Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Abstract

La Drosophila G-proteina accoppiata fotopigmento rhodopsin (R) è composta da una proteina (opsina) e un cromoforo. Il processo di attivazione della rodopsina è avviato dall'isomerizzazione del cromoforo che induce l'assorbimento dei fotoni, promuovendo cambiamenti conformazionali dell'opsina e determinando un secondo stato di fotopigmento scuro-stabile (metarodopsina, M). Lo studio di questo fotopigmento bistabile utilizzando la mutagenesi casuale richiede metodi semplici e robusti per lo screening delle mosche mutanti. Pertanto, sono stati progettati diversi metodi per misurare le riduzioni dei livelli di fotopigmento funzionale. Uno di questi metodi sfrutta gli spostamenti di carica all'interno del fotopigmento successivi all'assorbimento dei fotoni e le enormi quantità di molecole di fotopigmento espresse nei fotorecettori. Questo segnale elettrico, chiamato potenziale del recettore precoce (o corrente del recettore precoce), è misurato da una varietà di metodi elettrofisiologici (ad esempio, elettroretinogramma e registrazioni di intere cellule) ed è linearmente proporzionale ai livelli di fotopigmento funzionale. I vantaggi di questo metodo sono l'elevato rapporto segnale-rumore, la misurazione lineare diretta dei livelli di fotopigmento e l'indipendenza dei meccanismi di fototrasduzione a valle dell'attivazione della rodopsina o della metarodopsina. Un ulteriore metodo elettrofisiologico chiamato postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) sfrutta la bi-stabilità del fotopigmento di Drosophila e le differenze spettrali di assorbimento degli stati pigmentati R e M della mosca. Il PDA è indotto da un'intensa luce blu, che converte quantità saturanti di rodopsina in metarodopsina, con conseguente fallimento della terminazione della risposta alla luce per un tempo prolungato nell'oscurità, ma può essere terminato dalla metarodopsina alla conversione della rodopsina usando un'intensa luce arancione. Poiché il PDA è un segnale robusto che richiede una massiccia conversione del fotopigmento, anche piccoli difetti nella biogenesi del fotopigmento portano a PDA anormali prontamente rilevati. In effetti, i mutanti PDA difettosi hanno portato all'identificazione di nuove proteine di segnalazione importanti per la fototrasduzione.

Introduzione

La rodopsina (R) attivata dalla luce, che è un recettore accoppiato alla proteina G (GPCR), è composta da una proteina transmembrana 7 (opsina) e un cromoforo. In Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), l'assorbimento dei fotoni induce l'isomerizzazione del cromoforo 11-cis-3-OH-retinico a all-trans-3-OH-retinico¹, promuovendo il cambiamento conformazionale della rodopsina in metarodossina (M, Figura 1A). A differenza della rodopsina vertebrata, la frazione predominante del cromoforo invertebrato non si dissocia dall'opsina, con conseguente stato pigmentato fisiologicamente attivo E stabile scuro M. A sua volta, l'ulteriore assorbimento di fotoni da parte del cromoforo all-trans-3-OH-retinico induce l'isomerizzazione del cromoforo ^2,3, generando lo stato di pigmento R con il cromoforo 11-cis-3-OH-retinale. Lo stato R è un fotopigmento scuro, stabile e fisiologicamente non attivo. Oltre alla via di rigenerazione fotonica estremamente veloce del cromoforo⁴, proprio come i fotopigmenti dei vertebrati, esiste una via lenta enzimatica alternativa per la rigenerazione dei cromofori negli invertebrati, in cui alcuni degli stadi vengono eseguiti nelle cellule retiniche che circondano le cellule dei fotorecettori ^5,6.

La drosophila comporta grandi vantaggi come organismo modello per lo studio dei fotorecettori degli invertebrati. In particolare, l'accessibilità della preparazione e la capacità di applicare la genetica molecolare hanno reso Drosophila un potente sistema modello⁷. Sono stati quindi stabiliti diversi metodi sperimentali in vivo ed ex vivo per lo studio della fototrasduzione in generale e dei livelli di fotopigmento, in particolare. Il metodo in vivo più semplice sfrutta la risposta di tensione registrata extracellulare relativamente grande alla luce dell'occhio di Drosophila. Di conseguenza, la stimolazione luminosa evoca una risposta di tensione elettrica in tutto l'occhio che può essere misurata utilizzando la registrazione dell'elettroretinogramma extracellulare (ERG), che è ~ 3 ordini di grandezza più grande della risposta ERG alla luce degli occhi dei vertebrati ^8,9. La risposta di Drosophila ERG è robusta e facilmente ottenibile, il che lo rende un metodo conveniente per identificare anomalie nella risposta alla luce dovute a mutazioni. La risposta ERG alla luce deriva principalmente dai fotorecettori, dalle cellule pigmentate (glia) e dai neuroni secondari della lamina (vedi Figura 1B). I componenti principali dell'ERG sono (i) la risposta di tensione extracellulare dei fotorecettori, (ii) i transitori "on" e "off" all'inizio e alla fine dello stimolo luminoso che derivano dai neuroni della lamina (Figura 2A, inset, ON, OFF), (iii) la risposta lenta delle cellule gliali (Figura 2A, inserto, frecce) e (iv) la risposta breve e transitoria, derivante dallo spostamento di carica durante l'attivazione del fotopigmento che precede il transitorio ON¹⁰ (Figura 2C [inserto], D, E). Questa breve risposta è composta da due fasi (M1 e M2, Figura 2C [inserto]) e può essere indotta solo da una stimolazione luminosa estremamente forte, che attiva contemporaneamente milioni di molecole di fotopigmento. Non è osservato né sotto stimolazione blu (Figura 2D, traccia blu) né in mutanti con livelli di fotopigmento altamente ridotti (Figura 2E, traccia rossa), ma la sua ampiezza è leggermente migliorata in un mutante che abolisce l'attività del PLC (Figura 2E, traccia arancione). La fase M1 è un tipico ERP della mosca derivante dall'attivazione di M nei fotorecettori. La fase M1, che ha una polarità positiva (intracellulare), rilascia un neurotrasmettitore in modo normale in una sinapsi che inverte il segno e attiva i neuroni della lamina, che rispondono alla depolarizzazione del fotorecettore generando la fase M2 amplificata sinapticamente. Pertanto, entrambe le fasi M1 e M2 riflettono l'attivazione M^10,11.

La depolarizzazione del fotorecettore genera il transitorio "on" corneale-positivo, derivante dalla sinapsi che inverte il segno tra l'assone fotorecettore e i neuroni monopolari della lamina^10,11 (Figura 1B). La lenta ascesa e decadimento dell'ERG deriva dalla depolarizzazione delle cellule pigmentate (Figura 2A, inserto, frecce) principalmente a causa dell'efflusso K⁺ dalle cellule fotorecettrici¹² attraverso il potenziale recettore transitorio (TRP) e i canali TRP-like (TRPL) 13,14,15. Questi componenti cinetici lenti mascherano e distorcono in gran parte la forma d'onda della risposta dei fotorecettori rispetto alle registrazioni intracellulari o intere cellule della risposta del fotorecettore alla luce ^9,10. Inoltre, a illuminazioni molto forti, si può osservare un'ulteriore risposta transitoria, che precede e parzialmente si fonde con il transitorio "on" (Figura 2C [inserto],D,E). Questo segnale ha origine direttamente dalla massiccia attivazione del fotopigmento¹⁰.

Diversi protocolli di regime luminoso che utilizzano filtri a densità neutra (ND) e a colori, oltre a forti lampi illuminanti, sono stati sviluppati per studiare l'occhio in generale e la cascata di fototrasduzione in particolare. Questi protocolli sono stati utilizzati anche per studiare le proprietà del fotopigmento.

Il protocollo intensità-risposta misura l'ampiezza di picco della risposta di tensione ERG dell'intero occhio all'aumento delle intensità luminose (Figura 2A,B). Questo protocollo aiuta a rilevare i cambiamenti nella sensibilità delle cellule dei fotorecettori alla luce⁹.

Il protocollo di postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) sfrutta le differenze negli spettri di assorbimento di rodopsina e metarodopsina che consente, in Drosophila, una massiccia conversione fotopigmentale di R al suo stato M intermedio fisiologicamente attivo e dark-stabile². Nella risposta di tensione ERG, viene dato un impulso relativamente breve di luce di saturazione e viene registrata la risposta di tensione risultante. In questa condizione, un tetto (potenziale di inversione) viene raggiunto dal segnale di depolarizzazione perché l'attivazione di una frazione di percentuale dell'enorme quantità di molecole di rodopsina (~ 1 x 10⁸) è sufficiente per raggiungere il soffitto. La presenza dei componenti di fototrasduzione in grande abbondanza assicura che questo soffitto sarà raggiunto anche nei mutanti con una significativa riduzione della concentrazione o un sottile malfunzionamento dei componenti di fototrasduzione. Questa situazione preclude l'isolamento di questi mutanti. Pak et al. hanno introdotto lo screening PDA⁷ cercando un test affidabile e rivelatore per isolare i mutanti visivi. In Drosophila, la risposta PDA è causata dalla rimozione genetica del pigmento di screening rosso, che consente la conversione del fotopigmento, e l'applicazione della luce blu, che viene assorbita preferenzialmente dalla rodopsina (Figura 3A) e, quindi, si traduce in una grande conversione netta dello stato di fotopigmento R in M. La terminazione della fototrasduzione viene interrotta a livello del fotopigmento da una grande conversione netta di R in M, che, a sua volta, si traduce in un'eccitazione prolungata molto tempo dopo che la luce è spenta (Figura 2C, Figura 4A [in alto]). Durante il periodo PDA, i fotorecettori sono meno sensibili alle luci di prova successive e sono parzialmente desensibilizzati (inattivati). Il PDA rileva anche piccoli difetti nella biogenesi della rodopsina e verifica la capacità massima della cellula fotorecettore di mantenere l'eccitazione per un periodo prolungato. Poiché dipende strettamente dalla presenza di alte concentrazioni di rodopsina, segna facilmente per il rifornimento carente dei componenti di fototrasduzione. Sorprendentemente, lo schermo PDA ha prodotto molti nuovi e molto importanti mutanti visivi (recensiti in Pak et ^al.7). Pertanto, i mutanti PDA isolati da Pak et ^al.7 sono ancora estremamente utili per analizzare il sistema visivo Drosophila .

Il PDA è indotto in Drosophila saturando la luce blu, con conseguente depolarizzazione continua a lungo dopo l'offset della luce (Figura 4A [in alto]). Dopo aver saturato la luce blu che induce PDA, i fotorecettori periferici (R1-6) rimangono continuamente attivi al buio alla loro massima capacità, raggiungendo la saturazione. Ulteriori luci blu saturanti durante il PDA non producono alcuna risposta aggiuntiva nelle cellule R1-6 per molti secondi, ma inducono una risposta nelle cellule R7-8 che si sovrappone al PDA. Le risposte sovrapposte sono spiegate dai diversi spettri di assorbimento dei fotopigmenti espressi in queste cellule (R7-8)¹⁶. Il PDA può essere soppresso dalla fotoconversione di M in R con luce arancione saturante (Figura 4A [in alto]). La capacità del PDA di portare le cellule dei fotorecettori alla loro massima capacità attiva, una situazione che non può essere raggiunta con un'intensa luce bianca, spiega perché è stato uno strumento importante per lo screening dei mutanti visivi di Drosophila. Questo perché permette l'individuazione di difetti anche minori nelle proteine coinvolte nella biogenesi dei normali livelli di fotopigmento ^17,18. Sono stati isolati due gruppi di mutanti difettosi PDA: mutanti né inattivazione né postpotenziale (nina) e inattivazione ma non mutanti postpotenziali (ina). Il fenotipo del primo è la mancanza di un PDA e l'inattivazione associata derivante da una grande riduzione dei livelli di fotopigmento (Figura 4A [centro]). Il fenotipo di quest'ultimo mostra inattivazione ma nessuna depolarizzazione scura dopo la luce blu a causa di un meccanismo ancora sconosciuto nel mutante con livelli normali di rodopsina ma privo di proteine che interagiscono con i canali TRP (Figura 4A [in basso]).

Il PDA nasce dalla differenza nella quantità di fotopigmento rispetto all'arrestina (ARR2), che lega e termina l'attività M 19,20,21 (Figura 1A). Nei fotorecettori di Drosophila, la quantità del fotopigmento è circa cinque volte maggiore della quantità di ARR2¹⁹. Pertanto, i livelli di ARR2 sono insufficienti per inattivare tutte le molecole M generate da una grande fotoconversione netta di R a M, lasciando un eccesso di M costantemente attivo al buio 17,19,20,22,23. Questo meccanismo spiega l'eliminazione della risposta PDA da mutazioni o da deprivazione carotenoide^24,25, causando una riduzione del livello di fotopigmento, ma non influisce sui livelli di arrestina. Inoltre, questa spiegazione spiega anche i fenotipi dell'allele mutante null ARR2 (arr2³)²¹, in cui il PDA potrebbe essere raggiunto a intensità di luce blu ~ 10 volte più deboli^19,20,21 (Figura 4B,C). Il PDA non è una caratteristica unica dei fotorecettori di mosca, e appare in ogni specie testata che ha M scuro stabile con uno spettro di assorbimento diverso da quello dello stato R, consentendo una sufficiente fotoconversione del fotopigmento dallo stato R allo stato M. Una specie accuratamente studiata in cui è stata scoperta la fenomenologia pda è il fotorecettore del cirripedicolo (Balanus), in cui lo spettro di assorbimento dello stato R è in una lunghezza d'onda più lunga dello stato M² (Figura 3B). Di conseguenza, a differenza della situazione al volo, nel cirripedi, la luce rosso-arancio induce un PDA, mentre la luce blu sopprime il PDA².

Il protocollo ERP (Early Receptor Potential) sfrutta lo spostamento di carica che si verifica durante l'attivazione di R o M. Il pigmento visivo è parte integrante della membrana superficiale del compartimento di segnalazione delle membrane sia dei vertebrati che degli invertebrati³. Di conseguenza, il processo di attivazione in cui le molecole di fotopigmento cambiano da uno stato intermedio a quello successivo è accompagnato da uno spostamento di carica ^4,26. Poiché le molecole di fotopigmento sono allineate elettricamente in parallelo con la capacità di membrana⁴, un rapido cambiamento conformazionale sincronizzato genera un rapido cambiamento di polarizzazione della membrana superficiale, che, nelle mosche, si verifica nel compartimento di segnalazione composto da una pila di ~ 30.000-50.000 microvilli chiamati rabdomere. Questa polarizzazione si scarica quindi passivamente attraverso la capacità della membrana del corpo cellulare fino a quando la membrana cellulare è ugualmente polarizzata. L'ERP è la registrazione extracellulare dello spostamento di carica. L'ERP registrato intracellulare manifesta l'ERP extracellulare integrato dalla costante temporale della membrana cellulare ^4,27,28. La corrente attivata dallo spostamento visivo della carica del pigmento potrebbe anche essere misurata nelle registrazioni a morsetto di tensione dell'intera cella^29,30 (Figura 5A-D), con il vantaggio principale (nelle registrazioni della corrente del recettore precoce (ERC)) di ridurre al minimo l'effetto della capacità della membrana sulla cinetica del segnale.

La sezione del protocollo descrive come eseguire misurazioni ERG da Drosophila eye⁹ e misurazioni ERC mediante registrazioni di cellule intere da ommatidi isolati da Drosophila ^31,32. Descriviamo anche protocolli specifici che vengono utilizzati per studiare la fototrasduzione in generale e i fotopigmenti in particolare.

Protocollo

1. Misurare la relazione di intensità di risposta, il postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) e il potenziale recettore precoce (ERP) utilizzando l'elettroretinogramma

1. Condizioni di allevamento adeguate per la preparazione di D. melanogaster
   1. Raise D. melanogaster vola in bottiglie contenenti mais giallo standard contenente alimenti in un'incubatrice mantenuta ad una temperatura di 24 °C e in un ciclo buio/luce di 12 ore
   2. Tenere le bottiglie di mosca al buio almeno 24 ore prima dell'esperimento.
2. Configurazione generale
   1. Preparare le pipette di registrazione tirando capillari di vetro borosilicato riempiti di fibra da 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) (Figura 6L, O). La resistenza delle pipette dovrebbe essere 5-10 MΩ; è possibile utilizzare qualsiasi estrattore adatto.
   2. Rivestire due fili d'argento con AgCl₂, inserendo filo d'argento da 0,25 mm nella soluzione 3 M KCl collegata a un alimentatore a 5 V su misura.
   3. Inserire ogni filo d'argento rivestito nei supporti degli elettrodi (Figura 6N).
   4. Riempire il capillare di vetro con la soluzione filtrata di Ringer (vedere Tabella 1) utilizzando una siringa a punta allungata (Figura 6M).
   5. Inserire l'elettrodo a filo nel capillare di vetro. Assicurarsi che la soluzione all'interno del capillare sia a contatto con il filo d'argento.
   6. Inserire i portaelettrodi (Figura 7P, N) nei due micromanipolatori dell'elettrodo (Figura 7G).
3. Procedura di preparazione della mosca per le registrazioni elettriche
   NOTA: per mantenere la mosca in condizioni di oscurità adattate, utilizzare solo l'illuminazione a luce rossa fioca durante i passaggi seguenti.
   1. Anestetizzare le mosche nella bottiglia con gas CO₂ utilizzando il sistema fly sleeper (Figura 6A, B) e versarle nel contenitore del dormiente.
   2. Scegli una mosca e tienila con cura per la sua ala usando una pinzetta affilata. Coprire il resto delle mosche con una capsula di Petri.
   3. Posiziona la mosca sul supporto della mosca nell'orientamento corretto, sdraiato su un fianco, con la schiena verso la mano (Figura 6P).
   4. Accendere l'alimentatore del saldatore. Impostare la corrente su ~2,25 A. Questa corrente dovrebbe riscaldare il filamento di platino-iridio da 0,25 mm a ~55-56 °C (vedere File supplementare).
   5. Posizionare una goccia di cera con una bassa temperatura di fusione (~55-56 °C) sul saldatore (Figura 6F).
   6. Usando una pinzetta, sollevare la mosca dalle ali e fissare le ali al portamonete (Figura 6I) usando il saldatore.
   7. Utilizzando il saldatore, collegare la schiena della mosca alla superficie del supporto con cera (Figura 6P).
   8. Abbassare la punta del saldatore sul punto di unione delle gambe e sciogliere la cera per coprire tutte le gambe insieme (Figura 6P).
   9. Posizionare una piccola goccia di cera tra la testa e la schiena nella zona del collo (Figura 6P).
      NOTA: Prestare particolare attenzione per evitare il surriscaldamento della testa di mosca. Assicurarsi che la mosca sia correttamente fissata e non sia in grado di muoversi durante l'esperimento; movimenti minori possono creare artefatti nelle registrazioni. Assicurarsi che le aperture della trachea (prese di respirazione) nel torace e nell'addome non siano coperte di cera.
   10. Posizionare il supporto della mosca (Figura 7Q) in una gabbia di Faraday scura su un blocco magnetico (Figura 7I) e assicurarsi che la mosca si trovi a ~ 5 mm dall'estremità della guida luminosa (Figura 7L).
   11. Posizionare l'elettrodo di registrazione (Figura 7P) sopra l'occhio della mosca e l'elettrodo di terra (Figura 7N) sopra la parte superiore della schiena della mosca usando i micromanipolatori.
   12. Inserire l'elettrodo di terra nella parte posteriore della mosca utilizzando i micromanipolatori.
   13. Inserire l'elettrodo di registrazione nella periferia esterna dell'occhio della mosca, preferibilmente, utilizzando i micromanipolatori.
       NOTA: Dopo aver inserito l'elettrodo nell'occhio, si osserverà una piccola fossetta; tirare l'elettrodo verso l'alto senza rimuoverlo dall'occhio fino a quando la fossetta scompare. Gli elettrodi possono anche essere immersi in piccole goccioline di gelatina di elettrodi applicate al busto e all'occhio.
4. Protocollo intensità-risposta
   1. Posizionare un filtro arancione (filtro bordo 590) davanti alla lampada allo xeno ad alta pressione. Utilizzare un filtro a densità neutra (ND) attenuante di grandi dimensioni (sei ordini di grandezza).
   2. Attendere 60 s al buio e dare un impulso luminoso di 5 s.
   3. Sostituire il filtro ND con un filtro ND meno attenuante con incrementi di un ordine di grandezza.
   4. Attendere 60 s al buio e dare un secondo impulso luminoso di 5 s.
   5. Ripetere i passaggi 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente l'intensità della luce utilizzando filtri ND meno attenuanti (l'ultimo impulso deve essere generato senza alcun filtro ND). Assicurarsi di utilizzare la serie di filtri ND nella giusta direzione, partendo da una grande attenuazione e raggiungendo una bassa attenuazione.
5. Protocollo PDA (questo protocollo può essere eseguito solo su mosche dagli occhi bianchi)
   1. Dare un impulso luminoso di 5 s di massima intensità usando un filtro arancione (filtro a bordo 590, per convertire il fotopigmento massimo nello stato R).
   2. Sostituire il filtro arancione con un filtro blu a banda larga (BP450/40 nm) e dare tre impulsi luminosi da 5 s alla massima intensità.
      NOTA: è anche possibile dare un lungo impulso di luce blu continua di massima intensità fino a raggiungere una risposta di tensione allo stato stazionario.
   3. Attendere 60 s al buio, sostituire il filtro blu con il precedente filtro arancione e dare due impulsi luminosi da 5 s con intervalli di 60 s.
6. Protocollo ERP/M-potenziale per la misurazione dello spettro di fotobilancio di M (questo protocollo può essere eseguito solo su mosche dagli occhi bianchi^10,25)
   1. Dare un impulso luminoso blu continuo (passabanda (BP) 450/40 nm) fino a raggiungere una risposta di tensione allo stato stazionario, che converte la quantità massima di fotopigmento dallo stato R allo stato M delle celle R1-6.
   2. Dare un breve (<3 ms) lampo di luce intensa di una lunghezza d'onda compresa tra 350-700 nm (lo spettro di assorbimento noto del fotopigmento delle cellule R1-6) utilizzando filtri passa-banda stretti (~ 20 nm) e misurare l'ampiezza di picco della fase M della risposta potenziale M (che riflette l'assorbimento della metarodopsina a questa specifica lunghezza d'onda al fotobilancio^10,25).
      NOTA: Per l'attivazione sincrona di un ampio pool di molecole di fotopigmento, è necessario un breve e intenso lampo di luce in modo che il contenuto di fotoni sia imballato in breve tempo. Il potenziale M è composto da due componenti: M1 (fase negativa corneale), che riflette lo spostamento di carica della metarodopsina nel fotorecettore, e M2 (fase^{corneale positiva 11,33}), che riflette la risposta M1 amplificata dei fotorecettori nella lamina ^9,10,11 . Ognuno di questi componenti può essere identificato e misurato. Tuttavia, è preferibile misurare il potenziale M1 poiché è una manifestazione lineare diretta dei livelli M. Se si utilizza M2, assicurarsi che la sua ampiezza sia nell'intervallo lineare utilizzando una lieve deprivazione carotenoide^24,25.
   3. Dare di nuovo un impulso luminoso blu continuo (BP450/40 nm), seguito da un breve (<1 ms) lampo di luce intensa di una lunghezza d'onda diversa.
   4. Ripetere questo protocollo fino a coprire l'intero spettro di assorbimento di M al fotoequilibrio.

2. Protocollo ERC per la misurazione dello spettro d'azione degli stati R e M delle celle R1-6 utilizzando registrazioni a morsetto di tensione a cella intera

NOTA: per un protocollo dettagliato per l'utilizzo di registrazioni a morsetto di tensione a cella intera, vedere Katz et ^al.34. Il potenziale M utilizza l'ERG per misurare l'attivazione dello stato M solo perché il contributo dello stato R è soppresso dalla capacità della membrana. Al contrario, l'ERC misura l'attivazione degli stati R (ERC positivo) e M (ERC negativo) perché le registrazioni a morsetto di tensione rimuovono l'effetto della capacità della membrana (vedi introduzione).

1. Convertire il fotopigmento nello stato desiderato (R o M). Per la conversione da R a M, in primo luogo, adattare le mosche con un breve flash blu adattivo (<1 ms) (BP450/40 nm). Per la conversione da M a R, dare un breve flash arancione adattivo (filtro bordo OG590).
2. Dare un breve lampo di luce (<1 ms) di una lunghezza d'onda compresa tra 350-700 nm e misurare l'ampiezza massima negativa o positiva della risposta ERC, che riflette l'assorbimento M / R a questa specifica lunghezza d'onda.
   NOTA: Per l'attivazione sincrona di un ampio pool di molecole di fotopigmento, è necessario un breve e intenso lampo di luce per impacchettare il contenuto di fotoni in una breve durata. La conversione massima del fotopigmento da R a M tramite flash blu può raggiungere circa l'80% delle molecole di fotopigmento totali a causa della sovrapposizione nello spettro di assorbimento di R e M (Figura 3A). Pertanto, a lunghezze d'onda inferiori a ~ 550 nm, l'ERC ha due componenti: una fase negativa che riflette la risposta della metarodopsina e una fase positiva che riflette la risposta della rodopsina rimanente. Il CER dipende linearmente dall'intensità della luce (Figura 5D). Di conseguenza, per derivare la sensibilità spettrale degli stati R e M, ogni fase dell'ERC deve essere normalizzata alle varie lunghezze d'onda per uguale energia²⁹.
3. Ripetere i passaggi 2.1.-2.2. utilizzando lampi di diverse lunghezze d'onda.
4. Traccia l'ERC positivo e negativo normalizzato in funzione della lunghezza d'onda.
   NOTA: Il forte lampo di luce induce una corrente massiccia attraverso i canali sensibili alla luce che porta a stress metabolico sul fotorecettore, che, a sua volta, provoca l'apertura del canale indipendente dalla luce. Il CER si sovrappone a questa corrente costitutiva.

Risultati

La Figura 2 esemplifica la robustezza e la facilità di utilizzo della tecnica ERG. È robusto perché viene registrato nella mosca praticamente intatta con una semplice tecnica di registrazioni di tensione extracellulare che richiedono una semplice configurazione elettrofisiologica. La robustezza si manifesta ottenendo registrazioni di risposte luminose con ampiezze relativamente grandi (nell'intervallo millivolt) anche quando le mutazioni riducono o distorcono fortemente la risposta alla l...

Discussione

Il principale vantaggio dell'utilizzo della preparazione del fotorecettore Drosophila è la sua accessibilità, la facilità e l'accuratezza della stimolazione luminosa e, soprattutto, la capacità di applicare il potere della genetica molecolare⁷. Ampi studi genetici hanno stabilito Drosophila come un sistema modello estremamente utile per la dissezione genetica di processi biologici complessi⁷. La struttura relativamente semplice del genoma di Drosop...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X