测量 果蝇 光感受器中光色素水平的电生理学方法

摘要

我们提出了一种电生理学表征双稳定光色素的方案:（i）利用光子吸收后光色素分子内的电荷位移及其在光感受器中的大量电荷，以及（ii）利用视紫红质和偏视紫红质光色素状态的吸收光谱差异。这些方案可用于筛选影响双稳定光色素系统的突变。

摘要

果蝇G蛋白偶联的光色素沉着视紫红质（R）由蛋白质（视蛋白）和发色团组成。视紫红质的活化过程由光子吸收诱导发色团的异构化启动，促进视蛋白的构象变化并导致第二种暗稳定光色素沉着状态（偏视紫红质，M）。使用随机诱变来研究这种双稳定光色素需要简单而可靠的方法来筛选突变蝇。因此，已经设计了几种测量功能性光色素水平降低的方法。一种这样的方法利用了光子吸收后光色素内的电荷位移以及光感受器中表达的大量光色素分子。该电信号称为早期受体电位（或早期受体电流），通过各种电生理学方法（例如，视网膜电图和全细胞记录）测量，并且与功能性光色素水平成线性比例。该方法的优点是高信噪比，直接线性测量光色素水平，以及视紫红质或偏视红质激活下游的光转导机制的独立性。另一种称为延长去极化后电势（PDA）的电生理学方法利用果蝇光色素的双稳定性和苍蝇R和M色素状态的吸收光谱差异。PDA由强烈的蓝光诱导，将饱和量的视紫红质转化为偏视紫红质，导致在黑暗中长时间光响应终止失败，但它可以通过使用强烈的橙色光将偏视紫红质转化为视紫红质来终止。由于PDA是一种强大的信号，需要大量的光色素转化，因此即使是光色素生物发生中的微小缺陷也会导致容易检测到异常的PDA。事实上，有缺陷的PDA突变体导致了对光转导很重要的新型信号蛋白的鉴定。

引言

光激活的视紫红质（R）是一种G蛋白偶联受体（GPCR），由7个跨膜蛋白（视蛋白）和一个发色团组成。在 果蝇 （果蝇）中， 光子吸收诱导11-顺式-3-OH-视网膜发色团异构化为全反式-3-OH-视网膜¹，促进视紫红质到偏视紫红质的构象变化（M， 图1A）。与脊椎动物视紫红质不同，无脊椎动物发色团的主要部分不会与视蛋白解离，从而产生生理活性的暗稳定色素状态M。反过来，全反式-3-OH-视网膜发色团的额外光子吸收诱导发色团^2，3的异构化，产生具有11-顺式-3-OH-视网膜发色团的R色素状态。R状态是一种深色，稳定且生理上无活性的光色素。除了发色团⁴的极快光子再生途径（与脊椎动物光色素沉着非常相似）之外，无脊椎动物中还存在用于发色团再生的替代酶促慢速途径，其中一些阶段在光感受器细胞周围的视网膜细胞中进行^5，6。

果蝇作为研究无脊椎动物光感受器的模式生物具有很大的优势。特别是，制剂的可及性和应用分子遗传学的能力使果蝇成为一个强大的模型系统⁷。因此，已经建立了几种体内和离体实验方法，用于研究光转导的一般情况，特别是光色素水平。最简单的体内方法利用了相对较小的细胞外记录的对果蝇眼光的电压响应。因此，光刺激唤起整个眼睛的电压响应，可以使用细胞外视网膜电图（ERG）记录来测量，这比脊椎动物眼睛的光的ERG响应^8，9大约3个数量级。果蝇ERG反应是稳健的，易于获得，这使其成为识别由于突变引起的光反应异常的便捷方法。对光的ERG反应主要来自光感受器，色素（神经胶质细胞）细胞和层的次级神经元（见图1B）。ERG的主要成分是（i）光感受器的细胞外电压响应，（ii）从层神经元产生的光刺激开始和结束时的"开"和"关"瞬变（图2A，插入，ON，OFF），（iii）神经胶质细胞的缓慢响应（图2A，插图，箭头），以及（iv）短暂和瞬态响应， 由ON瞬变¹⁰之前的光色素激活期间的电荷位移引起（图2C [插图]，D，E）。这种短暂的反应由两相（M1和M2，图2C[插图]）组成，只能通过极强的光刺激诱导，同时激活数百万个光色素分子。在蓝色刺激下（图2D，蓝色迹线）和具有高度降低的光色素水平的突变体（图2E，红色迹线）中既未观察到，但在消除PLC活性的突变体中，其振幅轻度增强（图2E，橙色迹线）。M1相是苍蝇的典型ERP，由光感受器中M的激活引起。具有正极性（细胞内）的M1相以正常方式在符号反转突触中释放神经递质并激活层神经元，这些神经元通过产生突触放大的M2相来响应光感受器去极化。因此，M1和M2相位都反映了M活化^10，11。

光感受器的去极化产生角膜阳性"开启"瞬时，由光感受器轴突和层^10，11的单极神经元之间的符号反转突触^引起（图1B）。ERG的缓慢上升和衰减是由色素细胞的去极化引起的（图2A，插图，箭头），主要是由于K ⁺通过瞬时受体电位（TRP）和TRP样（TRPL）通道^13，14，15从感光细胞¹²流出。与感光器对光的细胞内或全细胞记录相比，这些缓慢的动力学成分在很大程度上掩盖并扭曲了光感受器反应的波形^9，10。此外，在非常强的照明下，可以观察到额外的瞬态响应，该响应在"导通"瞬变之前并部分融合（图2C [插图]，D，E）。该信号直接起源于光色素¹⁰的大量激活。

已经开发了几种使用中性密度（ND）和彩色滤光片的光照方案，以及强烈的照明闪光灯，以研究眼睛的一般情况，特别是光转导级联。这些方案也被用于研究光色素的性质。

强度响应协议测量整个眼睛对增加的光强度的ERG电压响应的峰值幅度（图2A，B）。该协议有助于检测光感受器细胞对光⁹的敏感性的变化。

延长去极化后电位（PDA）方案利用了视紫红质和偏视紫红质吸收光谱的差异，允许在果蝇中将R的大量光色素转化为其生理活性和暗稳定的中间M状态²。在ERG电压响应中，给出相对较短的饱和光脉冲，并记录产生的电压响应。在这种情况下，去极化信号达到上限（反转电位），因为激活大量视紫红质分子（~1×10⁸）的一小部分足以达到天花板。光转导分量的大量存在确保了即使在浓度显着降低或光传导分量的细微故障的突变体中也能达到该上限。这种情况排除了这些突变体的隔离。Pak等人介绍了PDA筛查⁷，寻求一种可靠且揭示性的测试来分离视觉突变体。在果蝇中，PDA反应是通过遗传去除红色筛选色素（允许光色素转化）和蓝光的应用引起的，蓝光优先被视紫红质吸收（图3A），因此导致R到M光色素状态的大量净转化。光转导终止在光色素水平上被R到M的大净转换破坏，这反过来又导致光关闭后很长一段时间内的持续激发（图2C，图4A [顶部]）。在PDA期间，光感受器对随后的测试灯不太敏感，并且部分脱敏（失活）。PDA甚至可以检测视紫红质生物发生的微小缺陷，并测试光感受器细胞在长时间内保持兴奋的最大能力。由于它严格依赖于高浓度视紫红质的存在，因此很容易对光转导组分的缺乏补充进行评分。值得注意的是，PDA屏幕已经产生了许多新的和非常重要的视觉突变体（在Pak等人中^回顾）。因此，由Pak等人分离的PDA突变体对于分析果蝇视觉系统仍然非常有用。

PDA通过饱和蓝光在 果蝇 中诱导，导致光偏移后很长一段时间内的连续去极化（图4A [顶部]）。在饱和PDA诱导蓝光后，外周光感受器（R1-6）在其最大容量下在黑暗中保持连续活性，达到饱和。PDA期间额外的饱和蓝光不会在R1-6细胞中产生任何额外的反应，而是在叠加在PDA上的R7-8电池中诱导反应。叠加反应可以通过这些细胞中表达的光色素的不同吸收光谱（R7-8）¹⁶来解释。PDA可以通过在饱和橙色光下将M光转换回R来抑制（图4A [顶部]）。PDA将感光细胞带到其最大活性能力的能力，这种情况无法通过强烈的白光实现，这解释了为什么它一直是筛选 果蝇视觉突变体的主要工具。这是因为它允许检测参与正常光色素水平^17，18的生物发生的蛋白质中的微小缺陷。已经分离出两组PDA缺陷突变体:既不失活也不后电位（nina）突变体和失活但不是后电位（ina） 突变体。前者的表型是缺乏PDA和由光色素水平大幅降低引起的相关失活（图4A [中]）。后者的表型显示灭活，但蓝光后没有暗去极化，因为突变体中具有正常的视紫红质水平，但缺乏与TRP通道相互作用的蛋白质（图4A [底部]）。

PDA由相对于逮捕素（ARR2）的光色素量的差异引起，其结合并终止M活性^19，20，21（图1A）。在果蝇光感受器中，光色素的量大约是ARR2¹⁹量的五倍。因此，ARR2水平不足以灭活由R到M的大净光转换产生的所有M分子，留下过量的M在黑暗中不断活跃^17，19，^20，22，23。该机制解释了通过突变或类胡萝卜素剥夺^24，25消除PDA反应，导致光色素水平降低，但不影响逮捕素水平。此外，这种解释还解释了空ARR2（arr2³）突变等位基因²¹的表型，其中PDA可以在~10倍变暗的蓝光强度^{下实现19，20，21}（图4B，C）。PDA不是苍蝇光感受器的独特特征，它出现在每个具有暗稳定M的测试物种中，其吸收光谱与R状态的吸收光谱不同，允许光色素从R到M状态的充分光转换。发现PDA现象学的彻底研究物种是藤壶（Balanus）光感受器，其中R状态的吸收光谱比M状态²的波长更长（图3B）。因此，与苍蝇中的情况不同，在藤壶中，橙红色光诱导PDA，而蓝光抑制PDA²。

早期受体电位（ERP）方案利用了R或M激活期间发生的电荷位移。视觉色素是脊椎动物和无脊椎动物膜³的信号室表面膜的组成部分。因此，在活化过程中，光色素分子从一种中间状态变为下一种中间状态伴随着电荷位移^4，26。由于光色素分子与膜电容⁴平行电排列，快速同步的构象变化产生表面膜的快速极化变化，这在苍蝇中发生在由约30，000-50，000微绒组成的信号室中，称为rhabdomere。然后，这种极化通过细胞体的膜电容被动地放电，直到细胞膜同样极化。ERP是电荷位移的细胞外记录。细胞内记录的ERP表现为由细胞膜的时间常数^4，27，²⁸积分的细胞外ERP。由视觉色素电荷位移激活的电流也可以在全电池电压钳记录^29，30（图5A-D）中测量，其主要优点（在早期受体电流（ERC）记录中）是最小化膜电容对信号动力学的影响。

协议部分描述了如何通过果蝇分离的卵黄体^31，32的全细胞记录对果蝇眼⁹进行ERG测量和ERC测量。我们还描述了用于研究光转导的特定协议，特别是光色素。

研究方案

1. 使用视网膜电图测量强度反应关系、延长去极化后电位 （PDA） 和早期受体电位 （ERP）

1. 适合 黑腹角鲷 制备的养殖条件
   1. 饲养 的黑腹产儿 在含有标准黄玉米的瓶子中飞行，该瓶子含有食物，在温度保持在24°C和12小时的暗/光循环中
   2. 在实验前至少24小时将苍蝇瓶保持在黑暗中。
2. 常规设置
   1. 通过拉动1 mm x 0.58 mm（外径x I.D）纤维填充的硼硅酸盐玻璃毛细管来准备记录移液器（图6L，O）。移液器的电阻应为5-10 MΩ;可以使用任何合适的拉拔器。
   2. 用AgCl₂涂覆两根银线，将0.25 mm银线插入连接到定制5 V电源的3 M KCl溶液中。
   3. 将每根涂层银线插入电极支架（图6N）。
   4. 使用细长的尖端注射器（图6M）用过滤的林格氏溶液填充玻璃毛细管（参见表1）。
   5. 将电极丝插入玻璃毛细管。确保毛细管内的溶液与银线接触。
   6. 将电极支架（图7P，N）插入两个电极显微操作器（图7G）。
3. 准备苍蝇进行电气记录的步骤
   注:要使飞行保持在适合黑暗的条件下，请在以下步骤中仅使用暗淡的红光照明。
   1. 使用苍蝇枕木系统（图6A，B）用CO₂气体麻醉瓶中的苍蝇，并将其倒入卧铺容器中。
   2. 选择一只苍蝇，并用锋利的镊子小心地握住它的翅膀。用培养皿盖住其余的苍蝇。
   3. 将苍蝇以正确的方向放在苍蝇架上 - 侧放，背部朝向手（图6P）。
   4. 打开烙铁的电源。将电流设置为 ~2.25 A。该电流应将0.25 mm铂铱丝加热至~55-56°C（参见 补充文件）。
   5. 将一滴熔化温度低（〜55-56°C）的蜡滴放在烙铁上（图6F）。
   6. 使用镊子，将苍蝇从其机翼上抬起，并使用烙铁将其翅膀固定在苍蝇架上（图6I）。
   7. 使用烙铁，用蜡将苍蝇的背面连接到支架表面（图6P）。
   8. 将烙铁的尖端降低到支腿的连接点上，熔化蜡以将所有支腿覆盖在一起（图6P）。
   9. 在颈部区域的头部和背部之间放置一小滴蜡（图6P）。
      注:请特别注意避免飞头过热。确保苍蝇正确固定，在实验过程中无法移动;微小的移动可能会在录音中产生伪影。确保胸部和腹部的气管开口（呼吸入口）没有被蜡覆盖。
   10. 将苍蝇支架（图7Q）放在磁块（图7I）上的深色法拉第笼中，并确保苍蝇距离光导末端约5毫米（图7L）。
   11. 使用显微操作器将记录电极（图7P）放在苍蝇的眼睛上方，将接地电极（图7N）放在苍蝇的上背部。
   12. 使用显微操作器将接地电极插入苍蝇的背面。
   13. 将记录电极插入苍蝇眼的外周，优选使用显微操作器。
       注意:将电极插入眼睛后，将观察到一个小酒窝;向上拉电极而不将其从眼睛中取出，直到酒窝消失。电极也可以浸入施加在躯干和眼睛上的小电极果冻液滴中。
4. 强度-响应方案
   1. 在高压氙气灯前放置一个橙色滤光片（590边缘滤光片）。使用大型（六个数量级）衰减中性密度 （ND） 滤镜。
   2. 在黑暗中等待60秒，并给出5秒的光脉冲。
   3. 将 ND 灰度滤镜替换为衰减较小的 ND 灰度滤镜，以一个数量级为增量。
   4. 在黑暗中等待60秒，然后给出第二个5秒的光脉冲。
   5. 重复步骤 1.4.1.-1.4.4，使用衰减较小的 ND 灰度滤镜逐渐增加光强度（最后一个脉冲应在完全没有 ND 灰度滤镜的情况下产生）。确保沿正确的方向使用一系列 ND 灰度滤镜，从大衰减开始，一直到低衰减。
5. PDA协议（该协议只能在白眼苍蝇上进行）
   1. 使用橙色滤光片（590边缘滤光片，将最大光色素转换为R状态）给出最大强度的5 s光脉冲。
   2. 将橙色滤光片更换为宽带蓝色（BP450/40 nm）滤光片，并以最大强度产生三个5秒的光脉冲。
      注意:也可以给出一个长连续的最大强度蓝光脉冲，直到达到稳态电压响应。
   3. 在黑暗中等待60秒，用以前的橙色滤光片替换蓝色滤光片，并以60秒的间隔给出两个5秒的光脉冲。
6. 用于测量M光平衡光谱的ERP / M电位协议（该协议只能在白眼苍蝇^10，25上执行）
   1. 给予连续的蓝色（带通（BP）450/40nm）光脉冲，直到达到稳态电压响应，其将最大光色素量从R状态转换为R1-6细胞的M状态。
   2. 使用窄（~20nm）带通滤光片给出波长在350-700nm（R1-6细胞光色素的已知吸收光谱）之间的简短（<3 ms）强光闪光，并测量M电位响应的M1相的峰值振幅（其反映了光平衡^10，25下该特定波长下的偏视紫红质吸收）。
      注意:为了同步激活大量光色素分子，需要短暂而强烈的闪光，以便在短时间内填充光子内容物。M电位由两个组分组成:M1（角膜负相），它反映了光感受器中偏视紫红质的电荷位移，以及M2（角膜正相^11，33），它反映了光感受器在层^9，10，11中的放大^M1反应。.这些成分中的每一个都可以识别和测量。然而，最好测量M1电位，因为它是M水平的直接线性表现。如果使用M2，请确保其振幅在线性范围内，使用轻度类胡萝卜素剥夺^24，25。
   3. 再次给予连续的蓝色（BP450 / 40 nm）光脉冲，然后发出不同波长的短暂（<1 ms）强光闪光。
   4. 重复该协议，直到覆盖光平衡处M的整个吸收光谱。

2. ERC协议，用于使用全电池电压钳位记录测量R1-6电池的R和M状态的作用谱

注:有关使用全电池电压钳位记录的详细方案，请参见Katz等人.³⁴。M电位使用ERG来测量M状态的活化，只是因为R状态的贡献被膜电容抑制。相反，ERC测量R（正ERC）和M（负ERC）状态的激活，因为电压钳位记录消除了膜电容的影响（参见简介）。

1. 将感光恢复到所需状态（R或M）。对于R到M的转换，首先，通过短暂（<1 ms）自适应蓝色（BP450 / 40 nm）闪光灯来调整苍蝇。对于M到R的转换，给出一个短的自适应橙色（OG590边缘滤波器）闪光灯。
2. 给出波长在350-700nm之间的短暂闪光（<1 ms），并测量ERC响应的最大负或正振幅，该振幅反映了该特定波长下的M / R吸收。
   注意:为了同步激活大量光敏分子池，需要短暂而强烈的闪光来在短时间内包装光子内容物。由于R和M的吸收光谱重叠，蓝色闪光从R到M的最大光色素转化可以达到总光色素分子的约80%（图3A）。因此，在低于~550nm的波长下，ERC有两个分量:反映偏视紫红质响应的负相和反映剩余视紫红质响应的正相。ERC线性依赖于光强度（图5D）。因此，为了推导出R和M态的光谱灵敏度，ERC的每个相位都需要在相同能量²⁹的各种波长下归一化。
3. 重复步骤 2.1.-2.2。使用不同波长的闪光。
4. 将归一化的正负 ERC 绘制为波长的函数。
   注意:强烈的闪光通过光敏通道诱导大量电流，导致光感受器上的代谢应激，这反过来又导致与光无关的通道打开。ERC叠加在这个构成电流上。

结果

图2说明了使用ERG技术的鲁棒性和易用性。它之所以坚固，是因为它通过一种简单的细胞外电压记录技术记录在几乎完整的飞行中，这需要简单的电生理设置。即使突变强烈降低或扭曲光响应，也通过以相对较大的振幅（在毫伏范围内）获得光响应的记录来表现鲁棒性。因此，即使是没有经验的实验者也可以使用非常简单的实验装置，并学习如何在几天内获得有意义的结果。...

讨论

使用 果蝇 光感受器制剂的主要优点是其可访问性，光刺激的易用性和准确性，最重要的是，应用分子遗传学能力^的能力7。广泛的遗传学研究已经确定 果蝇 是复杂生物过程遗传解剖的非常有用的模型系统⁷。 果蝇 基因组结构相对简单（仅由四条染色体组成，包括X和Y性染色体，两个较大的常染色体元素，2号和3号染色体以及小点第四条染色?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X