdan yapıldığı için, üretilen sinüs dalgası yansır ve bir düğüm noktası⁷ oluşturur.
6. Tek kanallı bir fonksiyon üreteci kullanarak 3,66 MHz'lik bir rezonans frekansı oluşturun ve bir güç amplifikatörü kullanarak tipik bir sinyali 16 dB (yaklaşık dokuz kat) yükseltin (Şekil 4).
   NOT: Aktüatörün rezonans frekansı kanalın boyutuyla eşleşmelidir; Kanal kare olduğundan, PZT tek bir düğüm oluşturmak için doğru bir frekansta çalışır.
7. Bir floresan mikroskobu ve 1.200 fps'de çalışan yüksek hızlı bir kamera ile akustoakışkan çip üzerindeki ayırma ve zenginleştirme işlemlerini gözlemleyin.
8. GN bakterilerinin ve GP bakterilerinin varlığını veya yokluğunu, toplama ve atık çıkış numuneleri yoluyla boşaltılan bakteri bağlı boncukların ve bakterilerin floresan mikroskop kamerasıyla çekilen görüntüleri kontrol ederek ölçün ve analiz edin.
   NOT: Tampon, bakteri ve aptamer içeren mikroboncuklar ana kanaldan geçer ve mikroboncuklar PZT tarafından indüklenen çip içi akustoforez yoluyla merkezi olarak hizalanır. Son olarak, GN bakterilerini bağlayan mikroboncuklar toplama çıkışında toplanır ve toplanmamış bakteriler atık çıkışından boşaltılır.

Sonuçlar

Şekil 5, PZT voltajının bir fonksiyonu olarak boncuk akışının görüntüsünü göstermektedir (KAPALI, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). Bu çalışmada tanıtılan akustophoretic çip durumunda, PZT'nin voltajı arttıkça, 10 μm büyüklüğündeki boncukların merkezi konsantrasyonunun arttığı doğrulanmıştır. 10 μm büyüklüğündeki boncukların çoğu, PZT voltajının 5 V'unda merkezde yoğunlaşmıştır. Bu sonuç sayesinde, tek kanallı bir fonksiyon üretecinde 3.66 MHz'lik bir...

Tartışmalar

GN bakterilerini kültür örneklerinden boyutlarına ve türlerine göre sürekli çalışan bir yönteme ve aptamer modifiye edilmiş mikro boncuklara dayanarak yüksek hızda yakalamak ve aktarmak için sonik bir levitasyon mikroakışkan cihazı geliştirdik. Uzun, kare mikrokanal, 2D akustoforez için daha önce bildirilen 20,21,22,23,24,25,26'dan daha basit bir tasarım ve daha fazla maliyet verimliliği sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm polystyrene microbeads	Bang Laboratories	PS04001	Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold	4science	29-03573-01	Components of chip
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'	RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass	Schott	BOROFLOAT 33	Components of chip
Centrifuge	Daihan	CF-10	Wasing particles
Cyanoacrylate glue	3M	AD100	Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Target bacteria
Functional generator	GW Instek	AFG-2225	Generate frequency
High-speed camera	Photron	FASTCAM Mini	Observation of separation
Hot plate	As one	HI-1000	Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe	Koreavaccine	22G-10ML	Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
LB Broth Miller	BD Difco	244620	Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope	Olympus Corp.	IX-81	Observation of separation
PBS buffer	Capricorn scientific	PBS-1A	Wasing bacteria
PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Inject or collect particles
Piezoelectric transducer	Fuji Ceramics	C-213	Generate specific wave in channel
Power amplifier	Amplifier Research	75A250A	Amplify frequency
Pressure controller/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer	invitrogen	15567027	Wasing particles
Tube rotator	SeouLin Bioscience	SLRM-3	Modifiying aptamer and bead