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摘要

一种概述人胚层形成的方案，可有效，及时和依次产生囊胚样细胞。

摘要

由干细胞（胚泡）形成的人类囊胚模型将支持科学和医学进步。然而，其预测能力将取决于其有效，及时和忠实地概括囊胚发育序列（形态发生，规范，图案）并形成反映囊胚阶段的细胞的能力。在这里，我们表明，在PXGL条件下培养的幼稚人多能干细胞，然后三倍抑制河马，转化生长因子 - β，细胞外信号调节的激酶途径有效地经历形态发生以形成胚泡（>70%）。与发育时间（约4天）匹配，胚泡通过产生滋养层和隔胚层的类似物来展开规格的囊胚序列，然后形成原始内胚层和极性滋养层的类似物。这导致形成转录类似于囊胚（>96%）的细胞和少数植入后类似物。胚泡通过形成以极性区域（NR2F2 +）成熟为标志的胚胎 - 半胚胎轴来有效地形成模式，其获得定向附着于激素刺激的子宫内膜细胞的特定潜力，就像 在子宫中一样。这种人类爆炸体是一种可扩展的，多功能的，道德的模型，用于研究人类发育和 体外植入。

引言

缺乏实验模型限制了对人类早期胚胎发生的理解。目前对人类胚胎发育特定方面的知识来自捐赠用于研究的剩余 体外 受精（IVF）胚胎。然而，有限的可用性，实验操作的困难以及胚胎的可变质量阻碍了科学研究。相反，人类胚胎的忠实 体外 模型将允许复杂的实验操作，从而为补充对人类胚胎的研究提供道德机会1，2，3，4。先前开发的小鼠囊胚模型结合小鼠胚胎干细胞和滋养层干细胞5。在该详细方案中，描述了从符合元素囊胚标准的天真多能干细胞生成人囊胚模型的方法6。

人类爆炸体的四个标准。 在这里，为了建立人类爆炸体的标准化定义，我们提出了四个最小标准。虽然不是详尽无遗的，但这些标准可以作为评估允许形成人类胚泡的参数的基础（图1A）。（1）胚芽体应该在形态学和三个谱系的类似物的产生方面有效形成，即上胚层（Epi），滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PrE）。效率低下可能表明初始细胞状态或/和培养条件不足（例如，胚层培养基）。（2）胚芽体应根据发育顺序（Epi/TE优先，PrE/polarTE最后）7，8 和时间（诱导〜3天;胚胎日5-7）7，9产生三个谱系的类似物。（3）胚泡应形成囊胚期的类似物，但不能形成植入后阶段的类似物（例如，植入后成壁细胞、滋养层或羊膜细胞）。（4）最后，类芽体应能够概括囊胚植入和发育的功能特征。使用该协议，人胚层使用多个细胞系（>70%）有效地形成，能够按顺序并在4天内产生囊胚细胞类似物，并且类似物在转录上与囊胚阶段相似（>96%，基于几种分析）6，10，11。最后，胚泡稳健地产生胚胎 - 无胚胎轴，这使它们能够通过极地区域与激素刺激的子宫内膜细胞相互作用，并在扩展培养时强健地扩展谱系（时间等效:胚胎第13天）。

初始单元格状态的重要性。 人类多能干细胞（hPSCs）可以稳定在不同的状态，试图捕捉精确的发育阶段。这些状态由培养条件维持，尽管仍然不理想，但将细胞限制在植入前（〜胚胎日5-7）或植入后样（〜胚胎日8-14）上胚层12。转录组学分析表明，与在成纤维细胞生长因子（FGF）2和激活素15（称为引物hPSCs 12）和人类扩展多能干细胞（hEPSC）16中培养的hPSCs相比，在PD0325901，XAV939，Gö6983和白血病抑制因子（LIF;称为PXGL朴素hPSCs）13，14中培养的hPSCs与囊胚表胚层更相似（参见参考文献17中的分析，18，19）。因此，引物hPSCs的转录组与植入后/原肠胚形成前的cynomolgus monkey epiblast20最匹配。其他分子标准，如转座子表达，DNA甲基化和X染色体状态，证实与启动状态相比，幼稚状态的变化更接近囊胚上胚层17，21。最后，使用PXGL培养条件22成功地直接从囊胚中直接衍生出幼稚hPSCs品系。

人类早期囊胚细胞尚未提交。 小鼠谱系规范发生在囊胚阶段23 之前的 morula 阶段。相反，解离和再聚集实验表明，早期囊胚的人类滋养外胚层细胞尚未提交24。因此，通过单细胞RNA测序（scRNAseq）对人囊胚细胞的分析表明，第一谱系规范（滋养层/成布体）发生在囊胚腔7形成之后。这种延迟的人类规格与观察到的hPSC在小鼠PSC主要致力于表层细胞谱系时有效形成滋养层细胞25，26，27相关。这些综合观察结果导致幼稚的hPSCs反映了囊胚阶段并保留了形成三个囊胚谱系的潜力。最近，有人提出hPSCs在从幼稚状态到启动状态的过程中从滋养外胚层转移到羊膜的效力27。因此，与引物hPSCs27，hEPSCs 16或中间重编程状态28相比，幼稚hPSCs更类似于植入前阶段17，18，21，并且具有增强的形成滋养层的能力（图1B).因此，初始细胞状态对于形成适当的胚胎外类似物至关重要。尽管对转化的滋养外胚层类似物进行彻底的并排分析仍有待完成，但反映早期囊胚的PXGL幼稚状态对于形成高保真胚泡似乎很重要。

通过信号通路抑制规范和形态发生。河马信号通路的抑制是一种保守机制，驱动小鼠，奶牛和人类的滋养层规范9，29，30。此外，自2013年以来，已知NODAL（A83-01）和细胞外信号调节激酶（ERK;PD0325901或同等值）和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路的激活触发了引物hPSCs以激活与滋养层谱系相关的转录网络25，31，32，33，34。此外，最近有几份报告还证实，对NODAL和ERK途径的抑制以及BMP的活化有助于滋养层细胞与幼稚hPSCs25，31，32，33，34的分化。最后，如果滋养层规范是从幼稚状态触发的，则细胞概括滋养外胚层26的发育进展的各个方面。然而，反映囊胚滋养外胚层的自我更新线在体外尚未稳定。根据滋养层规范，诱导表皮生长因子（EGF）和Wnt信号通路以及HDAC抑制可能促进滋养层发育进展34，35并将细胞稳定为反映植入后细胞滋养层细胞18，35的人滋养层干细胞（hTSCs）线。这种线既可以衍生自囊胚35又能衍生自胎盘组织35。

第二个胚胎外谱系，称为PrE，在滋养层细胞之后指定，起源于epiblast7，9。与小鼠PrE36相反，人类对应物被认为独立于FGF信号传导37，38。通过使用激活素A，Wnt和LIF39诱导信号通路，从幼稚的hPSC建立反映胚胎外内胚层（称为nEnd）的线。与胚胎抑制实验不一致，ERK抑制已被证明可以防止这种nEND细胞 在体外39的形成。到目前为止，这些谱系还没有直接从囊胚中衍生出来。

最近，通过结合先前为hTSCs35和nEND细胞39开发的培养基的变体，已经形成了早期胚胎的模型，从而使用转化生长因子 - β（TGF-β），EGF和Wnt信号通路28，40的激活剂。这些胚胎模型以低效率（10%-20%）形成，并形成类似于植入后而不是植入前阶段10的细胞，包括植入后成形细胞，滋养层，羊膜，胃泌素，中胚层组织（〜胚胎第14天）和细胞滋养层细胞10的类似物。相反，对河马，ERK和TGF-β途径的三重抑制有效地引导包含囊胚样细胞41的胚泡的形成。除了初始细胞状态外，我们还提出三重途径抑制（Hippo，ERK，TGF-β）是形成高保真胚层的第二个基本参数（图1B）。

使用scRNAseq评估细胞状态和反射阶段。 组成胚泡的细胞的状态可以通过scRNAseq分析来评估。它们与特定胚胎阶段的转录相似性可以单独使用胚细胞测量，也可以通过与反映植入后阶段20，35的预涂hPSC或hTSCs进行比较来测量。使用不同定义级别执行聚类分析可揭示当定义减少时亚群如何逐渐合并，从而揭示聚类的相似性。虽然可以测量簇数的最优性42，但高分辨率聚类也告知最终存在的小异常亚群，例如反映植入后阶段10。簇之间差异表达的基因可以通过评估定义阶段特异性谱系的参考基因集的表达水平，在发育过程中提供有关其类似物的信息。这允许通过无监督距离图（例如，使用顶级富集基因）或通过基因集富集分析（GSEA）43来测量胚芽亚群的富集。使用这种类芽体方案，只有三个主要簇形成转录反映三个囊胚谱系。一组包括初始的幼稚hPSC和胚层的epiblast类似物。分析不同时间点的细胞显示出谱系规格的顺序性质（滋养层细胞在24小时内开始指定，原始内胚层细胞在60小时内开始指定）。高分辨率聚类捕获了表达原肠胚期胚胎特异性基因（可能是中胚层或羊膜）的细胞亚群（3.2%）。值得注意的是，最初的幼稚hPSCs也占植入后样细胞的5%，如前所述44。在第二次分析中，胚芽细胞可以在 计算机中 与在不同阶段45，46，47从概念中分离出的参考细胞合并，以推断阶段等效性。在这里，从植入前概念45，46， 体外 培养的囊胚45和原肠胚期胚胎47中分离的细胞被用作参考点。使用该协议，量化了高分辨率聚类所揭示的不匹配的胚细胞确实与植入后中胚层和羊膜聚集。在今后的步骤中，转录组基准测试应辅之以转座子表达、DNA甲基化和 X 染色体状态的分析，这些分析还提供了发育阶段 21 的里程碑。

评估人体爆炸物的轴形成和其他功能。 成熟囊胚的特征在于形成用于植入的胚胎 - 胚胎轴图案滋养层。使用这种类卵管方案，轴稳健地形成，例如近端滋养层（例如NR2F2 + / CDX2-）的成熟，其仅在激素刺激时才获得附着在子宫内膜类器官细胞上的能力48，49。与不形成外胚层的滋养层进行比较表明，这些内细胞诱导相邻滋养层成熟，以介导对子宫内膜的初始附着。当在为cynomolgus猴囊胚50设计的扩展培养基中培养时，来自胚芽的所有三个谱系持续扩展六天（时间相当于第13天），尽管它们的组织没有反映该发育阶段。

高效率和高保真人类爆炸体的含义。 在模式生物中发现的发育原理的保存本身就很难在人类概念中进行测试，因为获取受到限制，并且在遗传和物理上操纵它的技术困难。高效和高保真度的类固醇模型将允许进行高通量的遗传和药物筛选，这是科学和生物医学发现的基础。此外，纳入复杂的基因修饰来改变和记录生物过程将补充这些研究。总体而言，我们提出幼稚的PXGL hPSCs的三重抑制（Hippo，TGF-β，ERK）对于符合四个最小标准的高保真人类胚层的有效形成具有导电性。该协议的可扩展性和多功能性使其适合生成有针对性的假设，然后可以使用人类囊胚进行验证。因此，人类类固松不会取代人类概念在 体外研究中的应用 ，但可能会成为通过科学和生物医学发现过程核心以前无法获得的实验方法来汇集研究的强大方式。该协议显示了如何形成人类胚泡，以及如何分析囊体中包含的细胞。

研究方案

国际干细胞研究学会（ISSCR）的干细胞研究和临床转化指南建议，只有在通过专门的科学和伦理审查程序进行审查和批准后，才允许对人类胚泡进行研究3，4。所有实验程序均按照奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）人类研究伦理委员会的指导方针进行，批准Rivron_Stellungnahme_2020-04-22。遵守这些准则对于在科学期刊上发表研究成果是必要的。

1. PXGL条件下人幼稚胚胎干细胞的培养

注意:幼稚的hPSC可以从相关实验室获得。这里使用的线是从Yasuhiro Takashima（目前位于日本京都的CiRA）和Austin Smith（目前位于英国埃克塞特的生命系统研究所）的实验室获得的。或者，朴素的hPSC可以在内部从引物hPSC的行 中 复位，如前所述13，14。对于多个传代，幼稚的hPSCs似乎稳定（>15），但培养的质量可能随时间而变化。如果幼稚 hPSC 的质量降低，请解冻一小瓶新的细胞或从引物的 PSC 中生成 从头 的幼稚 hPSC。对于所有介质成分，请参见 补充表1。

  1. 辐照小鼠胚胎饲养层（MEFs）的制备
    1. 在传代幼稚的hPSCs的前一天，按照下面描述的步骤制备具有辐照MEF层的6孔细胞培养板。
    2. 每孔在PBS中涂有1mL 0.1%明胶的6孔细胞培养板。将板在37°C下孵育30分钟。取出明胶溶液。
    3. 在37°C下制备MEF培养基。
    4. 在37°C的水浴中解冻MEF，直到只剩下一个小冰块。使用P1000移液器用1mL制备的MEF培养基溶解小瓶的体积。
    5. 将细胞悬浮液转移到15 mL管中。以200× g 旋转悬浮液4分钟。吸出上清液并通过加入新鲜的MEF培养基（每孔足以容纳1.5mL）重悬MEF沉淀。
    6. 使用细胞计数载玻片计数细胞，每孔加入300，000个细胞，并将板转移到37°C的常氧培养箱中。
      注意:如果 MEF 随时间推移而分离，则在常规介质更换期间，可以将新的 MEF 添加到 PXGL 介质中。
  2. 人类幼稚多能干细胞的传代
    1. 在传代hPSC之前，在显微镜下检查其形态。菌落通常具有圆顶形形态，具有明亮，清晰的边界。如果单个菌落表现出更扁平的形态，或者分化的菌落开始出现，请按照步骤1.2.8的说明进行操作。
    2. 吸出培养基并用PBS洗涤细胞一次。每孔6孔板加入500μL细胞分离溶液。
    3. 将细胞在37°C下孵育5分钟。 使用P1000移液器并将细胞移液几次以将集落解离成单个细胞。
    4. 收集细胞并将其转移到含有洗涤缓冲液的15mL管中（每孔6孔板1mL）。以200× g 旋转细胞4分钟。
    5. 吸出上清液并将沉淀重悬于新鲜的PXGL培养基中（每孔足以容纳1.5mL）。考虑1:3-1:6的分裂比进行常规传代。
      注意:每3-4次传代后，或者如果细胞培养质量根据细胞形态降低（例如，群体中出现扁平菌落），则在传代后的前24小时内向培养基中加入10μM Y-27632和生长因子基底膜提取物（5μL /孔）。
    6. 在重新电镀hPSCs之前，通过吸出MEF培养基并用PBS洗涤细胞一次来制备具有新鲜MEF的板。然后，使用P1000移液管在含有MEF的6孔板的每孔中转移1.5mLh的hPSCs细胞悬浮液。
      注意:确保移液导致细胞在整个孔区域均匀接种。这将确保细胞具有均匀大小和相对同步的集落的生长。
    7. 在37°C的缺氧条件下在加湿环境中培养hPSCs。24小时后，应连接hPSC。大量非贴壁（或漂浮）细胞反映了传代时的活力或附着问题。
    8. 每天用每孔1.5 mL PXGL培养基更换培养基。每3-4天通过一次hPSCs，或将其用于胚泡形成实验。
      注意:解冻hPSC后，在开始胚层实验之前，将它们传代至少三次。

2. 胚泡的形成

  1. 幼稚 PSC 聚集体的形成
    1. 在开始实验之前，准备并预热PXGL培养基，N2B27基础培养基，洗涤缓冲液，PBS和聚集培养基。按照下面描述的步骤，从hPSCs悬浮液中排除用于形成胚层的MEF。
    2. 对于MEF排除，通过将1mL 0.1%明胶加入6孔板的孔中并在37°C下孵育30-90分钟来制备明胶包被的板。
    3. 要收获细胞，吸出培养基并用1mL PBS洗涤细胞。
    4. 加入500μL细胞分离溶液（每孔6孔板的孔）并在37°C下孵育5分钟。
    5. 在显微镜下检查细胞以跟踪集落解离成单细胞（稍后可以通过温和移液解离一些多细胞团块）。
    6. 用1mL洗涤缓冲液稀释细胞分离溶液。通过轻轻移液5至10次从板中收集细胞。将细胞悬浮液转移到15 mL管中。以200× g 旋转细胞4分钟。
    7. 吸出上清液，将细胞重悬于1.5mL PXGL培养基（每孔6孔板）中，并将细胞接种在明胶包被的平板上以排除MEF，并在37°C下孵育60-90分钟。
    8. 一旦接种幼稚细胞以排除MEF，从微孔中除去PBS并用200μL基底N2B27培养基（每1个微孔芯片）平衡孔，并在37°C下孵育60分钟。
    9. 收集含有未连接的幼稚细胞的上清液，将其转移到15mL管中，并以200× g 旋转细胞4分钟。
    10. 吸出培养基并将细胞重悬于1mL N2B27基础培养基中。使用细胞计数载玻片对细胞进行计数。以200× g 旋转细胞4分钟。
    11. 吸出培养基并加入N2B27培养基中含有的适当量的10μM Y-27632，以获得每50μL30，000个细胞的细胞密度。
      注意:最佳初始接种细胞数量可能因不同细胞系而异。例如，要接种50-60个细胞/微孔，将30，000个细胞（包括考虑到某些细胞落在微孔外的剩余细胞）接种在包含430个微孔的96孔板的1孔中。不适当的起始细胞数可能导致没有空腔的小聚集体形成或形成达到250μm以上的空化结构。
    12. 从平衡的微孔阵列中吸取培养基，并用10μM Y-27632加入25μLN2B27培养基。加入50μL细胞悬浮液并在37°C下孵育15分钟（直到细胞落入微孔底部）。然后，加入125μL补充有10μM Y-27632的N2B27培养基。
  2. 胚层发育
    1. 在24小时内，可以在微孔芯片上观察到幼稚hPSC的聚集体（第0天）。要启动类卵泡形成，请准备PALLY培养基并按照下面概述的步骤进行操作。
    2. 在37°C下预热PALLY培养基30分钟。
      注意:1-油酰赖氨酸（LPA）和10μM Y-27632需要在使用前添加。LPA的最佳浓度在0.5-5μM之间变化。对于用于胚泡的单个 hPSC 管路，必须对其进行滴定。
    3. 吸出聚集培养基。向微孔中加入200μL预热的PALLY培养基。将细胞培养板放回37°C的缺氧培养箱中。 在第 1 天重复更换介质。
    4. 在第2天，取出PALLY培养基并加入200μL补充LPA和10μM Y-27632的N2B27培养基。
      注意:在第2天，大多数聚合继续增长。然而，一些聚集体形成小空腔。从第2天开始，在PALLY中连续培养类卵泡至第4天或在 体外 培养基（IVC1）中培养。然而，在这种培养基变化之后，增强成熟卵泡中PrE的形成。
    5. 在第 3 天重复更换介质。在第4天完全形成胚泡。
      注意:当类胚层基于第7天人类囊胚的形态测量学（例如，直径范围为150-250μm;一个内部簇被滋养外胚层样细胞的上皮包围）并且已经形成极性滋养外胚层样细胞（NR2F2 + / CDX2-）和PrE样细胞（GATA4 +）时，囊状体被认为已经完全发育。这可以通过免疫荧光染色或荧光活化细胞分选（FACS）进行评估。

3. 在96孔超低附着微孔板中形成胚层

  1. 按照上述步骤2.1.1 - 2.1.11准备幼稚的hPSCs细胞悬浮液以形成胚泡。
  2. 吸出培养基并加入适量含有10μM Y-27632的N2B27培养基，以获得每100μL培养基70个细胞的细胞密度。
    注意:最佳初始接种细胞数量可能因不同细胞系而异。例如，70个细胞/孔可能是大多数细胞系的最佳细胞数。
  3. 在室温下以200× g 离心板2分钟，以将细胞聚集在孔底部。
  4. 在缺氧培养条件下在37°C的培养箱中孵育板。在24小时内，可以在孔上观察到幼稚的hPSC的聚集体（第0天）。
  5. 准备 2x 帕利培养基。向孔中加入100μL预热的2x PALLY培养基。
  6. 将细胞培养板放回37°C的缺氧培养箱中。 24小时后，吸出一半的培养基（100μL）并用100μL预热的PALLY培养基替换它。重复该步骤，直到第4天。确保不要吸出骨料。
    注意:在第 2 天，大多数聚合继续增长。然而，一些聚集体具有小的充满液体的空腔。在第4天，大多数空化结构经历完全形态发生以形成囊胚样结构。

4. 滋养层的形成

  1. 对于滋养层的形成，遵循从步骤2.1.1（MEF排除）到步骤2.1.12（播种方案的最后一步）的胚泡形成方案。
  2. 一旦24 h后形成幼稚hPSCs的聚集体，用补充有3μM SC-144的PALY（无LIF）交换聚集培养基，形成代表早期滋养外胚层的滋养层，并用2μM XMU-MP-1补充PALLY形成代表成熟滋养外胚层的滋养层。
  3. 每天刷新培养基。在第4天完全形成滋养层。

5. 使用 scRNAseq 分析胚细胞状态及其反射阶段

  1. 要拾取胚泡并进行解离，请将振荡培养箱加热至37°C并将其设置为100 rpm。
  2. 从初始 96 孔板中收集胚泡，并使用配备玻璃毛细管的口移液管将其转移到 U 型底 96 孔板的多个孔中。
    注意:胚层（>70%）应根据形态测量标准（尺寸= 150-250μm，具有独特的内部团簇）选择，以避免被非胚层结构污染（<30%）。
  3. 使用P200用200μLPBS洗涤一次，方法是在立体显微镜下观察。转移到含有50μL胶原酶的孔中，并在振荡培养箱中孵育30分钟。
  4. 将胚芽转移到装有100μL胰蛋白酶-EDTA的孔中并充分混合。在振荡培养箱中孵育20分钟。
  5. 使用P200移液器将胚泡解离成单细胞。将细胞转移到具有FACS缓冲液（PBS中1%FBS）的15mL管中。
  6. 为了捕获三个谱系的类似物的特定比率，请分别用TROP2和PDGFRa抗体染色TE和PrE类似物。
    注意:与小鼠囊胚相比，人囊胚中PrE细胞的数量较少，这可能反映了通过 体外 受精（IVF）形成的囊胚的发育缺陷或物种差异。在胚泡中，PrE类似物不如TE和EPI类似物丰富，并且在通过免疫荧光成像计数GATA4 +细胞时占细胞的7.4%。此外，解离过程可能会在类卵样蛋白解离，PDGFRa标记和FACS分析时诱导不同细胞类型的比例偏差，如PrE类似物，代表1%-2%的细胞。
  7. 将来自所有三个谱系类似物的FACS细胞分选到384个板中，该板包含用于smart-seq2分析的裂解缓冲液。排除由DAPI染色标记的死细胞（根据制造商的说明进行）。
  8. 为了评估细胞状态（细胞类型和发育阶段），将来自blathoid的转录组数据与适当的对照进行比较。

6. 扩大培养以评估胚泡发育进展

  1. 在基底膜基质涂层板（玻璃底部）上培养人芽样蛋白。
    1. 用基底膜基质涂覆板。
    2. 目视检查胚芽体以评估和记录形态。
      注意:只有具有紧凑型ICM的经典空心球囊胚形态的胚芽才具有进一步生长和发育的潜力。
    3. 每孔96孔板中每孔加入100μLCMRL培养基-1，并将板置于培养箱中至少2小时，然后胚泡转移以进行平衡。
    4. 使用立体显微镜，目视识别具有良好形态的胚芽，将选定的胚泡转移到含有100μlCMRL培养基-1的96孔板中以除去胚层的痕迹。
    5. 将胚泡转移到含有预平衡CMRL介质-1的孔中。将板放入培养箱中并在37°C下孵育过夜。
      注意:在96孔板的一个孔中可以培养多达5个胚芽。单个井中有太多的胚泡可能导致形成多个胚层的聚集体。
    6. 第二天，在显微镜下目视检查胚泡。如果附着了胚泡，则加入100μL预平衡的CMRL培养基-1，并补充5%基底膜基质。将板置于培养箱中并在37°C下孵育过夜。
    7. 第二天，在显微镜下监测胚泡。除去一半的培养基（100μL），并用100μL预平衡的CMRL培养基-2代替，并补充5%基底膜基质。
    8. 在接下来的几天里，用预先平衡的CMRL培养基-3替换一半的培养基（100μL），并补充5%基底膜基质。将板置于培养箱中并在37°C下孵育过夜。每天重复，进行长达4-6天的 体外 培养。
      注意:我们在延长培养条件下将类卵泡培养长达6天，相当于 体外 培养人类胚胎的第13天的时间。

7. 免疫染色类卵泡

  1. 吸出培养基。用PBS洗涤样品3次5分钟。
  2. 在PBS中加入200μL冷的4%多聚甲醛（PFA），并在室温下固定样品30分钟。取出PFA溶液，用PBS洗涤样品3次10分钟。
    注意:如果在微孔芯片上培养胚泡，则将胚泡从芯片转移到96孔U型底板中，以执行以下步骤。
  3. 在每孔100μL封闭溶液（PBS含有0.3%Triton-X 100和10%正常驴血清）中渗透并阻断胚泡60分钟。
    注意:根据抗体的宿主物种，相应地调整血清。
  4. 删除阻止解决方案。加入100μL在新鲜封闭溶液中稀释的一抗，并将样品在4°C下孵育过夜。
    注意:一抗的浓度必须根据制造商的说明确定。
  5. 在PBS（洗涤溶液）中用0.1%Triton-X 100洗涤样品3次10分钟。在封闭溶液中加入100μL二抗以及20μg/ mL Hoechst核染色剂，并在室温下将样品孵育1小时。保护样品免受光照。
    注意:二抗的浓度必须根据制造商的说明确定。
  6. 用洗涤溶液洗涤样品3次10分钟。对于成像，将样品转移到玻璃底μ PBS中。
    注意:应根据用于成像的物镜选择安装介质。例如，PBS中80%的甘油可用于在使用油物镜时安装样品。

结果

通常，在PXGL中培养的幼稚hPSCs（图2A）是聚集和空化结构，在PALLY诱导后48至72小时之间出现，并在96小时内达到150-250μm的直径（图2B）。使用最佳（1）接种细胞数，（2）N2B27的培养前聚集持续时间（0至24小时），（3）单个化学成分（特别是LPA）浓度和（4）PALLY处理的持续时间，诱导效率达到基于形态学参数（总大小150-250μm，单个规则腔，单个内细胞簇）定义的70%-80%; 图2C，D）和三个谱系的存在。次优的初始细胞状态和/或诱导条件将导致低效率或无胚层形成。为了确保最高效率并仅形成植入前类似物，使用纯素 PXGL hPSC 的高质量培养物至关重要。这可以通过FACS测量表面标志物SUSD2（幼稚状态）和CD24（引物状态）阳性细胞的百分比来评估。特定于脱靶的胚胎外谱系（例如，羊膜，胚胎外中胚层）的其他表面标记也将是有用的，但据我们所知，目前尚不可用。如果获得的形成效率低于报告的结果，则仔细检查胚层培养基的所有组分非常重要，特别是在PBS中重建的LPA，并且作为GPCR配体，与在DMSO中重构的合成分子相比，可能更不稳定。在大多数情况下，即使产量不是最大的，空化结构仍然由三个囊胚谱系组成。三个囊胚谱系的出现和胚胎 - 胚胎 - 胚胎轴的形成可以通过标记物的免疫荧光染色（EPI:NANOG，OCT4，TE:GATA3，Polar-TE NR2F2，Mural-TE:CDX2，PrE:GATA4; 图2E，G）。滋养层仅由TE组成，有助于进一步剖析细胞间通讯的作用。滋养层可以在诱导后96小时内以50%-60%的效率形成（图2H，I）。胚泡形成不仅可以在自制的微孔阵列中进行，还可以在市售的超低附着96孔板中进行，并优化诱导条件（参见协议和 图2J）。类胚芽还具有进一步发育6天的能力，这相当于第13天胚胎的时间，具有 体外 分化方案（图2K）。

为了进一步表征胚芽细胞的细胞状态，必须使用单细胞RNA测序技术。UMAP通常用于可视化细胞状态的分布，并对其执行无监督聚类分析以评估单个细胞状态的接近程度。单细胞数据分析中的不同参数会影响细胞在UMAP中的显示方式，从而导致具有不同空间和相对位置和形状的聚类（图3A）。然而，在该分析中，无论用于执行聚类和数据可视化的参数如何，细胞都会显示显着可重复的不同聚类谱，这允许高置信度地区分三个囊胚谱系。我们使用来自不同发育阶段收获的胚胎的细胞作为参考。这些数据集的合并表明，来自胚芽的大多数滋养外胚层类似物与植入前滋养外胚层聚集，但与植入后滋养层没有聚类（图3B）。这些结果也得到了独立财团10的证实。

当在参考图中引入卡内基7期（CS7）胃挤胚胎时，一小群胚细胞（3%）聚集在这些胚胎的中胚层和羊膜谱系中（图3C）。当羊膜样细胞在参考图中引入时，一小群胚泡细胞（<2%）聚集在这种羊膜样细胞中。

总体而言，只有包含单个规则腔，单个内细胞簇，总大小范围为150-250μm，包含三个囊胚谱系的转录组类似物的结构，并且在很大程度上没有其他谱系（例如，羊膜，中胚层，胚外中胚层）被认为是人胚层。

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图 1:生成高保真爆炸体的四种特征和两种方法。请单击此处查看此图的放大版本。

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图2:来自幼稚hPSC聚集体的胚层和滋养层。 （A）相差图像，显示在与辐照MEF共同培养的PXGL培养基中培养的幼稚hPSCs。比例尺:50 μm. （B） 相差图像，显示在具有 500 nM LPA（PALLY 培养基）的非粘附水凝胶微孔阵列上培养的幼稚 hPSCs 聚集体的形态变化。比例尺:200μm.（C）96小时后在微孔阵列上形成的人爆胚层。比例尺:400 μm. （D） 定量由 PALLY 培养条件诱导的含有人胚层的微孔的百分比，其优化的 LPA 浓度来自不同的朴素 hPSC 品系（n = 3 个微孔阵列）。（E） 用EPLAST（EPI）标记物（黄色）NANOG和OCT4对人胚泡进行免疫荧光染色;TE标记（青色）CDX2和GATA3;和原始的内胚层标记（洋红色）SOX17和GATA4。比例尺:100 μm.（H-I）根据OCT4，GATA3和GATA4的免疫荧光染色，定量属于胚泡（96小时）中属于每个谱系的细胞数量（左）和细胞百分比（右）。（G）CDX2（青色）和NR2F2（品红色）的人类胚泡的免疫荧光染色。（F）分别添加3 μM SC144（H）或2 μM XMU-MP-1（I）诱导的微孔阵列上早期和晚期滋养层的相差图像。（J）相差图像，显示用500 nM LPA（PALLY培养基）在超低附着96孔板中培养的幼稚hPSCs聚集体的形态变化。（K）在植入后培养条件下生长的胚芽中的OCT4（黄色），GATA3（青色）和GATA4（品红色）的相差图像（左）和免疫荧光染色（右）6天。比例尺:100 μm。这个数字是根据6，10改编的。 请点击此处查看此图的大图。

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图3:通过单细胞测序表征胚泡的组成。 （A）对来自胚芽体不同时间点（24 h，60 h，96 h），朴素hPSCs，引物hPSCs和hTSC（代表植入后细胞滋养层）的单细胞转录组UMAP进行无监督聚类分析。（B）来自胚泡（96小时），幼稚hPSCs和引物hPSC的细胞转录组的UMAP与植入前，植入期（体外 培养囊胚）和原肠胚形成（卡内基7期，即E16-19之间）阶段的人类胚胎的已发表数据集相结合。单个细胞根据其在人类胚胎（左），胚泡衍生细胞或干细胞（中）中的起源以及无监督聚类分析的结果（右）进行着色。（C）来自胚层，幼稚hPSCs，引物hPSCs的细胞转录组的UMAPs，并与原肠胚形成（卡内基7期，即E16-19之间）胚胎的已发表数据集集成。单个细胞根据其在人类胚胎（左），胚泡衍生细胞或干细胞（中）中的起源以及无监督聚类分析的结果（右）进行着色。这个数字改编自6。 请点击此处查看此图的大图。

补充表1:本研究中使用的所有培养基成分。 请按此下载此表格。

讨论

在本研究中，我们逐步展示了如何使用简单而强大的协议建立具有高效率的人类胚泡。在幼稚的PXGL hPSCs聚集及其三重抑制后，胚泡有效形成（>70%），并在4天内依次产生3个囊胚类似物。如果初始状态为次优，则可能会出现胚泡的效率和质量限制（例如，存在脱靶细胞）。值得注意的是，我们已经测量到PXGL hPSCs含有约5%的细胞，反映了植入后阶段。这些细胞可能会限制高质量胚泡的形成。除了反映囊胚上睑细胞的初始幼稚PXGL状态外，另一个关键因素是用于胚泡形成的培养基。为了快速形成囊胚样细胞并防止脱靶，植入后样细胞的形成，我们提出三重途径抑制（Hippo，ERK，TGF-β）是必不可少的。虽然不同的细胞系在ERK / TGF-β抑制下产生不同的胚泡产量（通常约为10%-20%），但暴露于LPA导致在所有细胞系中形成同样高的胚泡产量，同时使用严格的形态学和谱系规范标准。LPA可能作用于抑制河马途径，这在小鼠和人类中外胚层和滋养外胚层谱系之间的第一个谱系分离中起着关键作用8，51。LPA对胚泡效率的显着改善表明，在胚泡形成过程中，Hippo途径介导的内 - 外细胞规范机制在囊胚中起作用。目前的局限性在于，由于用于在时间等效的第7-13天（囊胚/胚泡形成后）培养人类囊胚或胚泡的方案的亚最优性，我们无法评估我们可以在多大程度上正确模拟植入后的发展。

使用scRNAseq，足够的参考图谱和生物信息学方法可以轻松分析胚泡细胞的转录组学状态。先前，转录组学分析表明，与启动状态相比，在PXGL中培养的hPSCs与囊胚上睑细胞更相似。如果参考图仅包含囊胚阶段细胞，则可能发生数据分析中的局限性。参考图应包括来自植入后胚胎的细胞，以评估潜在的脱靶细胞的存在。在未来，为了对类卵细胞进行基准测试，包括植入前和植入后人类概念的所有组织的参考图将非常有价值。此外，多组学单细胞参考图，例如包括转录组，染色质可及性和DNA甲基化，将进一步提供帮助。最后，标准化的生物信息学方法，定量评估胚胎模型和参考概念细胞之间的相似性，并积极识别脱靶细胞，将进一步有助于无偏倚地分析和比较结果。

总而言之，由河马，TGF-β和ERK途径的三重抑制形成的胚泡具有以下四个特征:1）高效的形态发生，2）谱系规范的正确序列，3）转录组水平上囊胚样细胞的高纯度，4）模拟植入周围发育的能力。胚泡的这些特征将有助于建立囊胚发育和植入的假设，然而，它们并不能概括胚胎发育的早期阶段。与人类囊胚有限的可及性和多功能性相反，胚泡适合于遗传和药物筛查，用于囊胚发育和植入的功能研究。将来，这些基础知识可能有助于改进IVF培养基配方，开发受精后避孕药，并更好地管理早孕。

披露声明

奥地利科学院分子生物技术研究所已提交专利申请EP21151455.9，描述了人类卵形成方案和类卵管 - 子宫内膜相互作用测定。HK，AJ，HHK和NR是该专利的发明人。所有其他作者都声明没有竞争利益。

致谢

该项目已获得欧洲研究理事会（ERC）根据欧盟地平线2020研究和创新计划（ERC-Co赠款协议No.101002317"BLASTOID:早期人类胚胎发生的发现平台"）的资助。H.H.K.由奥地利科学基金会（FWF），Lise Meitner计划M3131-B提供支持。我们感谢Yasuhiro Takashima分享H9和H9-GFP细胞系，以及Austin Smith，Peter Andrews和Ge Guo分享HNES1，Shef6，niPSC 16.2b和cR-NCRM2细胞系。我们感谢侯赛因·巴哈万德（Hossein Baharvand）分享子宫内膜类器官。我们感谢Joshua M. Brickman分享从PrE分化细胞和nEND细胞中分离出的RNA。我们感谢Shankar Srinivas分享胃肠道周围胚胎的单细胞RNA测序数据。我们感谢 Aleksand Bykov 和 Luisa Cochella 为 SMARTSeq2 图书馆准备工作提供的技术帮助。我们感谢IMBA的NGS，Biooptic和干细胞设施提供的关键帮助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal mediain house
DMEM/F12in house
100X N2 supplemenGibco17502048
50X B27 supplementGibco17504044
100X GlutamaxGibco35050038
100 mM Sodium PyruvateGibco11360039
MEM-Non-essential amino acidsGibco11140050
1 M Hepesin house
50 mM 2-MercaptoethanolThermofisher31350010
100X Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP0781
Bovine Serum Albumin solutionSigma-AldrichA7979
PD0325901Medchem expressHY-10254
XAV-939Medchem expressHY-15147
Gö 6983Medchem expressHY-13689
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factorin house
A83-01Medchem expressHY-10432
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA)Peprotech2256236
Y-27632Medchem expressHY-10583
CMRL mediumGibco21530027
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
KnockOut Serum Replacement (KSR)Thermofisher10-828-028
AccutaseBiozymB423201cell detachment solution
GeltrexThermofisherA1413302growth factor basement membrane extract
TROP2 antibodyR&D systemsMAB650
PDGFRα antibodyR&D systemsAF307
SC-144Axon2324
XMU-MP-1Med Chem ExpressHY-100526
Matrigelbasement membrane matrix
Countess cell counting chamber slidesThermo fishercell counting slides
DAPI Staining SolutionMiltenyi Biotec130-111-570

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