从土壤中分离可培养酵母和霉菌以研究真菌种群结构

摘要

该方案是一种有效，快速的方法，可在短短7天内从大量土壤样品中培养酵母菌和 霉菌烟曲霉 。这些方法可以很容易地修改，以适应实验所需的一系列培养基和温度。

摘要

土壤是大量微生物生命的宿主，每克含有多达数十亿个细菌，古菌和真菌细胞。多细胞真菌，如霉菌和单细胞真菌，广义上定义为酵母，在土壤生态系统中作为有机物质的分解者和作为其他土壤居民的食物来源发挥着至关重要的作用。土壤中的真菌物种多样性取决于多种气候因素，如降雨和温度，以及土壤特性，包括有机质，pH值和湿度。缺乏足够的环境采样，特别是在亚洲，非洲，南美洲和中美洲地区，阻碍了土壤真菌群落的表征和新物种的发现。

我们使用约4，000个土壤样本和实验室开发的酵母和霉菌分离方案，对六大洲九个国家的土壤真菌群落进行了表征。该方案首先在液体培养基中对酵母和医学上相关的霉菌 烟曲霉菌进行单独的选择性富集，同时抑制细菌生长。然后将产生的菌落转移到固体培养基中并进一步加工以获得纯培养物，然后进行下游遗传表征。酵母物种同一性 是通过 对核核糖体RNA基因簇的内部转录间隔物（ITS）区域进行测序来建立的，而 烟曲霉菌 的全球种群结构 则通过 微卫星标记分析进行探索。

该协议已成功应用于分离和表征喀麦隆，加拿大，中国，哥斯达黎加，冰岛，秘鲁，新西兰和沙特阿拉伯的土壤酵母菌和 烟曲霉菌 种群。这些发现揭示了对土壤酵母多样性全球模式以及 烟曲霉菌全球种群结构和抗真菌性特征的急需见解。本文介绍了从国际土壤样品中分离酵母菌和 烟曲霉 的方法。

引言

土壤生态系统中的真菌在有机质分解、养分循环和土壤施肥中起着至关重要的作用¹.非培养物（即高通量测序）和培养依赖性方法都广泛用于土壤真菌的研究^2，3。虽然高通量元条形码测序产生的大量数据有助于阐明群落结构和多样性的广泛模式，但依赖于培养的方法可以提供关于真菌群落分类和功能结构的高度互补信息，以及由于纯真菌培养物的可用性，通过下游多样性和功能分析提供更具体的个体生物体概况。

尽管每克土壤很少超过数千个细胞，但酵母（广义上定义为单细胞真菌）是其他土壤居民必不可少的分解者和食物来源^4，5。事实上，酵母可能是寒冷生物圈（如南极洲^大陆6，7）中的主要土壤真菌。土壤也是医学相关酵母菌的主要宿主，这些酵母菌在人类和其他哺乳动物中引起严重的机会性感染⁸。尽管形态相似，酵母菌种类在系统发育上是多样的，并且发生在真菌王国⁹内的两个主要门的丝状真菌中，子囊菌和担子菌科。酵母在真菌条形码基因（核糖体RNA基因簇¹⁰的内部转录间隔（ITS）区域）缺乏明确的DNA特征，这使得它们在宏基因组学研究中与其他真菌难以区分，因此需要使用依赖于培养的方法来分离酵母物种。

实施以下方案是为了表征九个国家的土壤酵母群落，并确定土壤酵母多样性的全球趋势和模式^9，11，12。在研究酵母^2，3等目标生物群时，宏基因组学方法的用途有限。由于其系统发育多样性，酵母不能仅根据DNA序列与其他真菌区分开来。因此，研究酵母群需要继续使用培养物依赖性分离。然而，培养通常要耗时得多，并且需要更多的人员来进行实验。因此，该协议已经过优化和简化，以便在有限的人员内更快地进行处理。培养的主要优点是确定的酵母种类是活酵母而不是死酵母，因此更有可能是真正的土壤居民，而不是土壤中存在的瞬时细胞。据估计，土壤中大约40%的真菌DNA是来自其他环境的污染物，细胞外的污染物，或者来自不再完整的细胞，导致高通量测序方法高估真菌丰富度高达55%¹³。培养依赖性分离可以很容易地确认酵母物种的特性，并具有确保纯培养物用于下游分析的额外好处。事实上，使用这种土壤分离方案鉴定了44种假定的新酵母物种的纯培养物，该方案允许使用一系列方法来详细研究其分类学和功能特性¹⁴.

下面的方案也可用于分离土壤中存在的霉菌，例如 烟曲霉。 烟曲霉 是一种嗜热和腐生霉菌，在土壤中广泛分布全球¹⁵.它已从众多临床和非临床环境中分离出来。非临床采样通常包括空气、有机碎片（堆肥、锯末、郁金香球茎废料）和土壤（农业、花园和天然土壤）^{16、17、18、19}。 烟曲霉菌 是一种人类机会性病原体，可引起一系列感染，统称为曲霉病，影响全球超过800万人^16，20。全球约有300，000人患有侵袭性曲霉病，这是曲霉病最严重的形式¹⁶。根据患者群体、感染部位和抗真菌治疗效果等因素，死亡率可高达 90%。在过去的几十年中，抗真菌疗法的耐药性有所增加，需要临床和环境人群的全球监测工作来追踪这些耐药性基因型^21，22，23。鉴于其在高于50°C的温度下生长的能力，可以利用该温度使用依赖性方法从土壤中选择 烟曲霉 分离物。 烟曲霉菌 分离株通常在九个高度多态的短串联重复（STR）位点进行基因分型，显示菌株²⁴之间具有很高的鉴别力。这些STR基因型可以与先前调查的其他人群进行比较，以追踪 烟曲霉菌 基因型（包括耐药性基因）在世界各地的传播。

下面我们描述了以培养依赖性的方式从土壤样品中快速分离酵母菌和 烟曲霉 的方案。根据每个样品获得的土壤量，土壤样品可以在两个方案之间共享。与从土壤中分离酵母和 烟曲霉菌 的类似方法相比，该方案每获得一个分离物使用的土壤减少了10倍。试图从土壤中分离 出烟曲霉菌 的研究需要每个分离物1至2克土壤，而该方案只需要0.1-0.2克土壤^18，19，25。该协议利用较小的塑料和容器，促进其高通量设计。因此，可以使用更少的空间为培养箱和滚筒等设备处理大量样品。土壤样品可以完全处理，在短短7天内获得分离物。该协议已经过优化，允许每人每天处理多达150-200个样本。

研究方案

注:任何利用国际土壤样品和/或 烟曲霉 孢子和菌丝体的步骤都需要在2级生物（BSCII）的生物安全柜内工作。

1. 从土壤中分离酵母

1. 抗菌和抗真菌溶液的制备
   1. 将氯霉素粉末悬浮在70%乙醇中，以制备50 g / L储备溶液。通过注射器过滤灭菌并储存在4°C。
      注意:这种抗生素将阻止土壤酵母分离过程中大多数细菌的生长。由于氯霉素耐药细菌可能仍在生长，因此在区分酵母菌和细菌时，必须仔细考虑菌落形态。当处理怀疑含有抗生素耐药性细菌菌株的土壤时，可以向培养基中添加额外的抗生素。在从环境土壤中分离酵母时，氯霉素补充培养基中的细菌污染不是一个问题。
   2. 将苯菌基粉末悬浮在DMSO中以制备5 g / L储备溶液。通过注射器过滤灭菌并储存在4°C。
      注意:这种选择性抗真菌药物可防止大多数丝状真菌的生长，而不影响土壤酵母分离过程中的酵母生长^26，27。
2. 培养基和无菌设备的制备
   1. 为了制备YEPD（酵母提取物 - 肽酮 - 葡萄糖）肉汤，将10克酵母提取物，20克肽酮和20克葡萄糖加入1升双蒸馏水中。搅拌至充分混合，并在121°C下高压灭菌40分钟。 在室温下储存直至使用。
   2. 叶氏固体琼脂培养基
      1. 将10克酵母提取物，20克蛋白胨，20克葡萄糖和20克琼脂与1升水混合。充分搅拌混合并在121°C下高压灭菌40分钟。
      2. 充分冷却后，从储备溶液中加入1mL氯霉素和苯菌基，使两种抗菌剂的最终浓度分别达到50mg / L和5mg / L。
      3. 搅拌均匀，倒入直径10厘米的培养皿中。在室温下放置过夜，静置并储存在4°C直至使用。
         注意:从1升YEPD开始，可以浇注大约40个板。
   3. 通过高压灭菌对木制平头涂抹器棒和可重复使用的细胞传播器进行灭菌，并在室温下储存。
3. 在液体肉汤中培养土壤
   1. 准备一组无菌的13 mL培养管，用土壤样品ID标记它们。
   2. 使用血清移液管，将5mL补充氯霉素和苯菌的YEPD肉汤加入每管中。
   3. 在BSCII中工作，使用无菌的木制平头涂抹器将约0.1g的土壤转移到适当的培养管中。
      注意:对每个土壤样品使用新鲜的涂抹器，并在使用后立即丢弃，以避免样品之间的交叉污染。
   4. 将管子牢固地盖在第一个停止处，以防止溢出，但在孵育过程中仍允许空气交换。将培养管在滚筒中孵育24小时，温度被认为是最大化酵母生长的最佳温度。
      注:孵化温度应根据土壤样品原产国的年平均温度决定。例如，在从冰岛分离土壤酵母时，培养管在14°C下孵育，而沙特阿拉伯的土壤在30°C下孵育。 由于酵母在较低温度下生长较慢，孵育时间可能必须延长至72小时。
4. 将上清液转移到固体介质中。
   1. 使用步骤1.2中制备的一组YEPD+氯霉素+苯甲酰琼脂平板，用土壤样品ID标记它们。
   2. 从滚筒中取出步骤1.3中制备的培养管。在BSCII中工作，短暂涡旋管以将可能沉降在底部的土壤颗粒和细胞拉回悬浮液中。
   3. 使用微量移液管，将100μL上清液转移到平板上。使用无菌、可重复使用的细胞扩散器将液体彻底均匀地涂抹在琼脂表面上。
      注意:在10个样本的集合中工作可以显着加快此过程。首先将上清液移液到10个板上，然后进行铺展。对每个样品使用新鲜的撒布机，以避免样品之间的交叉污染。
   4. 将板堆叠在塑料袋中，密封，并在先前用于液体肉汤孵育的相同温度下倒置孵育2-3天，直到微生物生长可见。
5. 检测酵母菌和单个菌落的条纹
   1. 在允许足够的孵育时间（通常为2-3天，但在较低温度下可能需要更长的时间）后，检查BSCII中的板是否有任何酵母生长。寻找易于与细菌和霉菌菌落区分开来的奶油状，圆形，哑光状酵母。
      注意:一些酵母会产生有色色素，可能呈现黑色/棕色，黄色或红色，但它们的整体菌落质地和形状与非色素酵母相似。
   2. 从每个板中选择一个酵母样菌落进行进一步处理。
      注意:如果在单个板上观察到多种类型的形态，请为每种形态类型选择一个代表性菌落。
   3. 使用无菌的木制平头涂抹器棒，将每个选定的菌落转移到新鲜的YEPD + 氯霉素+苯菌基板上，并条纹用于单个菌落。执行三个单独的条纹。
      1. 使用涂抹器棒在板的三分之一处来回划线。开始第二和第三连胜，将涂抹器划过前一条条纹一次。对每条条纹使用新的涂抹棒。
         注:每块分离物使用一块板。使用后立即丢弃涂药器，以避免样品之间的交叉污染。
   4. 将板堆叠在塑料袋中，密封，并在先前使用的相同温度下倒置孵育2-3天，直到单个菌落变得可见。
6. 通过 ITS 测序鉴定酵母菌种
   1. 选择每个土壤分离物分离良好的单个菌落，并在新鲜的YEPD + 氯霉素+苯菌基板上传代，以获得更多的细胞。在先前使用的相同温度下孵育2-3天。
   2. 收获新鲜生长的细胞，并将其悬浮在-80°C冷冻管中，其中含有1mL灭菌的30%甘油，在双蒸馏水中产生细胞悬浮液。将这些悬浮液保持在-80°C作为储备溶液。
   3. 使用新鲜细胞进行集落PCR（聚合酶链反应），引物ITS1（5'TCCGTGAGCTGG 3'）和ITS4（5'TCCTGCTGATGC 3'）进行集落PCR（聚合酶链反应）以扩增真菌条形码基因ITS⁹。使用以下热循环条件:在95°C下进行初始变性步骤10分钟，然后进行35个循环（i）95°C持续30秒，（ii）55°C持续30秒，以及（iii）72°C持续1分钟。
      注意:菌落PCR比DNA提取后进行PCR具有很高的成功率和更快的周转时间。
   4. 如果菌株的菌落PCR反复失败，请使用所选方案提取DNA，并使用提取的基因组DNA作为模板进行ITS PCR（使用与上述相同的热循环条件）。
      注意:建议使用相对便宜的基于氯仿的DNA提取²⁸.
   5. 执行桑格测序以确定每个菌株的扩增ITS区域的DNA序列。
   6. 将获得的酵母菌株的ITS序列与沉积在NCBI GenBank和UNITE等公共数据库中的序列进行比较，以确定物种身份。

2. 从土壤中分离烟曲霉菌

1. 每个土壤样品制备1 mL无菌的萨布罗葡萄糖肉汤（SDB），并补充抗生素氯霉素。
   1. 将10克蛋白胨和20克葡萄糖加入1升蒸馏水中。在121°C高压灭菌40分钟。
   2. 让SDB冷却至~50°C，加入1毫升50克/升氯霉素，使浓度达到50毫克/升。
      注意:氯霉素的制备方法与上述相同，用于酵母分离。除了抑制细菌生长外，氯霉素还可防止细菌产生气体，这些气体将导致管在步骤2.2中详述的孵育步骤中打开。
   3. 使用机械移液管将1 mL SDB无菌地等分到每个土壤样品的1.5 mL微量离心管中。
2. 将土壤加入 1.5 mL 微量离心管中。
   1. 在BSCII内铺设工作台外套或吸收剂衬垫，以帮助处理溢出的土壤。
   2. 使用高压灭菌的涂药棒，将约0.1g的土壤转移到含有1mL SBD的1.5mL微量离心管中。将悬浮土壤在50°C孵育3天。
      注意:不需要在孵育过程中摇动。
3. 接种土壤的肉汤的菌丝收获
   1. 准备麦芽提取物琼脂（MEA）平板。
      1. 每升MEA:在1升蒸馏水中加入20克麦芽提取物，20克葡萄糖，6克蛋白胨和15克琼脂。在121°C高压灭菌40分钟。
      2. 让MEA冷却至~50°C，然后加入1毫升50克/升氯霉素，使最终浓度达到50毫克/升。
   2. 将菌丝体从接种的土壤肉汤转移到MEA板上。
      1. 识别在 SDB 到空气边界处有可见菌丝生长的土壤接种物。
      2. 使用经过消毒的木制平头涂抹器棒将菌丝体转移到MEA板的中心。将MEA板在37°C孵育3天。
4. 选择具有 烟曲 霉菌形态特性的菌丝体。
   1. 鉴定具有 烟曲霉菌 形态特征（绿色绒面革状生长）的霉菌菌落。
   2. 在BSCII中工作时，使用灭菌的木制平头涂抹器棒或接种环通过刮擦表面一次来收获分生孢子/菌丝体。通过将孢子/菌丝体划线到琼脂上以形成单个菌落，将孢子/菌丝体转移到MEA板的中心。在37°C孵育2天。
      注意:由于平板上可能存在多种 烟曲霉菌 菌株和/或其他真菌，因此对单个菌落进行条纹很重要。可以使用酵母分离方案中步骤1.5.3中的单菌落条纹方案。
   3. 使用无菌施用器棒或接种环，通过在菌落上划线一次，将步骤2.4.1.2中产生的单个菌落传代到MEA上。将收获的孢子铺开到板的中心。在37°C孵育2天。
5. 收获 烟曲霉菌 孢子/菌丝体用于培养储存
   1. 准备无菌的30%甘油溶液（对于100mL溶液，加入30mL 100%甘油与70mL双蒸馏水混合，在121°C下灭菌40分钟）。
   2. 在BSCII中工作时，使用p1000移液管吸出1 mL的30%甘油溶液。将1 mL甘油溶液分配到 烟曲霉 菌落上以收获孢子/菌丝体。
      1. 由于 烟曲 霉孢子/菌丝体的疏水性，使用移液器吸头刮擦板的密集孢子区域。
         注意:当甘油在划痕中分配时，甘油会粘附在划痕区域而不是滚动在琼脂上。
      2. 慢慢地将甘油分配到刮擦区域以除去孢子并将其悬浮在甘油溶液中。
      3. 一旦完全分配，轻轻倾斜板并吸出甘油孢子/菌丝体悬浮液。
         注意:大约750至800μL将被吸出。
      4. 将吸出物转移到无菌冷冻管中并储存在-80°C。 如果需要，通过重复步骤 2.5.2.1 至 2.5.2.4 来创建工作库存。
6. 烟曲霉菌菌株的表型鉴定
   1. 使用从步骤2.5.2创建的孢子储备，在水中产生100倍稀释液。
      1. 吸出10μL菌丝和孢子储备，并在990μL水中分配。涡旋悬架。
   2. 将10μL稀释的孢子悬浮液分配到标准显微镜载玻片上。
   3. 可选:用亚甲蓝染色菌丝和孢子悬浮液。
      1. 要用亚甲蓝染色，请将分生孢子和分生孢子固定在载玻片上，将载玻片放在本生燃烧器上直至变干。
      2. 涂抹亚甲蓝1-2分钟，然后用水洗净。
      3. 用吸墨纸擦干载玻片。
   4. 使用400倍放大倍率的复合显微镜，观察悬浮液并定位分生孢子。将观察到的分生孢子团形态与 烟曲霉 分生孢子形态进行比较。
7. 烟曲霉菌菌株的分子鉴定
   1. 按照常见的真菌DNA提取方案从每个分离物中提取DNA。
   2. 使用曲霉菌β-微管蛋白基因（β-tub1和β-4）特异性引物，按照Alcazar-Fuoli等人描述的方案，运行PCR并获得扩增产物的^序列。
      1. 将获得的序列与使用BLAST存储在公共数据库（如NCBI GenBank）中的序列进行比较。
      2. 确认菌株序列与数据库中 的烟曲霉菌 序列最匹配。
   3. 作为步骤2.7.2的替代方法，对靶向 烟曲霉菌 交配型MAT1-1和MAT1-2²⁹进行多重PCR反应。
      1. 在多重PCR反应中使用以下三个引物序列: AFM1:5'-5'-聚乙二醇 AFM2: 5′-3′; AFM3: 5′-3′.
      2. 使用以下热循环器参数:在95°C下5分钟，在95°C下35次循环30秒，在60°C下30秒，在72°C下1分钟，然后在72°C下最后5分钟。
      3. 电泳凝胶电泳识别产品;查找 834 bp MAT-1 或 438 bp MAT1-2。使用已确认交配型扩增的 烟曲霉菌 菌株为阳性和阴性对照。
8. 通过片段分析对 烟曲霉菌 菌株进行微卫星基因分型
   注:尽管下面列出的步骤大致涵盖了在九个微卫星（STR）位点的基因分型 烟曲 霉菌，但只强调了几个重要的考虑因素。有关 烟曲霉菌 STR基因分型的详细信息，请参阅De Valk等人^24，30。
   1. 使用De Valk等人先前描述的STRAf引物制备三种PCR多重预混^液。
      1. 荧光标记前向引物，通过毛细管电泳确定片段大小。确保预混液中正向引物的浓度是反向引物（1 μM）的一半（0.5μM）。
         注意:为获得最佳效果，请使用荧光标记，其吸光度波长与毛细管电泳期间使用的所选染料标准相匹配
      2. 使用热启动聚合酶以获得最佳效果。
      3. 每次反应使用0.1 ng的DNA浓度。
   2. 使用以下PCR程序对每种菌株进行多重PCR:95°C持续10分钟，95°C循环40次30秒，60°C循环30秒，72°C电泳60秒，然后72°C电泳10分钟，并保持在4°C。
   3. 通过凝胶电泳检查扩增产物。
   4. 按照片段分析专家的建议，将产品稀释至所需水平（通常为~50倍），并进行毛细管电泳。对每个菌株进行三次运行，每次运行覆盖三种不同荧光探针的三次多重反应。
   5. 要确定九个STR位点中每个位点的正确片段大小，请使用能够进行片段分析的软件。
      1. 检索从毛细管电泳中获得的原始数据。使用片段分析软件（例如Osiris）根据最大峰值对片段大小进行评分。
      2. 将片段大小转换为九个位点中每个位点的重复数字。使用参考菌株Af293重复数的片段大小，如De Valk等人²⁴所述。
         注意:不同的毛细管电泳平台之间可能会出现片段大小的细微变化。因此，重要的是要包括一个共同的参考菌株（和一个内部梯度），对于基因分型菌株的九个位点中的每一个都有已知的片段大小。

结果

从土壤中分离酵母
实施上述酵母分离方案是为了从来自九个国家的53个地点的土壤样品中培养酵母^9，12。总共从3，826个土壤样品中分离出1，473个酵母菌株。鉴于九个原产国的气候条件不同，每个国家的最佳孵化温度是根据其年平均温度确定的（表1）。鉴于酵母在14°C下生长较慢，将来自冰岛的土壤样品在滚筒上再孵育48小时...

讨论

为从土壤中分离酵母菌和 烟曲霉菌 而开发的方案是一种快速有效的高通量土壤处理和真菌分离方法。该协议只需要每个样品少量的土壤（0.1-0.2g），允许以类似的努力对更多地点进行采样。快速的周转时间确保可以在短时间内获得结果，并允许在必要时进行故障排除和重复实验。该协议可以使用标准微生物学和细胞培养设备在许多实验室环境中轻松复制。但是，当从国际土壤中分离酵母或...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt Inc	72.690.001
Benomyl powder	Toronto Research Chemicals	B161380
Chloramphenicol powder	Sigma-Aldrich	SKU: C0378-5G
Dextrose	Sigma-Aldrich	SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software	NCBI's Osiris		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database	NCBI GenBank		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database	UNITE		https://unite.ut.ee/
Peptone	Sigma-Aldrich	SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes	Sarstedt Inc	83.3902
Sterile 13 mL culture tubes	Sarstedt Inc	62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112
Yeast extract	Sigma-Aldrich	SKU: Y1625-250G