곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

요약

이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.

초록

토양은 엄청난 양의 미생물 생명체의 숙주이며, 각 그램에는 수십억 개의 박테리아, 고고 및 곰팡이 세포가 포함되어 있습니다. 효모로 광범위하게 정의 된 곰팡이 및 단세포 균류와 같은 다세포 균류는 유기 물질의 분해제 및 다른 토양 거주자를위한 식량원으로서 토양 생태계에서 필수적인 역할을 수행합니다. 토양의 곰팡이 종의 다양성은 강우량 및 온도와 같은 다양한 기후 요인뿐만 아니라 유기물, pH 및 수분을 포함한 토양 특성에 달려 있습니다. 특히 아시아, 아프리카, 남미 및 중앙 아메리카 지역에서 적절한 환경 샘플링이 부족하면 토양 곰팡이 공동체의 특성화와 새로운 종의 발견을 방해합니다.

우리는 ~ 4,000 토양 샘플과 효모와 곰팡이의 분리를 위해 실험실에서 개발 된 프로토콜을 사용하여 여섯 대륙의 아홉 개국의 토양 곰팡이 공동체를 특성화했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 성장을 억제하면서 액체 배지에서 효모와 의학적으로 관련된 곰팡이 Aspergillus fumigatus에 대한 별도의 선택적 농축으로 시작됩니다. 생성 된 콜로니는 고체 배지로 옮겨지고 순수한 배양물을 얻기 위해 추가로 처리되고 하류 유전 적 특성화가 뒤 따른다. 효모 종 동일성은 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터의 내부 전사 스페이서 (ITS) 영역의 시퀀싱을 통해 확립되며, A. fumigatus의 글로벌 인구 구조는 마이크로 위성 마커 분석을 통해 탐구됩니다.

이 프로토콜은 카메룬, 캐나다, 중국, 코스타리카, 아이슬란드, 페루, 뉴질랜드 및 사우디 아라비아의 토양 효모 및 A. fumigatus 개체군을 분리하고 특성화하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 발견은 토양 효모 다양성의 글로벌 패턴뿐만 아니라 A. fumigatus의 글로벌 인구 구조 및 항진균 저항 프로파일에 대한 많은 필요한 통찰력을 보여주었습니다. 이 논문은 국제 토양 샘플에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 방법을 제시합니다.

서문

토양 생태계의 곰팡이는 유기물 분해, 영양 순환 및 토양 시비에 필수적인 역할을합니다¹. 배양-독립적(즉, 고처리량 시퀀싱) 및 배양-의존적 접근법 둘 모두는 토양 진균 ^2,3의 연구에 널리 사용된다. 고처리량 메타바코드 시퀀싱에 의해 생성된 다량의 데이터는 공동체 구조와 다양성의 광범위한 패턴을 밝히는 데 유용하지만, 문화 의존적 접근 방식은 순수한 곰팡이 배양의 가용성으로 인해 다운스트림 다양성 및 기능 분석을 통해 개별 유기체의 분류 및 기능 구조에 대한 매우 보완적인 정보뿐만 아니라 개별 유기체의 보다 구체적인 프로파일을 제공할 수 있습니다.

토양 그램 당 수천 개의 세포를 거의 초과하지 않음에도 불구하고, 단세포 균류로 광범위하게 정의 된 효모는 다른 토양 거주자 ^4,5에게 필수적인 분해제 및 식품 공급원입니다. 사실, 효모는 남극 대륙 ^6,7과 같은 차가운 생물권에서 우세한 토양 균류일 수 있다. 토양은 또한 인간과 다른 포유류에 심각한 기회 감염을 일으키는 의학적으로 관련된 효모의 주요 저수지입니다⁸. 형태학적 유사성에도 불구하고, 효모 종은 계통유전학적으로 다양하며, 진균 왕국 내에서 두 개의 주요 필라, Ascomycota 및 Basidiomycota의 필라멘트 진균 사이에서 발생한다⁹. 효모는 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터(¹⁰)의 내부 전사된 스페이서(ITS) 영역인 진균 바코딩 유전자에서 정의된 DNA 시그니처가 결여되어, 메타게놈학 조사에서 다른 진균과 구별할 수 없게 만들고, 따라서 효모 종을 분리하기 위한 배양-의존적 방법의 사용을 필요로 한다.

아래 프로토콜은 9 개국의 토양 효모 공동체를 특성화하고 토양 효모 다양성^9,11,12의 세계적인 추세와 패턴을 식별하기 위해 구현되었습니다. 메타게놈학 접근법은 효모 ^2,3과 같은 유기체의 표적 집단을 연구할 때 제한적으로 ^사용된다. 그들의 계통 발생 다양성으로 인해, 효모는 DNA 서열만으로 다른 곰팡이와 구별 될 수 없습니다. 따라서 효모 개체군을 연구하려면 문화 의존적 격리를 지속적으로 사용해야합니다. 그러나 배양은 종종 훨씬 더 많은 시간이 걸리고 실험을 수행하는 데 더 많은 인력이 필요합니다. 따라서 프로토콜은 제한된 인력으로 더 빠른 처리를 위해 최적화되고 간소화되었습니다. 배양의 가장 큰 장점은 확인 된 효모 종은 죽은 효모가 아닌 살아있는 효모이므로 토양에 존재하는 일시적인 세포보다는 진정한 토양 거주자가 될 가능성이 더 높다는 것입니다. 토양의 곰팡이 DNA의 약 40 %는 다른 환경, 세포 외 오염 물질 또는 더 이상 손상되지 않은 세포에서 나온 것으로 추정되어 곰팡이 풍부도를 55 % 과대 평가하기위한 높은 처리량 시퀀싱 접근법을 유발합니다 ¹³. 배양-의존적 분리는 하류 분석에 사용될 순수한 배양물을 확보하는 추가적인 이점으로 효모 종 동일성을 쉽게 확인할 수 있다. 실제로, 44 추정 새로운 효모 종의 순수한 배양은 분류 및 기능적 특성을 자세히 연구하기 위해 다양한 방법의 사용을 허용하는이 토양 분리 프로토콜을 사용하여 확인되었습니다¹⁴.

아래의 프로토콜은 또한 A. fumigatus와 같은 토양 내에 존재하는 곰팡이를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)는 토양¹⁵에 널리 분포되어 있는 고온성 및 보호성 곰팡이입니다. 그것은 수많은 임상 및 비 임상 환경에서 분리되었습니다. 비임상 샘플링에는 일반적으로 공기, 유기 파편 (퇴비, 톱 먼지, 튤립 전구 폐기물) 및 토양 (농업, 정원 및 자연 토양)^16,17,18,19이 포함됩니다. 아스퍼질러스 후미가투스(Aspergillus fumigatus)는 아스퍼질라증(aspergillosis)이라고 불리는 다양한 감염을 일으키는 인간 기회주의적 병원체로, 전 세계 800만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치고^16,20명에 이른다. 전 세계 약 300,000명의 사람들이 침습성 아스퍼질라증을 앓고 있으며, 이는 아스퍼질라증¹⁶의 가장 심각한 형태입니다. 환자 집단, 감염 부위 및 항진균 요법의 효능과 같은 요인에 따라 사망률은 90 %만큼 높을 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 항진균 요법에 대한 내성이 증가하여 임상 및 환경 인구 모두에서 이러한 내성 유전자형^21,22,23을 추적하기위한 전 세계적인 감시 노력이 필요했습니다. 50 ° C 이상의 온도에서 자랄 수있는 능력을 감안할 때,이 온도는 배양 의존적 인 방법을 사용하여 토양에서 A. fumigatus 분리물을 선택하기 위해 악용 될 수 있습니다. 아스퍼질러스 푸미가투스 단리물은 일반적으로 아홉 개의 고도로 다형성 짧은 탠덤 반복(STR) 유전자좌에서 유전자형화되며, 균주²⁴ 사이에 높은 차별력을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 STR 유전자형은 약물 내성 유전자를 포함한 A. fumigatus 유전자형의 확산을 추적하기 위해 이전에 조사된 다른 개체군과 비교될 수 있다.

아래에서 우리는 효모와 A. fumigatus를 배양 의존적 인 방식으로 토양 샘플에서 신속하게 분리하기위한 프로토콜을 설명합니다. 샘플 당 수득된 토양의 양에 따라, 토양 샘플은 두 프로토콜 사이에서 공유될 수 있다. 토양에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 유사한 방법과 비교하여,이 프로토콜은 얻은 분리 물 당 10 배 적은 토양을 사용합니다. 토양에서 A. fumigatus를 분리하려는 연구는 분리 된 토양 당 1 ~ 2g의 토양을 필요로하지만,이 프로토콜은 0.1-0.2g의 토양^18,19,25 만 필요로합니다. 이 프로토콜은 처리량이 높은 설계를 용이하게 하는 더 작은 플라스틱과 용기를 사용합니다. 따라서 인큐베이터 및 롤러 드럼과 같은 장비를위한 더 적은 공간을 사용하여 더 많은 수의 샘플을 처리 할 수 있습니다. 토양 샘플은 7 일 이내에 분리 물을 얻기 위해 완전히 처리 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 1 인당 하루에 최대 150-200 개의 샘플을 처리 할 수 있도록 최적화되었습니다.

프로토콜

참고 : 국제 토양 샘플 및 / 또는 A. fumigatus 포자 및 균사체를 활용하는 모든 단계는 레벨 2 유기체 (BSCII)의 생물 안전 캐비닛 내에서 작업해야합니다.

1. 토양에서 효모의 분리

1. 항균 및 항진균 용액의 제조
   1. 클로람페니콜 분말을 70% 에탄올에 현탁하여 50g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
      참고 :이 항생제는 토양 효모 격리 중에 대부분의 박테리아의 성장을 방지합니다. 클로람페니콜 내성 박테리아가 여전히 성장할 수 있기 때문에, 효모와 박테리아를 구별할 때 콜로니 형태학을 신중하게 고려해야 합니다. 항생제 내성 박테리아 균주를 함유하는 것으로 의심되는 토양으로 작업할 때 추가적인 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 클로람페니콜이 보충된 배지의 세균 오염은 효모를 환경 토양에서 분리할 때 발생하는 문제가 되지 않았습니다.
   2. 베노밀 분말을 DMSO에 현탁하여 5 g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
      참고 :이 선택적 항진균제는 토양 효모 분리^26,27 동안 효모 성장에 영향을 미치지 않고 대부분의 필라멘트 성 곰팡이의 성장을 방지합니다.
2. 문화 배지 및 멸균 장비의 제조
   1. YEPD(Yeast Extract-Peptone-Dextrose) 국물을 제조하기 위해, 이중 증류수 1 L에 효모 추출물 10 g, 펩톤 20 g 및 덱스트로스 20 g을 첨가한다. 잘 섞일 때까지 교반하고 121°C에서 40분 동안 오토클레이브한다. 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.
   2. YEPD 고체 한천 배지
      1. 효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 덱스트로스 20g, 한천 20g을 물 1L에 섞는다. 잘 섞어 잘 저어주고 121°C에서 40분 동안 오토클레이브한다.
      2. 충분히 냉각되면 스톡 용액에서 클로람페니콜과 베노밀 1mL를 첨가하여 두 항균제의 최종 농도를 각각 50mg/L 및 5mg/L로 높입니다.
      3. 저어주면서 잘 섞어서 직경 10cm 페트리 접시에 붓는다. 실온에서 밤새 방치하고 사용 전까지 4°C에서 보관한다.
         참고 : YEPD 1L에서 약 40 개의 플레이트를 부을 수 있습니다.
   3. 나무로 된 일반 팁이 달린 어플리케이터 스틱과 재사용 가능한 셀 스프레더를 오토클레이빙으로 살균하고 실온에서 보관하십시오.
3. 액체 국물에 토양의 부화
   1. 멸균 13 mL 배양 튜브 세트를 토양 샘플 ID로 라벨링하여 준비한다.
   2. 혈청 학적 피펫을 사용하여 클로람페니콜과 베노밀로 보충 된 YEPD 국물 5 mL를 각 튜브에 첨가하십시오.
   3. BSCII에서 작업하면서 ~0.1g의 토양을 멸균된 목재 일반 팁 어플리케이터를 사용하여 적절한 배양 튜브로 옮깁니다.
      참고: 각 토양 샘플에 대해 신선한 어플리케이터를 사용하고 시료 간의 교차 오염을 방지하기 위해 사용 즉시 폐기하십시오.
   4. 유출을 방지하기 위해 튜브를 첫 번째 정류장에 단단히 고정시키지만 인큐베이션 중에는 공기 교환을 허용합니다. 배양 튜브를 효모 성장을 최대화하는데 최적으로 간주되는 온도에서 24 h 동안 롤러 드럼에서 인큐베이션한다.
      참고 : 배양 온도는 토양 샘플의 원산지 국가의 평균 연간 온도를 기준으로 결정되어야합니다. 예를 들어, 아이슬란드로부터 토양 효모를 분리할 때, 배양 튜브는 14°C에서 인큐베이션된 반면, 사우디아라비아로부터의 토양은 30°C에서 인큐베이션되었다. 더 낮은 온도에서 효모 성장이 느려지기 때문에 배양 시간을 최대 72 시간까지 연장해야 할 수도 있습니다.
4. 상청액을 고체 배지로 옮긴다.
   1. 단계 1.2에서 제조된 YEPD + 클로람페니콜 + 베노밀 한천 플레이트의 세트를 사용하여, 이들을 토양 샘플 ID로 라벨링한다.
   2. 단계 1.3에서 제조된 배양 튜브를 롤러 드럼으로부터 분리한다. BSCII에서 작업하면서 튜브를 간단히 와류하여 바닥에 정착했을 수있는 토양 입자와 세포를 다시 현탁액으로 그립니다.
   3. 마이크로피펫을 사용하여, 100 μL의 상청액을 플레이트 상으로 옮긴다. 멸균 된 재사용 가능한 세포 스프레더를 사용하여 액체를 한천 표면 위로 철저하고 고르게 퍼뜨립니다.
      참고: 10개의 샘플 세트로 작업하면 이 프로세스 속도가 크게 빨라질 수 있습니다. 상층액을 먼저 10 개의 플레이트 상에 피펫 한 다음 확산을 수행하십시오. 샘플 간의 교차 오염을 피하기 위해 각 샘플에 대해 신선한 스프레더를 사용하십시오.
   4. 플레이트를 비닐 봉지에 쌓고, 밀봉하고, 미생물 성장이 보일 때까지 액체 배양에 이전에 사용된 것과 동일한 온도에서 2-3일 동안 거꾸로 배양한다.
5. 효모의 검출 및 단일 식민지에 대한 줄무늬
   1. 충분한 인큐베이션 시간 (일반적으로 2-3 일, 그러나 더 낮은 온도에서 더 오래 걸릴 수 있음)을 허용 한 후, BSCII에서 플레이트를 검사하여 효모 성장이 있는지 검사하십시오. 박테리아 및 곰팡이 식민지와 쉽게 구별되는 크림 같은 둥글고 무광택 같은 효모를 찾으십시오.
      참고 : 일부 효모는 착색 안료를 생성하고 검은 색 / 갈색, 노란색 또는 빨간색으로 나타날 수 있지만 전반적인 식민지 질감과 모양은 비 색소 효모와 유사합니다.
   2. 추가 처리를 위해 각 플레이트에서 하나의 효모 같은 콜로니를 선택하십시오.
      참고: 단일 플레이트에서 둘 이상의 형태학이 관찰되는 경우, 각 형태학적 유형에 대해 하나의 대표적인 콜로니를 선택하십시오.
   3. 멸균 된 나무 일반 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 선택한 각 식민지를 신선한 YEPD + 클로람페니콜 + 베노밀 플레이트로 옮기고 단일 식민지에 줄무늬를 만듭니다. 세 개의 개별 줄무늬를 수행합니다.
      1. 어플리케이터 스틱을 사용하여 플레이트의 세 번째 위에 앞뒤로 줄무늬를 놓습니다. 두 번째 및 세 번째 줄무늬를 앞의 줄무늬에 걸쳐 어플리케이터를 한 번 줄무늬로 시작합니다. 모든 줄무늬에 대해 새로운 어플리케이터 스틱을 사용하십시오.
         주: 분리형당 하나의 플레이트를 사용하십시오. 샘플 간의 교차 오염을 피하기 위해 사용시 즉시 어플리케이터를 폐기하십시오.
   4. 접시를 비닐 봉지에 쌓고, 밀봉하고, 단일 식민지가 보일 때까지 이전에 사용 된 것과 동일한 온도에서 2-3 일 동안 거꾸로 배양하십시오.
6. ITS 시퀀싱을 통한 효모 종 확인
   1. 토양 당 잘 분리된, 단일 콜로니를 선택하여 분리하고, 신선한 YEPD + 클로람페니콜 + 베노밀 플레이트 상에 계대배양하여 더 많은 세포를 얻었다. 이전에 사용한 것과 동일한 온도에서 2-3일 동안 배양한다.
   2. 갓 성장한 세포를 수확하고 이를 이중 증류수에 멸균된 30% 글리세롤 1 mL를 함유하는 -80°C 냉동고 튜브에 현탁시켜 세포 현탁액을 생성한다. 이러한 현탁액을 원액으로서 -80°C에서 유지한다.
   3. 신선한 세포를 사용하여 프라이머 ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') 및 ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATGATGC 3')로 콜로니 PCR (중합 효소 연쇄 반응)을 수행하여 곰팡이 바코딩 유전자 인 ITS⁹를 증폭시킵니다. 다음의 열순환 조건을 사용하십시오: 95°C에서 10분 동안 초기 변성 단계, 이어서 (i) 30초 동안 95°C, (ii) 30초 동안 55°C, 및 (iii) 1분 동안 72°C의 35 사이클이 뒤따른다.
      참고: 콜로니 PCR은 DNA 추출에 이어 PCR보다 높은 성공률과 빠른 처리 시간을 가지고 있습니다.
   4. 균주에 대해 콜로니 PCR이 반복적으로 실패하는 경우, 선택한 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출하고 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 ITS PCR을 수행한다(위와 동일한 열순환 조건 사용).
      참고 : 비교적 저렴한 클로로포름 기반 DNA 추출이 권장됩니다²⁸.
   5. 생어 시퀀싱을 수행하여 각 균주에 대해 증폭된 ITS 영역의 DNA 서열을 결정한다.
   6. 효모 균주의 수득된 ITS 서열을 NCBI GenBank 및 UNITE와 같은 공개 데이터베이스에 기탁된 서열과 비교하여 종 동일성을 확립한다.

2. 토양에서 아스퍼질러스 후미가투스의 분리

1. 토양 시료 당 항생제 클로람페니콜이 보충된 멸균 Sabouraud 덱스트로스 브로스 (SDB) 1 mL를 준비하십시오.
   1. 펩톤 10g과 덱스트로스 20g을 증류수 1L에 첨가한다. 121°C에서 40분 동안 오토클레이브.
   2. SDB를 ~ 50 °C까지 식히고 50 g / L 클로람페니콜 1 mL를 첨가하여 농도를 50 mg / L로 유지하십시오.
      참고: 클로람페니콜은 효모 분리를 위해 상기 기재된 바와 동일하게 제조된다. 박테리아 성장을 억제하는 것 외에도, 클로람페니콜은 또한 단계 2.2에 설명된 배양 단계 동안 튜브가 열리게 하는 박테리아로부터의 가스 생성을 방지한다.
   3. 무균적으로 분취량 1 mL의 SDB를 기계적 피펫을 사용하여 토양 샘플 당 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 넣는다.
2. 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 토양을 추가하십시오.
   1. BSCII 내부에 벤치 코트 또는 흡수성 패딩을 깔아 엎질러진 토양을 처리하십시오.
   2. 오토클레이브 어플리케이터 스틱을 사용하여 약 0.1g의 토양을 1mL의 SBD가 들어있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브와 볼텍스를 닫습니다. 부유 토양을 50°C에서 3일 동안 인큐베이션한다.
      참고: 인큐베이션 중 흔들림은 필요하지 않습니다.
3. 토양 접종 국물의 균사 수확
   1. 맥아 추출물 한천 (MEA) 플레이트를 준비하십시오.
      1. MEA 1 리터 당 : 맥아 추출물 20g, 덱스트로스 20g, 펩톤 6g, 한천 15g을 증류수 1L에 첨가하십시오. 121°C에서 40분 동안 오토클레이브.
      2. MEA를 ~ 50 °C까지 식힌 다음 50 g / L 클로람페니콜 1 mL를 첨가하여 50 mg / L의 최종 농도로 유지하십시오.
   2. 균사체를 토양 접종 국물에서 MEA 플레이트로 옮깁니다.
      1. SDB에서 공기 경계까지 균사체 성장을 보이는 토양 접종물을 확인하십시오.
      2. 멸균 된 목재 일반 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 균사체를 MEA 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. MEA 플레이트를 3일 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
4. A. fumigatus 형태 학적 특성을 가진 균사체의 선택.
   1. 특징적인 A. fumigatus 형태 학적 특성 (성장과 같은 녹색 스웨이드)을 가진 곰팡이 식민지를 확인하십시오.
   2. BSCII에서 일하면서 멸균 된 목재 일반 팁 어플리케이터 스틱 또는 접종 루프를 사용하여 표면을 한 번 긁어 코니디아 / 균사체를 수확하십시오. 포자 / 균사체를 단일 식민지를 위해 한천에 묶어서 MEA 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. 37°C에서 2일 동안 인큐베이션한다.
      참고 : 여러 A. fumigatus 균주 및 / 또는 다른 곰팡이가 플레이트에 존재할 수 있으므로 단일 식민지에 대해 줄무늬를 두는 것이 중요합니다. 효모 분리 프로토콜에서 단계 1.5.3에서 단일 콜로니 스트레킹 프로토콜이 사용될 수 있다.
   3. 멸균 어플리케이터 스틱 또는 접종 루프를 사용하여, 단계 2.4.1.2에서 생성된 단일 콜로니를 콜로니를 1회 스트레킹함으로써 MEA 상에 계대배양한다. 수확 된 포자를 플레이트의 중앙에 퍼뜨립니다. 37°C에서 2일 동안 인큐베이션한다.
5. 문화 저장을위한 A. fumigatus 포자 / 균사체 수확
   1. 멸균 30% 글리세롤 용액을 제조하였다(100 mL 용액의 경우, 이중 증류수 70 mL와 혼합된 100% 글리세롤 30 mL를 가하고, 121°C에서 40분 동안 멸균).
   2. BSCII에서 작업하면서 p1000 피펫을 사용하여 30% 글리세롤 용액 1mL를 흡인합니다. 글리세롤 용액 1mL를 A. fumigatus 콜로니에 분배하여 포자/균사체를 수확합니다.
      1. A. fumigatus 포자 / 균사체의 소수성으로 인해 피펫 팁을 사용하여 플레이트의 조밀하게 다공 된 영역을 긁으십시오.
         참고 : 글리세롤이 스크래치에 분배 될 때, 글리세롤은 한천 위로 굴러 가지 않고 스크래치 영역에 부착됩니다.
      2. 글리세롤을 스크래치 부위에 천천히 분배하여 포자를 제거하고 글리세롤 용액에 현탁시킵니다.
      3. 일단 완전히 분배되면, 가볍게 플레이트를 팁하고 글리세롤 포자 / 균사체 현탁액을 흡인하십시오.
         참고: 약 750 내지 800 μL가 흡인될 것이다.
      4. 흡인물을 멸균 냉동고 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관한다. 필요한 경우 2.5.2.1에서 2.5.2.4 단계를 반복하여 작업 스톡을 만듭니다.
6. A. fumigatus 균주의 표현형 동정
   1. 단계 2.5.2로부터 생성된 포자 스톡을 사용하여, 물에 100x 희석물을 생성한다.
      1. 균사 및 포자 스톡의 10 μL를 흡인하고 990 μL의 물에 분배한다. 서스펜션을 소용돌이치십시오.
   2. 희석된 포자 현탁액 10 μL를 표준 현미경 슬라이드 상에 분주한다.
   3. 선택 사항: 균사체 및 포자 현탁액을 메틸렌 블루로 얼룩지게하십시오.
      1. 메틸렌 블루로 염색하려면 건조 될 때까지 Bunsen 버너 위로 슬라이드를 통과시켜 코니디아와 conidiophores를 슬라이드에 고정하십시오.
      2. 메틸렌 블루를 1-2 분 동안 바르고 물로 씻어 내십시오.
      3. 얼룩진 종이로 슬라이드를 말립니다.
   4. 400x 배율의 복합 현미경을 사용하여 현탁액을보고 conidiophores를 찾습니다. 관찰된 conidiophore 형태학을 A. fumigatus conidiophore 형태학과 비교한다.
7. A. 후미가투스 균주의 분자 동정
   1. 일반적인 곰팡이 DNA 추출 프로토콜에 따라 각 분리물에서 DNA를 추출하십시오.
   2. 아스퍼질러스 β-튜불린 유전자 (β-tub1 및 β-tub4)에 특이적인 프라이머를 사용하여, PCR을 실행하고, Alcazar-Fuoli et ^al.17에 의해 기술된 프로토콜에 따라 증폭된 산물에 대한 서열을 얻는다.
      1. 얻어진 서열을 BLAST를 사용하여 NCBI GenBank와 같은 공공 데이터베이스에 기탁된 서열과 비교한다.
      2. 균주 서열이 데이터베이스에서 A. fumigatus 서열과 가장 일치하는지 확인하십시오.
   3. 단계 2.7.2에 대한 대안으로, A. 훈증 짝짓기 유형 MAT1-1 및 MAT1-2²⁹를 표적으로 하는 멀티플렉스 PCR 반응을 실행한다.
      1. 멀티플렉스 PCR 반응에서 다음의 세 개의 프라이머 서열을 사용한다: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5'-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3'; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3'.
      2. 다음 열순환기 파라미터를 사용하십시오: 95°C에서 5분, 95°C에서 30초의 35사이클, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분 전에 72°C에서 최종 5분.
      3. 생성물을 확인하기 위해 겔 전기영동을 실행; 834 bp MAT-1 또는 438 bp MAT1-2를 찾으십시오. 짝짓기 유형 증폭을 양성 및 음성 대조군으로 확인한 A. fumigatus 균주를 사용하십시오.
8. 단편 분석을 통한 A. fumigatus 균주의 미세위성 지노타이핑
   참고: 아래 나열된 단계는 아홉 개의 미세위성(STR) 유전자좌에서 A. fumigatus의 지노타이핑을 광범위하게 다루지만, 몇 가지 중요한 고려 사항만 강조되었습니다. A. fumigatus STR 유전자형에 대한 자세한 내용은 De Valk et ^al.24,30을 참조하십시오.
   1. De Valk et ^al.24에 의해 이전에 기술된 STRAf 프라이머를 사용하여 세 개의 PCR 멀티플렉스 마스터 믹스를 준비한다.
      1. 전방 프라이머를 형광 표지하여 모세관 전기영동을 통해 단편 크기를 결정한다. 정방향 프라이머의 농도가 마스터 믹스 내의 역방향 프라이머(1 μM)의 절반(0.5 μM)인지 확인한다.
         참고: 최상의 결과를 얻으려면 모세관 전기영동 중에 사용된 선택된 염료 표준과 일치하는 흡광도 파장이 있는 형광 라벨을 사용하십시오.
      2. 최상의 결과를 위해 핫스타트 중합효소를 사용하십시오.
      3. 반응 당 0.1 ng의 DNA 농도를 사용하십시오.
   2. 다음의 PCR 프로그램을 사용하여 각 균주에 대해 멀티플렉스 PCR을 실행한다: 10분 동안 95°C, 30초 동안 95°C의 40 사이클, 30초 동안 60°C, 및 60초 동안 72°C, 이어서 72°C에서 10분 동안 유지하고, 4°C에서 유지시킨다.
   3. 겔 전기영동을 통해 증폭된 산물을 확인한다.
   4. 단편 분석 전문가가 권장하는대로 제품을 원하는 수준 (일반적으로 ~ 50x)으로 희석하고 모세관 전기 영동을 실행하십시오. 각 균주에 대해 세 번의 실행을 수행하며, 각 실행은 세 개의 서로 다른 형광 프로브로 세 개의 다중화 된 반응을 덮습니다.
   5. 아홉 개의 STR 유전자좌 각각에 대한 정확한 단편 크기를 결정하려면 단편 분석이 가능한 소프트웨어를 사용하십시오.
      1. 모세관 전기영동으로부터 얻은 미가공 데이터를 검색한다. 단편 분석 소프트웨어(예를 들어, 오시리스)를 사용하여 가장 큰 피크를 기준으로 단편 크기를 점수화한다.
      2. 조각 크기를 아홉 개의 유전자좌 각각에 대해 반복 숫자로 변환합니다. De Valk et al.24에 의해 이전에 기술된 바와 같이 참조 균주 Af293의 반복 수의 단편 크기를 사용한다.
         참고: 단편 크기의 약간의 변화는 상이한 모세관 전기영동 플랫폼 사이에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 유전자형 균주를 위한 아홉 개의 유전자좌 각각에 대해 공지된 단편 크기를 갖는 공통 참조 균주(및 내부 사다리)를 포함하는 것이 중요하다.

결과

토양으로부터의 효모 분리
상기 효모 분리 프로토콜은 ^{9,12개국 9,12}개국의 53개 지역에서 유래한 토양 샘플로부터 효모를 배양하기 위해 구현되었다. 전체적으로, 1,473개의 효모 균주가 3,826개의 토양 샘플로부터 분리되었다. 아홉 개의 원산지 국가의 상이한 기후 조건을 고려할 때, 각 국가의 최상의 배양 온도는 그것의 평균 연간 온도에 ?...

토론

토양에서 효모와 A. fumigatus 를 분리하기 위해 개발 된 프로토콜은 높은 처리량의 토양 처리 및 곰팡이 격리를위한 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜은 샘플 당 소량의 토양 (0.1-0.2g) 만 필요하므로 비슷한 노력으로 더 많은 사이트를 샘플링 할 수 있습니다. 빠른 처리 시간을 통해 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있으며 필요한 경우 문제 해결 및 반복 실험을 위한 시간을 허용합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt Inc	72.690.001
Benomyl powder	Toronto Research Chemicals	B161380
Chloramphenicol powder	Sigma-Aldrich	SKU: C0378-5G
Dextrose	Sigma-Aldrich	SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software	NCBI's Osiris		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database	NCBI GenBank		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database	UNITE		https://unite.ut.ee/
Peptone	Sigma-Aldrich	SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes	Sarstedt Inc	83.3902
Sterile 13 mL culture tubes	Sarstedt Inc	62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112
Yeast extract	Sigma-Aldrich	SKU: Y1625-250G