АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол является эффективным, быстрым методом культивирования дрожжей и плесени Aspergillus fumigatus из больших наборов образцов почвы всего за 7 дней. Методы могут быть легко модифицированы для размещения диапазона инкубационных сред и температур по мере необходимости для экспериментов.

Аннотация

Почва является домом для невероятного количества микробной жизни, причем каждый грамм содержит до миллиардов бактериальных, архейных и грибковых клеток. Многоклеточные грибы, такие как плесень и одноклеточные грибы, широко определяемые как дрожжи, выполняют важную роль в почвенных экосистемах в качестве разлагателей органического материала и в качестве источников пищи для других почвенных жителей. Грибковое разнообразие в почве зависит от множества климатических факторов, таких как количество осадков и температура, а также свойства почвы, включая органическое вещество, рН и влагу. Отсутствие адекватного отбора проб окружающей среды, особенно в регионах Азии, Африки, Южной Америки и Центральной Америки, препятствует характеристике почвенных грибковых сообществ и открытию новых видов.

Мы охарактеризовали сообщества почвенных грибов в девяти странах на шести континентах, используя ~ 4000 образцов почвы и протокол, разработанный в лаборатории для выделения дрожжей и плесени. Этот протокол начинается с раздельного селективного обогащения дрожжей и значимой с медицинской точки зрения плесени Aspergillus fumigatus в жидких средах при ингибировании роста бактерий. Полученные колонии затем переносятся в твердые среды и далее обрабатываются для получения чистых культур с последующей генетической характеристикой. Идентичность видов дрожжей устанавливается путем секвенирования их внутренней транскрибированной спейсерной области (ITS) кластера генов ядерной рибосомальной РНК, в то время как глобальная популяционная структура A. fumigatus исследуется с помощью анализа микросателлитных маркеров.

Протокол был успешно применен для изоляции и характеристики популяций почвенных дрожжей и A. fumigatus в Камеруне, Канаде, Китае, Коста-Рике, Исландии, Перу, Новой Зеландии и Саудовской Аравии. Эти результаты выявили столь необходимую информацию о глобальных моделях разнообразия почвенных дрожжей, а также о глобальной структуре населения и профилях устойчивости к противогрибковым препаратам A. fumigatus. В данной работе представлен метод выделения как дрожжей, так и A. fumigatus из международных образцов почвы.

Введение

Грибы в почвенных экосистемах играют важную роль в разложении органического вещества, круговороте питательных веществ и удобрениипочвы 1. При изучении почвенных грибов 2,3 широко используются как культурозависимые (т.е. высокопроизводительное секвенирование), так и культурозависимые подходы. В то время как большой объем данных, генерируемых высокопроизводительным секвенированием метабаркода, полезен для выяснения широкомасштабных закономерностей в структуре и разнообразии сообществ, зависящий от культуры подход может обеспечить весьма взаимодополняющую информацию о таксономических и функциональных структурах грибковых сообществ, а также более конкретные профили отдельных организмов посредством последующего разнообразия и функционального анализа из-за наличия чистых грибковых культур.

Несмотря на то, что дрожжи, широко определяемые как одноклеточные грибы, редко превышают тысячи клеток на грамм почвы, являются важными разлагателями и источниками пищи для других жителей почвы 4,5. Фактически, дрожжи могут быть преобладающими почвенными грибами в холодных биосферах, таких как континентальная Антарктида 6,7. Почва также является основным резервуаром медицински значимых дрожжей, которые вызывают серьезные оппортунистические инфекции у людей и других млекопитающих8. Несмотря на морфологическое сходство, виды дрожжей филогенетически разнообразны и встречаются среди нитевидных грибов в двух основных типах, Ascomycota и Basidiomycota, в грибковом царстве9. Дрожжи не имеют определяющей днк-сигнатуры в гене штрихкодирования грибов, области внутреннего транскрибированного спейсера (ITS) кластера генов ядерной рибосомальной РНК10, что делает их неотличимыми от других грибов в исследованиях метагеномики и, таким образом, требует использования культурозависимых методов для выделения видов дрожжей.

Приведенный ниже протокол был реализован для характеристики почвенных дрожжевых сообществ девяти стран и выявления глобальных тенденций и закономерностей в разнообразии почвенных дрожжей 9,11,12. Подходы метагеномики имеют ограниченное применение при изучении целевых групп организмов, таких как дрожжи 2,3. Из-за их филогенетического разнообразия дрожжи не могут быть отличимы от других грибов только по последовательности ДНК. Таким образом, изучение популяций дрожжей требует постоянного использования культурозависимой изоляции. Тем не менее, культивирование часто значительно более трудоемко и требует большего количества персонала для выполнения экспериментов. Поэтому протокол был оптимизирован и оптимизирован для более быстрой обработки с ограниченным персоналом. Основным преимуществом культивирования является то, что идентифицированные виды дрожжей являются живыми дрожжами, а не мертвыми, и, таким образом, с большей вероятностью будут истинными обитателями почвы, а не переходными клетками, присутствующими в почвах. Было подсчитано, что примерно 40% грибковой ДНК в почве являются либо загрязняющими веществами из других сред, внеклеточных, либо поступают из клеток, которые больше не являются неповрежденными, что приводит к высокопроизводительному секвенированию подходов к переоценке грибкового богатства на целых 55% 13. Культурозависимая изоляция может легко подтвердить идентичность видов дрожжей с дополнительным преимуществом обеспечения чистой культуры для использования в последующих анализах. Действительно, чистые культуры 44 предполагаемых новых видов дрожжей были идентифицированы с использованием этого протокола изоляции почвы, что позволило использовать ряд методов для детального изучения их таксономических и функциональных свойств14.

Приведенный ниже протокол также может быть использован для выделения плесени, присутствующей в почве, такой как A. fumigatus. Aspergillus fumigatus представляет собой термофильную и сапрофитную плесень с широким глобальным распространением в почве15. Он был выделен из многочисленных клинических и неклинических сред. Доклинический отбор проб обычно включает воздух, органический мусор (компост, опилки, отходы луковиц тюльпанов) и почву (сельскохозяйственные, садовые и естественные почвы)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus является оппортунистическим патогеном человека, вызывающим ряд инфекций, в совокупности называемых аспергиллезом, затрагивая более 8 миллионов человек во всем мире16,20. Приблизительно 300 000 человек во всем мире страдают от инвазивного аспергиллеза, который является наиболее тяжелой формой аспергиллеза16. В зависимости от таких факторов, как популяция пациентов, место инфекции и эффективность противогрибковой терапии, смертность может достигать 90%. За последние несколько десятилетий устойчивость к противогрибковой терапии возросла, что потребовало глобальных усилий по эпиднадзору как в клинических, так и в экологических популяциях для отслеживания этих генотипов резистентности 21,22,23. Учитывая его способность расти при температурах выше 50 ° C, эта температура может быть использована для отбора изолятов A. fumigatus из почвы с использованием методов, зависящих от культуры. Изоляты Aspergillus fumigatus обычно генотипируются в девяти высокополиморфных локусах короткого тандемного повтора (STR), которые, как показано, обладают высокой дискриминирующей силой между штаммами24. Эти генотипы STR можно сравнить с другими ранее обследованными популяциями для отслеживания распространения генотипов A. fumigatus, включая гены лекарственной устойчивости, по всему миру.

Ниже мы опишем протокол для быстрого выделения дрожжей и A. fumigatus из образцов почвы в зависимости от культуры. В зависимости от количества почвы, полученной на образец, образцы почвы могут быть разделены между двумя протоколами. По сравнению с аналогичными методами, которые изолируют дрожжи и A. fumigatus из почвы, этот протокол использует в 10 раз меньше почвы на полученный изолят. Исследования, направленные на изоляцию A. fumigatus от почвы, требуют от 1 до 2 г почвы на изолят, тогда как этот протокол требует только 0,1-0,2 г почвы 18,19,25. Этот протокол использует меньшие пластмассы и контейнеры, которые облегчают его высокопроизводительную конструкцию. Поэтому большее количество образцов может быть обработано с использованием меньшего пространства для оборудования, такого как инкубаторы и роликовые барабаны. Образцы почвы могут быть полностью обработаны для получения изолятов всего за 7 дней. Этот протокол был оптимизирован, чтобы позволить обрабатывать до 150-200 образцов в день на человека.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Любые этапы с использованием международных образцов почвы и/или спор и мицелия A. fumigatus требуют работы в шкафу биобезопасности для организмов уровня 2 (BSCII).

1. Выделение дрожжей из почвы

  1. Приготовление антибактериальных и противогрибковых растворов
    1. Суспендировать порошок хлорамфеникола в 70% этаноле для приготовления спиртового раствора 50 г/л. Стерилизуют шприцевой фильтрацией и хранят при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот антибиотик предотвратит рост большинства бактерий во время выделения почвенных дрожжей. Поскольку устойчивые к хлорамфениколу бактерии все еще могут расти, морфология колонии должна тщательно учитываться при различении дрожжей от бактерий. Дополнительные антибиотики могут быть добавлены в среду при работе с почвой, подозреваемой в содержании устойчивых к антибиотикам бактериальных штаммов. Бактериальное загрязнение в средах, дополненных хлорамфениколом, не было проблемой, возникающей при выделении дрожжей из экологических почв.
    2. Суспендировать беномиловый порошок в ДМСО для приготовления 5 г/л бульонного раствора. Стерилизуют шприцевой фильтрацией и хранят при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот селективный противогрибковый препарат предотвращает рост большинства нитевидных грибов, не влияя на рост дрожжей во время выделения почвенных дрожжей26,27.
  2. Подготовка питательных сред и стерильного оборудования
    1. Для приготовления отвара YEPD (дрожжевого экстракта-пептона-декстрозы) добавьте 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона и 20 г декстрозы в 1 л двойной дистиллированной воды. Перемешивать до полного перемешивания и автоклава в течение 40 мин при 121 °C. Хранить при комнатной температуре до использования.
    2. YEPD твердый агар среды
      1. Смешайте 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г декстрозы и 20 г агара в 1 л воды. Хорошо перемешать и автоклав в течение 40 мин при 121 °C.
      2. После достаточного охлаждения добавляют 1 мл хлорамфеникола и беномила из исходных растворов, чтобы довести конечные концентрации двух противомикробных препаратов до 50 мг/л и 5 мг/л соответственно.
      3. Хорошо перемешать, помешивая, и вылить в чашки Петри диаметром 10 см. Оставьте при комнатной температуре на ночь, чтобы установить и хранить при 4 °C до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Из 1 л YEPD можно налить около 40 пластин.
    3. Стерилизуйте деревянные аппликаторные палочки с простым наконечником и многоразовые разбрасыватели ячеек путем автоклавирования и храните при комнатной температуре.
  3. Инкубация почвы в жидком бульоне
    1. Подготовьте набор стерильных 13 мл культуральных пробирок, пометив их идентификатором образца почвы.
    2. Используя серологическую пипетку, добавьте в каждую пробирку 5 мл отвара YEPD, дополненного хлорамфениколом и беномилом.
    3. Работая в BSCII, переложите ~ 0,1 г почвы в соответствующую культуральную трубку с помощью стерильного, деревянного аппликатора с простым наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий аппликатор для каждого образца почвы и выбрасывайте сразу после использования, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
    4. Надежно закройте трубку до первой остановки, чтобы предотвратить разлив, но при этом обеспечить воздухообмен во время инкубации. Инкубируйте культуральные трубки в барабане в течение 24 ч при температуре, которая считается оптимальной для максимизации роста дрожжей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура инкубации должна определяться на основе среднегодовой температуры страны происхождения проб почвы. Например, при выделении почвенных дрожжей из Исландии культуральные трубки инкубировали при 14 °C, тогда как почвы из Саудовской Аравии инкубировали при 30 °C. Из-за более медленного роста дрожжей при более низких температурах время инкубации, возможно, придется продлить до 72 ч.
  4. Перенесите супернатант в твердую среду.
    1. Используя набор пластин YEPD + хлорамфеникол + беномилагар, приготовленных на этапе 1.2, маркируйте их идентификатором образца почвы.
    2. Извлеките пробирки для культивирования, приготовленные на этапе 1.3, из барабана ролика. Работая в BSCII, кратковременно вихрьте трубку, чтобы втянуть частицы почвы и клетки, которые, возможно, осели на дне, обратно в суспензию.
    3. Используя микропипетку, перенесите 100 мкл супернатанта на пластину. Используйте стерильный, многоразовый разбрасыватель клеток, чтобы тщательно и равномерно распределить жидкость по поверхности агара.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в наборах по 10 образцов может значительно ускорить этот процесс. Сначала пипетка супернатанта на 10 пластин, а затем выполните разбрасывание. Используйте свежий разбрасыватель для каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
    4. Сложите пластины в полиэтиленовые пакеты, запечатайте и инкубируйте вверх ногами в течение 2-3 дней при той же температуре, которая использовалась ранее для инкубации жидкого бульона до тех пор, пока не будет виден рост микробов.
  5. Обнаружение дрожжей и растяжение для одиночных колоний
    1. После обеспечения достаточного времени инкубации (обычно 2-3 дня, но может занять больше времени при более низких температурах), осмотрите пластины в BSCII на предмет роста дрожжей. Ищите кремовые, круглые, матовые дрожжи, которые легко отличить от бактериальных и плесневых колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые дрожжи производят цветные пигменты и могут казаться черными / коричневыми, желтыми или красными, но их общая текстура и форма колонии будут похожи на непигментированные дрожжи.
    2. Выберите одну дрожжеподобную колонию из каждой пластины для дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на одной пластине наблюдается более одного типа морфологии, выберите одну репрезентативную колонию для каждого морфологического типа.
    3. Используя стерильные, деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником, перенесите каждую выбранную колонию на свежую YEPD + хлорамфеникол + беномильную пластину и полосу для отдельных колоний. Выполните три отдельные полосы.
      1. Проведите взад и вперед более трети пластины с помощью аппликаторной палочки. Начните вторую и третью полосы, проведя аппликатор по предыдущей полосе один раз. Используйте новый аппликатор для каждой полосы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте одну пластину на изолят. Откажитесь от аппликаторов сразу после использования, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.
    4. Сложите пластины в полиэтиленовые пакеты, запечатайте и высиживайте вверх ногами в течение 2-3 дней при той же температуре, которая использовалась ранее, пока не станут видны отдельные колонии.
  6. Идентификация видов дрожжей с помощью секвенирования ITS
    1. Выберите хорошо разделенную, единую колонию на почвенный изолят и субкультуру на свежей YEPD + хлорамфеникол + беномильная пластина, чтобы получить больше клеток. Инкубировать в течение 2-3 дней при той же температуре, которая использовалась ранее.
    2. Соберите свежевыращенные клетки и суспендируйте их в морозильных пробирках с температурой -80 °C, содержащих 1 мл стерилизованного 30% глицерина в двойной дистиллированной воде для создания клеточных суспензий. Поддерживайте эти суспензии при -80 °C в качестве запасных растворов.
    3. Используйте свежие клетки для выполнения колониальной ПЦР (полимеразной цепной реакции) с праймерами ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') и ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') для усиления гена грибкового штрихкодирования ITS9. Используйте следующие условия термоциклирования: начальная стадия денатурации при 95 °C в течение 10 мин, затем 35 циклов (i) 95 °C в течение 30 с, (ii) 55 °C в течение 30 с и (iii) 72 °C в течение 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колониальная ПЦР имеет высокий уровень успеха и более быстрое время обработки, чем экстракция ДНК с последующей ПЦР.
    4. Если колониальная ПЦР неоднократно терпит неудачу для штамма, извлеките ДНК с использованием протокола выбора и выполните ИТС-ПЦР, используя извлеченную геномную ДНК в качестве шаблона (используйте те же условия термоциклирования, что и выше).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется относительно недорогая экстракция ДНК на основе хлороформа28.
    5. Выполните секвенирование Сэнгера для определения последовательности ДНК амплифицированной области ITS для каждого штамма.
    6. Сравните полученную последовательность ITS штаммов дрожжей с последовательностями, депонированными в общедоступных базах данных, таких как NCBI GenBank и UNITE, чтобы установить видовую идентичность.

2. Выделение Aspergillus fumigatus из почвы

  1. Приготовьте 1 мл стерильного бульона декстрозы Сабуро (SDB), дополненного антибиотиком хлорамфениколом на образец почвы.
    1. Добавьте 10 г пептона и 20 г декстрозы в 1 л дистиллированной воды. Автоклав при 121 °C в течение 40 мин.
    2. Дайте SDB остыть до ~50 °C, добавьте 1 мл 50 г / л хлорамфеникола, чтобы довести концентрацию до 50 мг / л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорамфеникол получают таким же образом, как описано выше, для выделения дрожжей. Помимо ингибирования роста бактерий, хлорамфеникол также предотвращает образование газа из бактерий, которые приведут к открытию трубок на этапе инкубации, описанном в шаге 2.2.
    3. Асептически аликвотирует 1 мл SDB в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на образец почвы с использованием механической пипетки.
  2. Добавьте почву в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл.
    1. Положите скамью или абсорбирующую прокладку внутри BSCII, чтобы помочь в утилизации пролитого грунта.
    2. Используя палочки-аппликаторы автоклава, переложите примерно 0,1 г почвы в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл SBD. Закройте трубку и вихрь. Насиживайте взвешенную почву при 50 °C в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание во время инкубации не требуется.
  3. Мицелиальный урожай почвенно-инокулированного бульона
    1. Приготовьте пластины с солодовым экстрактом агара (MEA).
      1. На литр МЭА: добавить 20 г солодового экстракта, 20 г декстрозы, 6 г пептона и 15 г агара в 1 л дистиллированной воды. Автоклав при 121 °C в течение 40 мин.
      2. Дайте МЭА остыть до ~50 °C, затем добавьте 1 мл 50 г / л хлорамфеникола, чтобы довести до конечной концентрации 50 мг / л.
    2. Переложите мицелий из привитого почвой бульона на пластины MEA.
      1. Определите почвенные прививки, которые имеют видимый рост мицелиальной кости на границе SDB с воздухом.
      2. Используйте стерилизованные деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником для переноса мицелия в центр meA-пластины. Инкубируйте пластины MEA при 37 °C в течение 3 дней.
  4. Выделение мицелия с морфологическими свойствами A. fumigatus .
    1. Выявляют колонии плесени, обладающие характерными морфологическими свойствами A. fumigatus (зеленая замша похожа на рост).
    2. Работая в BSCII, используйте стерилизованные деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником или петлю прививки для сбора конидий / мицелия, соскребая поверхность один раз. Перенесите споры / мицелий в центр пластины MEA, нанеся на агар для отдельных колоний. Инкубировать при 37 °C в течение 2 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку на пластине может присутствовать несколько штаммов A. fumigatus и / или других грибов, важно прорезать для отдельных колоний. Можно использовать протокол одноколонийного стрейкинга в шаге 1.5.3 протокола выделения дрожжей.
    3. Используя стерильную палочку аппликатора или петлю прививки, субкультуру одной колонии, полученной на этапе 2.4.1.2, на MEA путем однократного удаления колонии. Выложите собранные споры в центр пластины. Инкубировать при 37 °C в течение 2 дней.
  5. Сбор спор/мицелия A. fumigatus для хранения культур
    1. Готовят стерильный 30% раствор глицерина (для раствора 100 мл добавляют 30 мл 100% глицерина, смешанного с 70 мл дистиллированной воды, стерилизуемой при 121 °С в течение 40 мин).
    2. Работая в BSCII, используйте пипетку p1000 для аспирации 1 мл 30% раствора глицерина. Распределите 1 мл раствора глицерина на колонию A. fumigatus для сбора спор / мицелия.
      1. Из-за гидрофобности спор / мицелия A. fumigatus используйте кончик пипетки, чтобы поцарапать плотно спорулированную область пластины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Когда глицерин дозируется в царапине, глицерин будет прилипать к области царапины, а не переворачиваться над агаром.
      2. Медленно распределите глицерин на область царапины, чтобы выбить споры и приостановить их в растворе глицерина.
      3. После полного дозирования слегка опрокините пластину и аспирируйте суспензию спор / мицелия глицерина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно от 750 до 800 мкл будет аспирировано.
      4. Переложите аспират в стерильную морозильную камеру и храните при -80 °C. При необходимости создайте рабочий фонд, повторив шаги 2.5.2.1-2.5.2.4.
  6. Фенотипическая идентификация штаммов A. fumigatus
    1. Используя запас спор, созданный на шаге 2.5.2, создайте 100-кратное разбавление в воде.
      1. Аспират 10 мкл мицелиального и спорового запасов и дозируют в 990 мкл воды. Вихрь подвески.
    2. Нанесите 10 мкл разбавленной споровой суспензии на стандартный предмет микроскопа.
    3. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Окрасить мицелиальную и споровую суспензию метиленовым синим.
      1. Чтобы окрасить метиленовым синим, зафиксируйте конидии и конидиофоры на слайде, переместив горку над горелкой Бунзена до высыхания.
      2. Нанесите метиленовый синий на 1-2 мин и смойте водой.
      3. Высушите слайд промокательной бумагой.
    4. Используя составной микроскоп с 400-кратным увеличением, просмотрите суспензию и найдите конидиофоры. Сравните наблюдаемую морфологию конидиофора с морфологией конидиофора A. fumigatus .
  7. Молекулярная идентификация штаммов A. fumigatus
    1. Извлекайте ДНК из каждого изолята в соответствии с общими протоколами экстракции грибковой ДНК.
    2. Используя праймеры, специфичные для генов Aspergillus β-тубулина (β-tub1 и β-tub4), запустите ПЦР и получите последовательность для амплифицированных продуктов в соответствии с протоколами, описанными Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Сравните полученные последовательности с последовательностями, депонированными в общедоступных базах данных, таких как NCBI GenBank, с помощью BLAST.
      2. Убедитесь, что последовательности деформаций соответствуют последовательностям A. fumigatus в базе данных.
    3. Альтернативой шагу 2.7.2 является запуск мультиплексной реакции ПЦР, нацеленной на спаривание A. fumigatus типов MAT1-1 и MAT1-229.
      1. Используйте следующие три последовательности праймеров в мультиплексной реакции ПЦР: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Используйте следующие параметры термоциклера: 5 мин при 95 °C, 35 циклов по 30 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 1 мин при 72 °C до последних 5 минут при 72 °C.
      3. Проводят гель-электрофорез для идентификации продуктов; ищите 834 bp MAT-1 или 438 bp MAT1-2. Используйте штаммы A. fumigatus , которые подтвердили усиление типа спаривания в качестве положительного и отрицательного контроля.
  8. Микроспутниковое генотипирование штаммов A. fumigatus путем фрагментного анализа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя перечисленные ниже шаги широко охватывают генотипирование A. fumigatus в девяти микроспутниковых (STR) локусах, было выделено лишь несколько важных соображений. Подробную информацию о генотипировании A. fumigatus STR см. в De Valk et al.24,30.
    1. Подготовьте три мультиплексных мастер-микса ПЦР, используя праймеры STRAf, ранее описанные De Valk et al.24.
      1. Флуоресцентно метят передние грунтовки для определения размера фрагмента с помощью капиллярного электрофореза. Убедитесь, что концентрация прямых грунтовок вдвое меньше (0,5 мкМ) по сравнению с концентрацией обратных праймеров (1 мкМ) в основной смеси.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте флуоресцентные метки, которые имеют длины волн поглощения, соответствующие выбранному стандарту красителя, используемому во время капиллярного электрофореза.
      2. Используйте термостартовую полимеразу для достижения наилучших результатов.
      3. Используйте концентрацию ДНК 0,1 нг на реакцию.
    2. Запустите мультиплексную ПЦР для каждого штамма, используя следующую программу ПЦР: 95 °C в течение 10 мин, 40 циклов 95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 60 с, затем 72 °C в течение 10 мин и удержание при 4 °C.
    3. Проверьте наличие усиленных продуктов с помощью гелевого электрофореза.
    4. Разбавьте продукты до желаемого уровня (обычно ~50x), как рекомендовано специалистами по анализу фрагментов, и запустите капиллярный электрофорез. Выполните три прогона для каждого штамма, причем каждый прогон охватывает три мультиплексированные реакции с тремя различными флуоресцентными зондами.
    5. Чтобы определить правильный размер фрагмента для каждого из девяти локусов STR, используйте программное обеспечение, способное анализировать фрагменты.
      1. Извлеките необработанные данные, полученные в результате капиллярного электрофореза. Оцените размеры фрагментов на основе наибольшего пика с помощью программного обеспечения для анализа фрагментов (например, Osiris).
      2. Преобразуйте размеры фрагментов в повторяющиеся числа для каждого из девяти локусов. Используйте размеры фрагментов повторяющихся чисел эталонного штамма Af293, как описано ранее De Valk et al.24.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные различия в размерах фрагментов могут возникать между различными платформами капиллярного электрофореза. Таким образом, важно включить общий эталонный штамм (и внутреннюю лестницу) с известным размером фрагмента для каждого из девяти локусов для штаммов генотипирования.

Результаты

Выделение дрожжей из почвы
Вышеупомянутый протокол выделения дрожжей был внедрен для культивирования дрожжей из образцов почвы, происходящих из 53 мест в девяти странах 9,12. В общей сложности 1 473 штамма дрожжей были выделены из 3 826 образцов почв...

Обсуждение

Протокол, разработанный для выделения дрожжей и A. fumigatus из почвы, является быстрым и эффективным методом высокопроизводительной обработки почвы и грибковой изоляции. Протокол требует только небольшого количества почвы (0,1-0,2 г) на образец, что позволяет отбирать больше участков с а...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (Грант No. ALLRP 570780-2021) и Университета Макмастера.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeSarstedt Inc72.690.001
Benomyl powder Toronto Research ChemicalsB161380
Chloramphenicol powder Sigma-AldrichSKU: C0378-5G
DextroseSigma-AldrichSKU: D9434-500G
Fragment Analysis SoftwareNCBI's Osirishttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence databaseNCBI GenBank https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence databaseUNITE https://unite.ut.ee/
PeptoneSigma-AldrichSKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders Fisher Scientific08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes Sarstedt Inc83.3902
Sterile 13 mL culture tubes Sarstedt Inc62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks Fisher Scientific23-400-112
Yeast extractSigma-AldrichSKU: Y1625-250G

Ссылки

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183Aspergillus fumigatus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены