Isolamento di lieviti e muffe coltivabili dai terreni per studiare la struttura della popolazione fungina

Riepilogo

Questo protocollo è un metodo efficace e veloce per coltivare lieviti e la muffa Aspergillus fumigatus da grandi serie di campioni di terreno in appena 7 giorni. I metodi possono essere facilmente modificati per adattarsi a una gamma di mezzi di incubazione e temperature necessarie per gli esperimenti.

Abstract

Il suolo ospita un'incredibile quantità di vita microbica, con ogni grammo contenente fino a miliardi di cellule batteriche, archeali e fungine. I funghi multicellulari come muffe e funghi unicellulari, ampiamente definiti come lieviti, svolgono ruoli essenziali negli ecosistemi del suolo come decompositori di materiale organico e come fonti di cibo per altri abitanti del suolo. La diversità delle specie fungine nel suolo dipende da una moltitudine di fattori climatici come precipitazioni e temperatura, nonché dalle proprietà del suolo tra cui materia organica, pH e umidità. La mancanza di un adeguato campionamento ambientale, specialmente nelle regioni dell'Asia, dell'Africa, del Sud America e dell'America centrale, ostacola la caratterizzazione delle comunità fungine del suolo e la scoperta di nuove specie.

Abbiamo caratterizzato le comunità fungine del suolo in nove paesi in sei continenti utilizzando circa 4.000 campioni di suolo e un protocollo sviluppato in laboratorio per l'isolamento di lieviti e muffe. Questo protocollo inizia con l'arricchimento selettivo separato per i lieviti e la muffa clinicamente rilevante Aspergillus fumigatus, in mezzi liquidi mentre inibisce la crescita batterica. Le colonie risultanti vengono quindi trasferite in mezzi solidi e ulteriormente elaborate per ottenere colture pure, seguite dalla caratterizzazione genetica a valle. L'identità delle specie di lievito viene stabilita attraverso il sequenziamento della loro regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster genico dell'RNA ribosomiale nucleare, mentre la struttura della popolazione globale di A. fumigatus viene esplorata tramite l'analisi dei marcatori di microsatelliti.

Il protocollo è stato applicato con successo per isolare e caratterizzare le popolazioni di lievito del suolo e A. fumigatus in Camerun, Canada, Cina, Costa Rica, Islanda, Perù, Nuova Zelanda e Arabia Saudita. Questi risultati hanno rivelato approfondimenti tanto necessari sui modelli globali nella diversità del lievito del suolo, nonché sulla struttura della popolazione globale e sui profili di resistenza antifungina di A. fumigatus. Questo documento presenta il metodo per isolare sia i lieviti che A. fumigatus da campioni di suolo internazionali.

Introduzione

I funghi negli ecosistemi del suolo svolgono ruoli essenziali nella decomposizione della materia organica, nel ciclo dei nutrienti e nella fertilizzazione del suolo¹. Sia gli approcci indipendenti dalla coltura (cioè il sequenziamento ad alto rendimento) che gli approcci dipendenti dalla coltura sono ampiamente utilizzati nello studio dei funghi del suolo ^2,3. Mentre la grande quantità di dati generati dal sequenziamento del metabarcodo ad alto rendimento è utile per chiarire modelli su larga scala nella struttura e nella diversità della comunità, l'approccio dipendente dalla cultura può fornire informazioni altamente complementari sulle strutture tassonomiche e funzionali delle comunità fungine, nonché profili più specifici dei singoli organismi attraverso la diversità a valle e le analisi funzionali dovute alla disponibilità di colture fungine pure.

Nonostante raramente superino migliaia di cellule per grammo di terreno, i lieviti, ampiamente definiti come funghi unicellulari, sono decompositori e fonti di cibo essenziali per altri abitanti del suolo ^4,5. In effetti, i lieviti possono essere i funghi del suolo predominanti nelle biosfere fredde come l'Antartide continentale ^6,7. Il suolo è anche un serbatoio primario di lieviti rilevanti dal punto di vista medico che causano gravi infezioni opportunistiche negli esseri umani e in altri mammiferi⁸. Nonostante le somiglianze morfologiche, le specie di lievito sono filogeneticamente diverse e si trovano tra i funghi filamentosi in due phyla principali, Ascomycota e Basidiomycota, all'interno del regno fungino⁹. I lieviti mancano di una firma del DNA che definisce il gene del codice a barre fungino, la regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster¹⁰ del gene dell'RNA ribosomiale nucleare, rendendoli indistinguibili da altri funghi nelle indagini di metagenomica e quindi rendendo necessario l'uso di metodi dipendenti dalla coltura per isolare le specie di lievito.

Il protocollo seguente è stato implementato per caratterizzare le comunità di lieviti del suolo di nove paesi e identificare tendenze e modelli globali nella diversità del lievito del suolo ^9,11,12. Gli approcci di metagenomica sono di utilità limitata quando si studiano gruppi mirati di organismi come i lieviti ^2,3. A causa della loro diversità filogenetica, i lieviti non possono essere distinti da altri funghi basati sulla sola sequenza di DNA. Pertanto, lo studio delle popolazioni di lieviti richiede l'uso continuato dell'isolamento dipendente dalla cultura. Tuttavia, la coltivazione è spesso significativamente più dispendiosa in termini di tempo e richiede più personale per eseguire gli esperimenti. Pertanto, il protocollo è stato ottimizzato e semplificato per un'elaborazione più rapida con personale limitato. Il vantaggio principale della coltivazione è che le specie di lievito identificate sono lieviti vivi e non morti, e quindi hanno maggiori probabilità di essere veri abitanti del suolo piuttosto che cellule transitorie presenti nei terreni. È stato stimato che circa il 40% del DNA fungino nel suolo sono contaminanti provenienti da altri ambienti, extracellulari, o provengono da cellule che non sono più intatte, causando approcci di sequenziamento ad alto rendimento per sovrastimare la ricchezza fungina fino al 55%¹³. L'isolamento dipendente dalla coltura può facilmente confermare l'identità delle specie di lievito con l'ulteriore vantaggio di garantire la coltura pura da utilizzare nelle analisi a valle. In effetti, colture pure di 44 nuove specie di lievito putativo sono state identificate utilizzando questo protocollo di isolamento del suolo che ha permesso l'uso di una serie di metodi per studiare le loro proprietà tassonomiche e funzionali in dettaglio¹⁴.

Il protocollo riportato di seguito può essere utilizzato anche per isolare le muffe presenti all'interno del suolo, come A. fumigatus. Aspergillus fumigatus è una muffa termofila e saprofita con un'ampia distribuzione globale nel suolo¹⁵. È stato isolato da numerosi ambienti clinici e non clinici. Il campionamento non clinico include comunemente aria, detriti organici (compost, segatura, rifiuti di bulbi di tulipani) e suolo (terreni agricoli, da giardino e naturali)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus è un patogeno opportunistico umano che causa una serie di infezioni collettivamente definite aspergillosi, che colpiscono oltre 8 milioni di persone in tutto il mondo^16,20. Circa 300.000 persone in tutto il mondo soffrono di aspergillosi invasiva, che è la forma più grave di aspergillosi¹⁶. A seconda di fattori come la popolazione di pazienti, il sito di infezione e l'efficacia della terapia antifungina, il tasso di mortalità può arrivare fino al 90%. Negli ultimi decenni, la resistenza alle terapie antifungine è aumentata, richiedendo sforzi di sorveglianza globale sia nelle popolazioni cliniche che ambientali per tracciare questi genotipi di resistenza 21,22,23. Data la sua capacità di crescere a temperature superiori a 50 °C, questa temperatura può essere sfruttata per selezionare isolati di A. fumigatus dal suolo utilizzando metodi dipendenti dalla coltura. Gli isolati di Aspergillus fumigatus sono comunemente genotipizzati in nove loci a ripetizione tandem breve (STR) altamente polimorfici, che hanno dimostrato di avere un elevato potere discriminatorio tra i ceppi²⁴. Questi genotipi STR possono essere confrontati con altre popolazioni precedentemente intervistate per tracciare la diffusione dei genotipi di A. fumigatus, compresi i geni di resistenza ai farmaci, in tutto il mondo.

Di seguito descriviamo un protocollo per il rapido isolamento di lieviti e A. fumigatus da campioni di terreno in modo dipendente dalla coltura. A seconda della quantità di terreno ottenuta per campione, i campioni di terreno possono essere condivisi tra i due protocolli. Rispetto a metodi simili che isolano il lievito e A. fumigatus dal suolo, questo protocollo utilizza 10 volte meno terreno per isolato ottenuto. Gli studi che tentano di isolare A. fumigatus dal suolo richiedono tra 1 e 2 g di terreno per isolato, mentre questo protocollo richiede solo 0,1-0,2 g di^{terreno 18,19,25}. Questo protocollo utilizza plastiche e contenitori più piccoli che facilitano la sua progettazione ad alta produttività. Pertanto, un numero maggiore di campioni può essere elaborato utilizzando meno spazio per attrezzature come incubatori e tamburi a rulli. I campioni di terreno possono essere completamente elaborati per ottenere isolati in appena 7 giorni. Questo protocollo è stato ottimizzato per consentire l'elaborazione di un massimo di 150-200 campioni al giorno a persona.

Protocollo

NOTA: Qualsiasi passaggio che utilizzi campioni internazionali di suolo e/o spore e miceli di A. fumigatus richiede di lavorare all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello 2 (BSCII).

1. Isolamento del lievito dal terreno

1. Preparazione di soluzioni antibatteriche e antifungine
   1. Sospendere la polvere di cloramfenicolo in etanolo al 70% per preparare una soluzione madre da 50 g/L. Sterilizzare mediante filtrazione a siringa e conservare a 4 °C.
      NOTA: Questo antibiotico impedirà la crescita della maggior parte dei batteri durante l'isolamento del lievito del suolo. Poiché i batteri resistenti al cloramfenicolo possono ancora crescere, la morfologia delle colonie deve essere attentamente presa in considerazione quando si distinguono i lieviti dai batteri. Ulteriori antibiotici possono essere aggiunti ai mezzi quando si lavora con terreno sospettato di contenere ceppi batterici resistenti agli antibiotici. La contaminazione batterica nei mezzi integrati con cloramfenicolo non è stato un problema riscontrato durante l'isolamento dei lieviti dai terreni ambientali.
   2. Sospendere la polvere di benomil in DMSO per preparare una soluzione madre da 5 g/L. Sterilizzare mediante filtrazione a siringa e conservare a 4 °C.
      NOTA: Questo farmaco antifungino selettivo previene la crescita della maggior parte dei funghi filamentosi senza influenzare la crescita del lievito durante l'isolamento del lievito nel suolo^26,27.
2. Preparazione di terreni di coltura e attrezzature sterili
   1. Per preparare il brodo YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose), aggiungere 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone e 20 g di destrosio a 1 L di acqua a doppia distillazione. Mescolare fino a quando ben miscelato e autoclave per 40 minuti a 121 °C. Conservare a temperatura ambiente fino all'uso.
   2. YEPD medio agar solido
      1. Mescolare 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di destrosio e 20 g di agar in 1 L di acqua. Mescolare bene per mescolare e autoclave per 40 minuti a 121 °C.
      2. Una volta sufficientemente raffreddato, aggiungere 1 mL di cloramfenicolo e benomil dalle soluzioni madre per portare le concentrazioni finali dei due antimicrobici rispettivamente a 50 mg/L e 5 mg/L.
      3. Mescolare bene mescolando e versare in piastre di Petri da 10 cm di diametro. Lasciare a temperatura ambiente durante la notte per impostare e conservare a 4 °C fino all'uso.
         NOTA: Da 1 L di YEPD, è possibile versare circa 40 piastre.
   3. Sterilizzare i bastoncini applicatori in legno a punta semplice e gli spandicellulari riutilizzabili mediante autoclave e conservare a temperatura ambiente.
3. Incubazione del terreno in brodo liquido
   1. Preparare un set di tubi di coltura sterili da 13 ml etichettandoli con ID campione di terreno.
   2. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 5 ml di brodo YEPD integrato con cloramfenicolo e benomil in ciascun tubo.
   3. Lavorando in un BSCII, trasferire ~ 0,1 g di terreno nel tubo di coltura appropriato utilizzando un applicatore sterile a punta semplice in legno.
      NOTA: utilizzare un applicatore fresco per ogni campione di terreno e scartare immediatamente dopo l'uso per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
   4. Chiudere saldamente il tubo fino alla prima fermata per evitare fuoriuscite, ma consentire comunque lo scambio d'aria durante l'incubazione. Incubare i tubi di coltura in un tamburo a rulli per 24 ore a una temperatura ritenuta ottimale per massimizzare la crescita del lievito.
      NOTA: la temperatura di incubazione deve essere decisa in base alla temperatura media annua del paese di origine dei campioni di suolo. Ad esempio, quando si isolavano i lieviti del suolo dall'Islanda, i tubi di coltura venivano incubati a 14 °C, mentre i terreni dell'Arabia Saudita venivano incubati a 30 °C. A causa della crescita più lenta del lievito a temperature più basse, il tempo di incubazione potrebbe dover essere esteso fino a 72 ore.
4. Trasferire il surnatante sul mezzo solido.
   1. Utilizzando il set di piastre YEPD + cloramfenicolo + benomyl agar preparate nella fase 1.2, etichettarle con l'ID del campione di terreno.
   2. Rimuovere i tubi di coltura preparati nel passaggio 1.3 dal tamburo del rullo. Lavorando in un BSCII, ruota brevemente il tubo per attirare particelle di terreno e cellule che potrebbero essersi depositate nella parte inferiore in sospensione.
   3. Utilizzando una micropipetta, trasferire 100 μL del surnatante su una piastra. Utilizzare uno spandicelle sterile e riutilizzabile per distribuire il liquido in modo completo e uniforme sulla superficie dell'agar.
      NOTA: lavorare in set di 10 campioni può accelerare significativamente questo processo. Pipettare prima il surnatante su 10 piastre e poi eseguire lo spreading. Utilizzare uno spanditore fresco per ogni campione per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
   4. Impilare le piastre in sacchetti di plastica, sigillare e incubare a testa in giù per 2-3 giorni alla stessa temperatura utilizzata in precedenza per l'incubazione del brodo liquido fino a quando la crescita microbica è visibile.
5. Rilevazione di lieviti e striature per singole colonie
   1. Dopo aver concesso un tempo di incubazione sufficiente (in genere 2-3 giorni, ma può richiedere più tempo a temperature più basse), ispezionare le piastre in un BSCII per qualsiasi crescita di lievito. Cerca lieviti cremosi, rotondi, opachi che si distinguono facilmente dalle colonie batteriche e muffe.
      NOTA: Alcuni lieviti producono pigmenti colorati e possono apparire neri / marroni, gialli o rossi, ma la loro consistenza e forma complessiva della colonia sarebbero simili ai lieviti non pigmentati.
   2. Seleziona una colonia simile al lievito da ogni piatto per un'ulteriore lavorazione.
      NOTA: se si osserva più di un tipo di morfologia su una singola piastra, selezionare una colonia rappresentativa per ciascun tipo morfologico.
   3. Utilizzando bastoncini di applicatore sterili e in legno a punta semplice, trasferire ogni colonia selezionata su una piastra YEPD + cloramfenicolo + benomil fresco e una striscia per singole colonie. Eseguire tre strisce separate.
      1. Striscia avanti e indietro oltre un terzo della piastra usando un bastoncino applicatore. Iniziare la seconda e la terza striscia strisciando l'applicatore attraverso la striscia precedente una volta. Utilizzare un nuovo applicatore stick per ogni striscia.
         NOTA: utilizzare una piastra per isolato. Scartare gli applicatori immediatamente dopo l'uso per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
   4. Impilare le piastre in sacchetti di plastica, sigillare e incubare a testa in giù per 2-3 giorni alla stessa temperatura utilizzata in precedenza fino a quando le singole colonie diventano visibili.
6. Identificazione delle specie di lievito tramite sequenziamento ITS
   1. Seleziona una singola colonia ben separata per isolato di terreno e sottocoltura su una piastra fresca YEPD + cloramfenicolo + benomil per ottenere più cellule. Incubare per 2-3 giorni alla stessa temperatura utilizzata in precedenza.
   2. Raccogliere le cellule appena coltivate e sospenderle in tubi congelatori a -80 °C contenenti 1 mL di glicerolo al 30% sterilizzato in acqua a doppia distillazione per creare sospensioni cellulari. Mantenere queste sospensioni a -80 °C come soluzioni di serie.
   3. Utilizzare cellule fresche per eseguire la PCR della colonia (reazione a catena della polimerasi) con primer ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') per amplificare il gene del codice a barre fungino, ITS⁹. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclizzazione: una fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 10 minuti seguita da 35 cicli di (i) 95 °C per 30 s, (ii) 55 °C per 30 s e (iii) 72 °C per 1 min.
      NOTA: La PCR della colonia ha un alto tasso di successo e un tempo di consegna più rapido rispetto all'estrazione del DNA seguita dalla PCR.
   4. Se la PCR della colonia fallisce ripetutamente per un ceppo, estrarre il DNA utilizzando il protocollo di scelta ed eseguire la PCR ITS utilizzando il DNA genomico estratto come modello (utilizzare le stesse condizioni di termociclismo di cui sopra).
      NOTA: Si raccomanda un'estrazione del DNA a base di cloroformio relativamente economica²⁸.
   5. Eseguire il sequenziamento Sanger per determinare la sequenza di DNA della regione ITS amplificata per ciascun ceppo.
   6. Confrontare la sequenza ITS ottenuta dei ceppi di lievito con le sequenze depositate in database pubblici come NCBI GenBank e UNITE per stabilire l'identità delle specie.

2. Isolamento di Aspergillus fumigatus dal suolo

1. Preparare 1 mL di brodo sterile di destrosio Sabouraud (SDB) integrato con l'antibiotico cloramfenicolo per campione di terreno.
   1. Aggiungere 10 g di peptone e 20 g di destrosio a 1 L di acqua distillata. Autoclave a 121 °C per 40 min.
   2. Lasciare raffreddare l'SDB a ~50 °C, aggiungere 1 mL di cloramfenicolo da 50 g/L per portare la concentrazione a 50 mg/L.
      NOTA: Il cloramfenicolo viene preparato come descritto sopra per l'isolamento del lievito. Oltre a inibire la crescita batterica, il cloramfenicolo impedisce anche la produzione di gas dai batteri che causerà l'apertura dei tubi durante la fase di incubazione descritta nel passaggio 2.2.
   3. Aliquota asettica di 1 mL di SDB in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per campione di terreno utilizzando una pipetta meccanica.
2. Aggiungere terreno a tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
   1. Posare il panca o l'imbottitura assorbente all'interno di un BSCII per aiutare nello smaltimento del terreno versato.
   2. Utilizzando bastoncini applicatori autoclavati, trasferire circa 0,1 g di terreno in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di SBD. Chiudere il tubo e il vortice. Incubare il terreno sospeso a 50 °C per 3 giorni.
      NOTA: non è necessario agitare durante l'incubazione.
3. Raccolta miceliale del brodo inoculato dal suolo
   1. Preparare piatti di agar estratto di malto (MEA).
      1. Per litro di MEA: aggiungere 20 g di estratto di malto, 20 g di destrosio, 6 g di peptone e 15 g di agar a 1 L di acqua distillata. Autoclave a 121 °C per 40 min.
      2. Lasciare raffreddare il MEA a ~50 °C, quindi aggiungere 1 mL di cloramfenicolo da 50 g/L per portare ad una concentrazione finale di 50 mg/L.
   2. Trasferire il micelio dal brodo inoculato al suolo su piastre MEA.
      1. Identificare gli inoculi del suolo che hanno una crescita miceliale visibile al confine tra SDB e aria.
      2. Utilizzare bastoncini di applicazione in legno sterilizzato per trasferire i miceli al centro di una piastra MEA. Incubare le piastre MEA a 37 °C per 3 giorni.
4. Selezione di miceli con proprietà morfologiche di A. fumigatus .
   1. Identificare le colonie di muffe che hanno caratteristiche proprietà morfologiche di A. fumigatus (crescita simile alla pelle scamosciata verde).
   2. Lavorando in un BSCII, utilizzare bastoncini applicatori in legno sterilizzato o un anello di inoculazione per raccogliere conidi / miceli raschiando la superficie una volta. Trasferire le spore/miceli al centro di una placca MEA strisciando sull'agar per singole colonie. Incubare a 37 °C per 2 giorni.
      NOTA: Poiché sulla piastra possono essere presenti più ceppi di A. fumigatus e/o altri funghi, è importante strisciare per singole colonie. È possibile utilizzare il protocollo di streaking a colonia singola nella fase 1.5.3 nel protocollo di isolamento del lievito.
   3. Utilizzando un bastoncino applicatore sterile o un ciclo di inoculazione, sottoculturare una singola colonia generata nella fase 2.4.1.2 su MEA strisciando la colonia una volta. Distribuire le spore raccolte al centro del piatto. Incubare a 37 °C per 2 giorni.
5. Raccolta di spore/miceli di A. fumigatus per la conservazione in coltura
   1. Preparare una soluzione sterile di glicerolo al 30% (per una soluzione da 100 ml, aggiungere 30 ml di glicerolo al 100% miscelato con 70 ml di acqua a doppia distillazione, sterilizzato a 121 °C per 40 minuti).
   2. Lavorando in un BSCII, utilizzare una pipetta p1000 per aspirare 1 mL della soluzione di glicerolo al 30%. Erogare 1 mL di soluzione di glicerolo sulla colonia di A. fumigatus per raccogliere spore/miceli.
      1. A causa dell'idrofobicità delle spore / miceli di A. fumigatus , utilizzare la punta della pipetta per graffiare una regione densamente sporulata della piastra.
         NOTA: Quando il glicerolo viene erogato nel graffio, il glicerolo aderisce all'area del graffio piuttosto che rotolare sull'agar.
      2. Erogare lentamente il glicerolo sulla zona del graffio per rimuovere le spore e sospenderle nella soluzione di glicerolo.
      3. Una volta completamente erogato, capovolgere leggermente la piastra e aspirare la sospensione di spore di glicerolo / micelio.
         NOTA: verranno aspirati circa 750-800 μL.
      4. Trasferire l'aspirato in un tubo congelatore sterile e conservare a -80 °C. Se necessario, creare materiale di lavoro ripetendo i passaggi da 2.5.2.1 a 2.5.2.4.
6. Identificazione fenotipica di ceppi di A. fumigatus
   1. Utilizzando il calcio di spore creato dal passaggio 2.5.2, creare una diluizione 100x in acqua.
      1. Aspirare 10 μL delle scorte miceliali e spore ed erogare in 990 μL di acqua. Vortice la sospensione.
   2. Erogare 10 μL della sospensione di spore diluite su un vetrino standard per microscopio.
   3. OPTIONAL: Colorare la sospensione miceliale e sporica con blu di metilene.
      1. Per macchiare con blu di metilene, fissare i conidi e i conidiofori alla diapositiva passando la diapositiva su un bruciatore Bunsen fino a quando non si asciuga.
      2. Applicare il blu di metilene per 1-2 minuti e lavare con acqua.
      3. Asciugare la diapositiva con carta assorbente.
   4. Utilizzando un microscopio composto con ingrandimento 400x, visualizzare la sospensione e individuare i conidiofori. Confrontare la morfologia conidiofora osservata con la morfologia conidiofora di A. fumigatus .
7. Identificazione molecolare di ceppi di A. fumigatus
   1. Estrarre il DNA da ciascun isolato seguendo i comuni protocolli di estrazione del DNA fungino.
   2. Utilizzando primer specifici per i geni Aspergillus β-tubulina (β-tub1 e β-tub4), eseguire la PCR e ottenere la sequenza per i prodotti amplificati, seguendo i protocolli descritti da Alcazar-Fuoli et ^al.17.
      1. Confronta le sequenze ottenute con le sequenze depositate in database pubblici come NCBI GenBank usando BLAST.
      2. Verificare che le sequenze di deformazione corrispondano in modo ottimale alle sequenze di A. fumigatus nel database.
   3. In alternativa al passaggio 2.7.2, eseguire una reazione MULTIPLEX PCR mirata ai tipi di accoppiamento A. fumigatus MAT1-1 e MAT1-2²⁹.
      1. Utilizzare le seguenti tre sequenze di primer nella reazione MULTIPLEX PCR: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCGCCACG-3′.
      2. Utilizzare i seguenti parametri del termociclatore: 5 min a 95 °C, 35 cicli da 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C prima di un ultimo 5 min a 72 °C.
      3. Eseguire l'elettroforesi su gel per identificare i prodotti; cercare 834 bp MAT-1 o 438 bp MAT1-2. Utilizzare ceppi di A. fumigatus che hanno confermato l'amplificazione del tipo di accoppiamento come controlli positivi e negativi.
8. Genotipizzazione di microsatelliti di ceppi di A. fumigatus attraverso l'analisi dei frammenti
   NOTA: Sebbene i passaggi elencati di seguito riguardino ampiamente la genotipizzazione di A. fumigatus in nove loci di microsatelliti (STR), sono state evidenziate solo alcune considerazioni importanti. Per i dettagli sulla genotipizzazione STR di A. fumigatus, fare riferimento a De Valk et ^al.24,30.
   1. Preparare tre master mix multiplex PCR utilizzando i primer STRAf precedentemente descritti da De Valk et ^al.24.
      1. Etichettare fluorescentemente i primer in avanti per determinare la dimensione del frammento attraverso l'elettroforesi capillare. Assicurarsi che la concentrazione dei primer in avanti sia la metà (0,5 μM) di quella dei primer inversi (1 μM) all'interno della miscela master.
         NOTA: per ottenere i migliori risultati, utilizzare etichette fluorescenti con lunghezze d'onda di assorbanza che corrispondono a quelle dello standard di colorante scelto utilizzato durante l'elettroforesi capillare
      2. Utilizzare la polimerasi a caldo per ottenere i migliori risultati.
      3. Utilizzare una concentrazione di DNA di 0,1 ng per reazione.
   2. Eseguire la MULTIPLEX PCR per ogni ceppo utilizzando il seguente programma PCR: 95 °C per 10 min, 40 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 60 s, seguiti da 72 °C per 10 min e una tenuta a 4 °C.
   3. Verificare la presenza di prodotti amplificati tramite elettroforesi su gel.
   4. Diluire i prodotti al livello desiderato (in genere ~ 50x) come raccomandato dagli specialisti di analisi dei frammenti ed eseguire l'elettroforesi capillare. Eseguire tre cicli per ogni ceppo, con ogni corsa che copre tre reazioni multiplexate con tre diverse sonde fluorescenti.
   5. Per determinare la dimensione corretta del frammento per ciascuno dei nove loci STR, utilizzare un software in grado di analizzare i frammenti.
      1. Recuperare i dati grezzi ottenuti dall'elettroforesi capillare. Assegna un punteggio alle dimensioni dei frammenti in base al picco più grande utilizzando il software di analisi dei frammenti (ad esempio, Osiride).
      2. Convertire le dimensioni dei frammenti in numeri ripetuti per ciascuno dei nove loci. Utilizzare le dimensioni dei frammenti dei numeri di ripetizione del ceppo di riferimento Af293 come precedentemente descritto da De Valk et ^al.24.
         NOTA: Lievi variazioni nelle dimensioni dei frammenti possono verificarsi tra diverse piattaforme di elettroforesi capillare. Pertanto, è importante includere un ceppo di riferimento comune (e una scala interna) con dimensioni note del frammento per ciascuno dei nove loci per i ceppi di genotipizzazione.

Risultati

Isolamento del lievito dal suolo
Il protocollo di isolamento del lievito di cui sopra è stato implementato per coltivare lieviti da campioni di terreno provenienti da 53 località in nove paesi ^9,12. In totale, 1.473 ceppi di lievito sono stati isolati da 3.826 campioni di suolo. Date le diverse condizioni climatiche dei nove paesi di origine, la migliore temperatura di incubazione per ciascun paese è stata determinata in base alla sua tempe...

Discussione

Il protocollo sviluppato per isolare lieviti e A. fumigatus dal suolo è un metodo rapido ed efficiente per la lavorazione del suolo ad alto rendimento e l'isolamento fungino. Il protocollo richiede solo una piccola quantità di terreno (0,1-0,2 g) per campione, consentendo di campionare più siti con uno sforzo simile. I tempi di consegna rapidi assicurano che i risultati possano essere ottenuti in un breve lasso di tempo e consentono di risolvere i problemi e ripetere gli esperimenti, se necessario. Questo pro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt Inc	72.690.001
Benomyl powder	Toronto Research Chemicals	B161380
Chloramphenicol powder	Sigma-Aldrich	SKU: C0378-5G
Dextrose	Sigma-Aldrich	SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software	NCBI's Osiris		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database	NCBI GenBank		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database	UNITE		https://unite.ut.ee/
Peptone	Sigma-Aldrich	SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes	Sarstedt Inc	83.3902
Sterile 13 mL culture tubes	Sarstedt Inc	62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112
Yeast extract	Sigma-Aldrich	SKU: Y1625-250G