Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Özet

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Özet

Drosophila G-proteinine bağlı fotopigment rodopsin ( R ) bir protein (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Rodopsinin aktivasyon süreci, kromoforun foton emilimine neden olan izomerizasyonu ile başlatılır, opsinin konformasyonel değişikliklerini teşvik eder ve ikinci bir koyu kararlı fotopigment durumu (metarhodopsin, M) ile sonuçlanır. Bu iki kararlı fotopigmentin rastgele mutajenez kullanılarak araştırılması, mutant sineklerin taranması için basit ve sağlam yöntemler gerektirir. Bu nedenle, fonksiyonel fotopigment seviyelerindeki azalmaları ölçmek için çeşitli yöntemler tasarlanmıştır. Böyle bir yöntem, foton emilimini takiben fotopigment içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerde eksprese edilen büyük miktarda fotopigment molekülünü kullanır. Erken reseptör potansiyeli (veya erken reseptör akımı) olarak adlandırılan bu elektrik sinyali, çeşitli elektrofizyolojik yöntemlerle (örneğin, elektroretinogram ve tüm hücre kayıtları) ölçülür ve fonksiyonel fotopigment seviyeleri ile doğrusal olarak orantılıdır. Bu yöntemin avantajları, yüksek sinyal-gürültü oranı, fotopigment seviyelerinin doğrudan doğrusal ölçümü ve rodopsin veya metarodopsin aktivasyonuna kadar aşağı akış fototransdüksiyon mekanizmalarının bağımsızlığıdır. Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) adı verilen ek bir elektrofizyolojik yöntem, Drosophila fotopigmentinin bi-stabilitesini ve sinek R ve M pigment durumlarının emilim-spektral farklılıklarını kullanır. PDA, yoğun mavi ışık tarafından indüklenir, doygun miktarda rodopsinin metarodopsine dönüştürülmesi, karanlıkta uzun bir süre boyunca ışık tepkisi sonlandırmasının başarısız olmasına neden olur, ancak yoğun turuncu ışık kullanılarak metarodopsin'den rodopsine dönüşüm ile sonlandırılabilir. PDA, büyük fotopigment dönüşümü gerektiren sağlam bir sinyal olduğundan, fotopigmentin biyogenezindeki küçük kusurlar bile kolayca tespit edilen anormal PDA'ya yol açar. Gerçekten de, kusurlu PDA mutantları, fototransdüksiyon için önemli olan yeni sinyal proteinlerinin tanımlanmasına yol açmıştır.

Giriş

Bir G-proteinine bağlı reseptör (GPCR) olan ışıkla aktive olmuş rodopsin ( R ), bir 7 transmembran proteini (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Drosophila melanogaster'de (meyve sineği), foton absorpsiyonu, 11-cis-3-OH-retinal kromoforun all-trans-3-OH-retinal^1'e izomerizasyonunu indükleyerek rodopsinin metarodopsine konformasyonel değişimini teşvik eder (M, Şekil 1A). Omurgalı rodopsinin aksine, omurgasız kromoforun baskın fraksiyonu opsin'den ayrışmaz, bu da fizyolojik olarak aktif koyu kararlı pigment durumu M ile sonuçlanır. Buna karşılık, all-trans-3-OH-retinal kromofor tarafından ilave foton emilimi, kromofor ^2,3'ün izomerizasyonunu indükleyerek 11-cis-3-OH-retinal kromofor ile R pigment durumunu oluşturur. R durumu karanlık, stabil ve fizyolojik olarak aktif olmayan bir fotopigmenttir. Kromozom^4'ün son derece hızlı foton rejenerasyon yoluna ek olarak, omurgalı fotopigmentleri gibi, omurgasızlarda kromofor rejenerasyonu için alternatif bir enzimatik yavaş yol vardır, burada bazı aşamalar fotoreseptör hücrelerini çevreleyen retinal hücrelerde gerçekleştirilir ^5,6.

Drosophila, omurgasız fotoreseptörleri incelemek için model bir organizma olarak büyük avantajlar sağlar. Özellikle, preparatın erişilebilirliği ve moleküler genetiği uygulama yeteneği, Drosophila'yı güçlü bir model sistem haline getirmiştir⁷. Bu nedenle, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigment seviyelerini incelemek için çeşitli in vivo ve ex vivo deneysel yöntemler oluşturulmuştur. En basit in-vivo yöntem, Drosophila gözünün ışığına nispeten büyük hücre dışı olarak kaydedilen voltaj tepkisinden yararlanır. Buna göre, ışık stimülasyonu, tüm gözde, omurgalı gözlerinin ışığına verilen ERG tepkisinden ~ 3 kat daha büyük olan hücre dışı elektroretinogram (ERG) kaydı kullanılarak ölçülebilen bir elektriksel voltaj tepkisi uyandırır ^8,9. Drosophila ERG yanıtı sağlamdır ve kolayca elde edilir, bu da mutasyonlara bağlı ışık tepkisindeki anormallikleri tanımlamak için uygun bir yöntemdir. Işığa karşı ERG yanıtı esas olarak fotoreseptörlerden, pigment (glia) hücrelerinden ve laminanın ikincil nöronlarından kaynaklanır (bkz. Şekil 1B). ERG'nin ana bileşenleri (i) fotoreseptörlerin hücre dışı voltaj tepkisi, (ii) lamina nöronlarından kaynaklanan ışık uyaranının başlangıcındaki ve sonundaki "açık" ve "kapalı" geçicilerdir (Şekil 2A, giriş, AÇIK, KAPALI), (iii) glia hücrelerinin yavaş tepkisi (Şekil 2A, giriş, oklar) ve (iv) kısa ve geçici yanıt, fotopigment aktivasyonu sırasında ON geçici^10'dan önce gelen yük yer değiştirmesinden kaynaklanır (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu kısa yanıt iki fazdan oluşur (M1 ve M2, Şekil 2C [giriş]) ve sadece milyonlarca fotopigment molekülünü aynı anda aktive eden son derece güçlü ışık stimülasyonu ile indüklenebilir. Ne mavi stimülasyon altında (Şekil 2D, mavi iz) ne de fotopigment seviyeleri oldukça azalmış mutantlarda (Şekil 2E, kırmızı iz) gözlenmez, ancak PLC aktivitesini ortadan kaldıran bir mutantta genliği hafifçe artar (Şekil 2E, turuncu iz). M1 fazı, fotoreseptörlerde M'nin aktivasyonundan kaynaklanan sineğin tipik bir ERP'sidir. Pozitif bir polariteye sahip olan M1 fazı (hücre içi), işaret ters çeviren bir sinapsta normal şekilde bir nörotransmitter salgılar ve sinaptik olarak güçlendirilmiş M2 fazını üreterek fotoreseptör depolarizasyonuna yanıt veren lamina nöronlarını aktive eder. Böylece, hem M1 hem de M2 fazları M aktivasyonu^10,11'i yansıtır.

Fotoreseptörün depolarizasyonu, fotoreseptör akson ile lamina^10,11'in monopolar nöronları arasındaki işaret ters çeviren sinapstan kaynaklanan kornea pozitif "on" geçicisini ^{üretir (}Şekil 1B). ERG'nin yavaş yükselmesi ve çürümesi, esas olarak geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve TRP benzeri (TRPL) kanallar 13,14,15 aracılığıyla fotoreseptör hücrelerinden 12 K⁺ efflux nedeniyle pigment hücrelerinin depolarizasyonundan kaynaklanır (Şekil 2A, iç kısım^, oklar). Bu yavaş kinetik bileşenler, fotoreseptör yanıtının^{ışık 9,10'a} verdiği yanıtın hücre içi veya tüm hücre kayıtlarıyla karşılaştırıldığında^, fotoreseptör yanıtının dalga formunu büyük ölçüde maskeler ve bozar. Ek olarak, çok güçlü aydınlatmalarda, "açık" geçiciden önce gelen ve kısmen kaynaşan ek bir geçici tepki gözlenebilir (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu sinyal doğrudan fotopigment^10'un masif aktivasyonundan kaynaklanır.

Genel olarak gözü ve özellikle fototransdüksiyon kaskadını araştırmak için nötr yoğunluk (ND) ve renk filtrelerinin yanı sıra güçlü aydınlatıcı flaşlar kullanan çeşitli ışık rejimi protokolleri geliştirilmiştir. Bu protokoller fotopigmentin özelliklerini araştırmak için de kullanılmıştır.

Yoğunluk-yanıt protokolü, tüm gözün artan ışık yoğunluklarına karşı ERG voltaj tepkisinin tepe genliğini ölçer (Şekil 2A, B). Bu protokol, fotoreseptör hücrelerin ışığa duyarlılığındaki değişiklikleri tespit etmeye yardımcı^{olur 9}.

Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) protokolü, rodopsin ve metarodopsinin absorpsiyon spektrumlarındaki farklılıklardan yararlanır ve bu da Drosophila'da, R'nin fizyolojik olarak aktif ve koyu kararlı ara M durumu^2'ye büyük bir fotopigment dönüşümüne izin verir. ERG voltaj tepkisinde, nispeten kısa bir doygunluk ışığı darbesi verilir ve ortaya çıkan voltaj tepkisi kaydedilir. Bu durumda, depolarizasyon sinyali ile bir tavana (tersine çevirme potansiyeli) ulaşılır, çünkü büyük miktarda rodopsin molekülünün (~ 1 x 10⁸) yüzde birinin aktivasyonu tavana ulaşmak için yeterlidir. Fototransdüksiyon bileşenlerinin bolca bulunması, bu tavana, konsantrasyonda önemli bir azalma veya fototransdüksiyon bileşenlerinin ince bir arızası ile mutantlarda bile ulaşılmasını sağlar. Bu durum bu mutantların izolasyonunu engellemektedir. Pak ve ark., görsel mutantları izole etmek için güvenilir ve açıklayıcı bir test arayan PDA tarama^7'yi tanıttı. Drosophila'da , PDA yanıtı, fotopigment dönüşümüne izin veren kırmızı tarama pigmentinin genetik olarak çıkarılması ve tercihen rodopsin tarafından emilen mavi ışığın uygulanması (Şekil 3A) ile ortaya çıkar ve böylece R'nin M fotopigment durumuna büyük bir net dönüşümü ile sonuçlanır. Fototransdüksiyon sonlandırması, fotopigment seviyesinde, R'nin M'ye büyük bir net dönüşümü ile bozulur ve bu da ışık kapatıldıktan çok sonra sürekli uyarılma ile sonuçlanır (Şekil 2C, Şekil 4A [üst]). PDA döneminde, fotoreseptörler sonraki test ışıklarına karşı daha az hassastır ve kısmen duyarsızlaştırılır (inaktive edilir). PDA, rodopsin biyogenezindeki küçük kusurları bile tespit eder ve uzun süre uyarılmayı sürdürmek için fotoreseptör hücrenin maksimum kapasitesini test eder. Kesinlikle yüksek konsantrasyonlarda rodopsin varlığına bağlı olduğundan, fototransdüksiyon bileşenlerinin eksik yenilenmesi için kolayca puan alır. Dikkat çekici bir şekilde, PDA ekranı birçok yeni ve çok önemli görsel mutant vermiştir (Pak ve ^ark.7'de gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, Pak ve ^ark.7 tarafından izole edilen PDA mutantları, Drosophila görsel sistemini analiz etmek için hala son derece yararlıdır.

PDA, Drosophila'da mavi ışığı doyurarak indüklenir ve ışık ofsetinden çok sonra sürekli depolarizasyona neden olur (Şekil 4A [üst]). PDA ile indükleyen mavi ışığı doyurduktan sonra, periferik fotoreseptörler (R1-6) karanlıkta maksimum kapasitelerinde sürekli aktif kalır ve doygunluğa ulaşır. PDA sırasında ilave doygun mavi ışıklar, R1-6 hücrelerinde saniyeler boyunca herhangi bir ek yanıt üretmez, ancak PDA üzerine bindirilmiş R7-8 hücrelerinde bir yanıt indükler. Üst üste binen tepkiler, bu hücrelerde eksprese edilen fotopigmentlerin farklı absorpsiyon spektrumları ile açıklanmaktadır (R7-8)¹⁶. PDA, M'nin doygun turuncu ışıkla R'ye geri fotodönüşümü ile bastırılabilir (Şekil 4A [üst]). PDA'nın fotoreseptör hücrelerini maksimum aktif kapasitelerine getirme yeteneği, yoğun beyaz ışıkla elde edilemeyen bir durum, Drosophila'nın görsel mutantlarını taramak için neden önemli bir araç olduğunu açıklıyor. Bunun nedeni, normal fotopigment seviyelerinin biyogenezinde rol oynayan proteinlerdeki küçük kusurların bile tespit edilmesine izin vermesidir^17,18. İki grup PDA kusurlu mutantı izole edilmiştir: ne inaktivasyon ne de postpotansiyel (nina) mutantlar ve inaktivasyon, ancak postpotansiyel (ina) mutantlar değil. İlkinin fenotipi, bir PDA eksikliği ve fotopigment seviyelerindeki büyük bir azalmadan kaynaklanan ilişkili inaktivasyondur (Şekil 4A [orta]). İkincisinin fenotipi, mutantta normal rodopsin seviyelerine sahip, ancak TRP kanallarıyla etkileşime giren proteinlerden yoksun olan hala bilinmeyen bir mekanizma nedeniyle mavi ışıktan sonra inaktivasyon gösterir, ancak karanlık depolarizasyon yoktur (Şekil 4A [alt]).

PDA, M aktivitesi ^19,20,21'i bağlayan ve sonlandıran arrestine (ARR2) göre fotopigment miktarındaki farktan ^{kaynaklanır (}Şekil 1A). Drosophila fotoreseptörlerinde, fotopigment miktarı ARR2¹⁹ miktarından yaklaşık beş kat daha büyüktür. Bu nedenle, ARR2 seviyeleri, R'den M'ye büyük bir net fotodönüşümü ile üretilen tüm M moleküllerini etkisiz hale getirmek için yetersizdir ve karanlıkta 17,19,20,22,23 sürekli aktif olan M fazlalığını bırakır. Bu mekanizma, PDA yanıtının mutasyonlarla veya karotenoid yoksunluğu^24,25 ile ortadan kaldırılmasını açıklar, fotopigment seviyesinde bir azalmaya neden olur^, ancak arrestin seviyelerini etkilemez. Dahası, bu açıklama aynı zamanda null ARR2 (arr2³) mutant alel^21'in fenotiplerini de açıklamaktadır, burada PDA, ~ 10 kat daha kısık mavi ışık yoğunluklarında^19,20,21'de elde edilebilir (Şekil 4B^, C). PDA, sinek fotoreseptörlerinin benzersiz bir özelliği değildir ve R durumundan farklı bir absorpsiyon spektrumuna sahip karanlık kararlı M'ye sahip test edilen her türde ortaya çıkar ve fotopigmentin R'den M durumuna yeterli fotodönüşümüne izin verir. PDA fenomenolojisinin keşfedildiği iyice araştırılmış bir tür, R durumunun absorpsiyon spektrumunun M durumu^2'den daha uzun bir dalga boyunda olduğu barnacle (Balanus) fotoreseptörüdür (Şekil 3B). Buna göre, sinekteki durumun aksine, ahırda, turuncu-kırmızı ışık bir PDA'yı indüklerken, mavi ışık PDA^2'yi bastırır.

Erken reseptör potansiyeli (ERP) protokolü, R veya M aktivasyonu sırasında meydana gelen yük yer değiştirmesinden yararlanır. Görsel pigment, hem omurgalı hem de omurgasız membranların sinyal bölmesinin yüzey zarının ayrılmaz bir parçasıdır³. Buna göre, fotopigment moleküllerinin bir ara durumdan diğerine değiştiği aktivasyon sürecine, ^4,26'lık bir yük yer değiştirmesi eşlik eder. Fotopigment molekülleri, membran kapasitansı^4'e paralel olarak elektriksel olarak hizalandığından, hızlı bir senkronize konformasyonel değişim, yüzey zarının hızlı bir polarizasyon değişimini üretir; bu, sineklerde, rabdomere adı verilen ~ 30.000-50.000 mikrovillusluk bir yığından oluşan sinyal bölmesinde meydana gelir. Bu polarizasyon daha sonra hücre zarı eşit derecede polarize olana kadar hücre gövdesinin membran kapasitansından pasif olarak boşalır. ERP, yük yer değiştirmesinin hücre dışı kaydıdır. Hücre içi olarak kaydedilen ERP,^hücre zarının zaman sabiti 4,27,28 ile entegre edilmiş hücre dışı ^ERP'yi gösterir. Görsel pigment yükü deplasmanı tarafından aktive edilen akım, membran kapasitansının sinyalin kinetik üzerindeki etkisini en aza indirmenin en büyük avantajı (erken reseptör akımı (ERC) kayıtları) ile tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtlarında^29,30 (Şekil 5A-D) olarak da ölçülebilir.

Protokol bölümü, Drosophila göz^{9'dan ERG ölçümlerinin} ve Drosophila izole ommatidia ^31,32'den tüm hücre kayıtlarıyla ERC ölçümlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigmentleri araştırmak için kullanılan spesifik protokolleri de açıklıyoruz.

Protokol

1. Elektroretinogram kullanılarak yoğunluk yanıtı ilişkisinin, uzamış depolarizan artçı potansiyelin (PDA) ve erken reseptör potansiyelinin (ERP) ölçülmesi

1. D. melanogaster hazırlığı için uygun yetiştirme koşulları
   1. D. melanogaster sineklerini, 24 ° C sıcaklıkta ve 12 saatlik karanlık / ışık döngüsünde tutulan bir inkübatörde yiyecek içeren standart sarı mısır içeren şişelerde yükseltin
   2. Sinek şişelerini deneyden en az 24 saat önce karanlıkta tutun.
2. Genel kurulum
   1. Kayıt pipetlerini 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) fiber dolgulu borosilikat cam kılcal damarları çekerek hazırlayın (Şekil 6L, O). Pipetlerin direnci 5-10 MΩ olmalıdır; uygun herhangi bir çektirme kullanılabilir.
   2. İki gümüş teli AgCl₂ ile kaplayın ve 0,25 mm gümüş teli özel yapım 5 V güç kaynağına bağlı 3 M KCl çözeltisine yerleştirin.
   3. Kaplanmış her gümüş teli elektrot tutuculara yerleştirin (Şekil 6N).
   4. Cam kılcal damarı, uzun uçlu bir şırınga (Şekil 6M) kullanarak filtrelenmiş Ringer çözeltisi (bakınız Tablo 1) ile doldurun.
   5. Tel elektrodu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal damar içindeki çözeltinin gümüş tel ile temas halinde olduğundan emin olun.
   6. Elektrot tutucuları (Şekil 7P, N) iki elektrot mikromanipülatörüne (Şekil 7G) yerleştirin.
3. Sineği elektrik kayıtları için hazırlama prosedürü
   NOT: Sineği karanlığa uyarlanmış koşullar altında tutmak için, aşağıdaki adımlar sırasında yalnızca loş kırmızı ışık aydınlatmasını kullanın.
   1. Sinek yataklı sistemini kullanarak şişedeki sinekleri CO₂ gazı ile uyuşturun (Şekil 6A, B) ve uyuyan kaba dökün.
   2. Bir sinek seçin ve keskin bir cımbız kullanarak kanadından dikkatlice tutun. Sineklerin geri kalanını bir Petri kabı ile örtün.
   3. Sineği sinek tutucunun üzerine, sırtı ele doğru olacak şekilde, yan yatarak doğru yönde yerleştirin (Şekil 6P).
   4. Havyanın güç kaynağını AÇIN. Geçerli değeri ~2,25 A olarak ayarlayın. Bu akım 0,25 mm platin-iridyum filamentini ~55-56 ° C'ye ısıtmalıdır (Ek Dosyaya bakınız).
   5. Havya üzerine düşük erime sıcaklığına (~ 55-56 ° C) sahip bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 6F).
   6. Cımbız kullanarak, sineği kanatlarından kaldırın ve havyayı kullanarak kanatlarını sinek tutucusuna sabitleyin (Şekil 6I).
   7. Lehimleme demirini kullanarak, sineğin sırtını balmumu ile stand yüzeyine bağlayın (Şekil 6P).
   8. Havyanın ucunu bacakların birleşme noktasına indirin ve tüm bacakları birlikte örtmek için balmumunu eritin (Şekil 6P).
   9. Boyun bölgesinde baş ve sırt arasına küçük bir damla balmumu yerleştirin (Şekil 6P).
      NOT: Sinek kafasının aşırı ısınmasını önlemek için özel dikkat gösterin. Sineğin düzgün bir şekilde sabitlendiğinden ve deney sırasında hareket edemediğinden emin olun; küçük hareketler kayıtlarda eserler oluşturabilir. Toraks ve karın bölgesindeki trakea açıklıklarının (solunum girişleri) balmumu ile kaplanmadığından emin olun.
   10. Sinek tutucuyu (Şekil 7Q) bir mıknatıs bloğu üzerindeki karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin (Şekil 7I) ve sineğin ışık kılavuzunun ucundan ~ 5 mm uzakta olduğundan emin olun (Şekil 7L).
   11. Kayıt elektrodunu (Şekil 7P) sinek gözünün üzerine ve toprak elektrodunu (Şekil 7N) mikromanipülatörleri kullanarak sineğin üst sırtına yerleştirin.
   12. Mikromanipülatörleri kullanarak toprak elektrodunu sineğin arkasına yerleştirin.
   13. Kayıt elektrodunu sinek gözünün dış çevresine, tercihen mikromanipülatörleri kullanarak yerleştirin.
       NOT: Elektrodu göze yerleştirdikten sonra, küçük bir çukur gözlenecektir; gamzesi kaybolana kadar elektrodu gözden çıkarmadan yukarı doğru çekin. Elektrotlar ayrıca gövdeye ve göze uygulanan küçük elektrot jölesi damlacıklarına daldırılabilir.
4. Yoğunluk-tepki protokolü
   1. Yüksek basınçlı Xenon lambasının önüne turuncu bir filtre (590 kenarlı filtre) yerleştirin. Büyük (altı büyüklük sırasıyla) zayıflatıcı nötr yoğunluk (ND) filtresi kullanın.
   2. Karanlıkta 60 s bekleyin ve 5 s ışık darbesi verin.
   3. ND filtresini, büyüklük artışlarının bir sırasına göre daha az zayıflatıcı bir ND filtresiyle değiştirin.
   4. Karanlıkta 60 s bekleyin ve ikinci bir 5 s ışık darbesi verin.
   5. Daha az zayıflatıcı ND filtreleri kullanarak ışık yoğunluğunu kademeli olarak artırarak Adım 1.4.1.-1.4.4'ü tekrarlayın (son darbe hiç ND filtresi olmadan oluşturulmalıdır). ND filtre serisini, büyük zayıflamadan başlayarak ve düşük zayıflamaya ulaşan doğru yönde kullandığınızdan emin olun.
5. PDA protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde yapılabilir)
   1. Turuncu bir filtre kullanarak maksimum yoğunlukta 5 sn ışık darbesi verin (maksimum fotopigmenti R durumuna dönüştürmek için 590 kenarlı filtre).
   2. Turuncu filtreyi geniş bantlı mavi (BP450/40 nm) bir filtreyle değiştirin ve maksimum yoğunlukta üç adet 5 s ışık darbesi verin.
      NOT: Kararlı durum voltaj tepkisine ulaşılana kadar uzun bir sürekli maksimum yoğunlukta mavi ışık darbesi vermek de mümkündür.
   3. Karanlıkta 60 s bekleyin, mavi filtreyi önceki turuncu filtreyle değiştirin ve 60 s aralıklarla iki adet 5 s ışık darbesi verin.
6. M'nin foto-denge spektrumunu ölçmek için ERP / M potansiyel protokolü (bu protokol sadece beyaz gözlü sineklerde gerçekleştirilebilir^10,25)
   1. Kararlı durum voltaj tepkisine ulaşana kadar sürekli mavi (bandpass (BP) 450/40 nm) ışık darbesi verin, bu da maksimum fotopigment miktarını R durumundan R1-6 hücrelerinin M durumuna dönüştürür.
   2. Dar (~ 20 nm) bandpass filtreleri kullanarak 350-700 nm (R1-6 hücreleri fotopigmentinin bilinen absorpsiyon spektrumu) arasındaki bir dalga boyunda kısa (<3 ms) yoğun bir ışık parlaması verin ve M potansiyel yanıtının M1 fazının tepe genliğini ölçün (foto-denge ^10,25'te bu spesifik dalga boyundaki metarodopsin absorpsiyonunu yansıtır).
      NOT: Büyük bir fotopigment molekülü havuzunun senkron aktivasyonu için, foton içeriğinin kısa sürede paketlenmesi için kısa, yoğun bir ışık parlaması gereklidir. M potansiyeli iki bileşenden oluşur: Fotoreseptördeki metarodopsinin yük yer değiştirmesini yansıtan M1 (kornea negatif faz) ve laminadaki fotoreseptörlerin yükseltilmiş^M1 tepkisini yansıtan M2 (kornea pozitif faz 11,33)^9,10,11 . Bu bileşenlerin her biri tanımlanabilir ve ölçülebilir. Bununla birlikte, M1 potansiyelinin ölçülmesi tercih edilir, çünkü M seviyelerinin doğrudan doğrusal bir tezahürüdür. M2 kullanılıyorsa, hafif karotenoid yoksunluğu^24,25 kullanarak genliğinin doğrusal aralıkta olduğundan emin olun.
   3. Tekrar sürekli mavi (BP450/40 nm) ışık darbesi verin, ardından farklı dalga boyunda kısa (<1 ms) yoğun bir ışık parlaması izleyin.
   4. Fotoğraf dengesinde M'nin tüm absorpsiyon spektrumu kaplanana kadar bu protokolü tekrarlayın.

2. Tüm hücre voltaj kelepçeli kayıtları kullanarak R'nin etki spektrumunu ve R1-6 hücrelerinin M durumlarını ölçmek için ERC protokolü

NOT: Tüm hücre voltaj kelepçeli kayıtları kullanmak için ayrıntılı bir protokol için, Katz ve ^ark.34'e bakınız. M-potansiyeli, M durumunun aktivasyonunu ölçmek için ERG'yi kullanır, çünkü R durumunun katkısı membran kapasitansı tarafından bastırılır. Buna karşılık, ERC hem R (pozitif ERC) hem de M (negatif ERC) durumlarının aktivasyonunu ölçer, çünkü voltaj kelepçeli kayıtlar membran kapasitansının etkisini ortadan kaldırır (girişe bakınız).

1. Fotopigmenti istenen duruma (R veya M) dönüştürün. R'den M'ye dönüşüm için, önce sinekleri kısa (<1 ms) uyarlanabilir mavi (BP450/40 nm) flaşla uyarlayın. M'den R'ye dönüştürme için, kısa bir uyarlanabilir turuncu (OG590 kenar filtresi) flaş verin.
2. 350-700 nm arasında bir dalga boyunda kısa bir ışık parlaması (<1 ms) verin ve bu spesifik dalga boyunda M / R absorpsiyonunu yansıtan ERC yanıtının maksimum negatif veya pozitif genliğini ölçün.
   NOT: Büyük bir fotopigment molekülü havuzunun senkron aktivasyonu için, foton içeriğini kısa sürede paketlemek için kısa, yoğun bir ışık parlaması gerekir. Mavi flaşla R'den M'ye maksimum fotopigment dönüşümü, R ve M'nin absorpsiyon spektrumundaki örtüşme nedeniyle toplam fotopigment moleküllerinin ~% 80'ine ulaşabilir (Şekil 3A). Bu nedenle, ~ 550 nm'nin altındaki dalga boylarında, ERC'nin iki bileşeni vardır: metarodopsinin tepkisini yansıtan negatif bir faz ve kalan rodopsinin tepkisini yansıtan pozitif bir faz. ERC doğrusal olarak ışık yoğunluğuna bağlıdır (Şekil 5D). Buna göre, R ve M durumlarının spektral duyarlılığını elde etmek için, ERC'nin her fazının eşit enerji²⁹ için çeşitli dalga boylarında normalleştirilmesi gerekir.
3. 2.1.-2.2 numaralı adımları yineleyin. farklı dalga boylarındaki flaşları kullanarak.
4. Normalleştirilmiş pozitif ve negatif ERC'yi dalga boyunun bir fonksiyonu olarak çizin.
   NOT: Güçlü ışık parlaması, ışığa duyarlı kanallar boyunca fotoreseptör üzerinde metabolik strese yol açan büyük bir akım indükler ve bu da ışıktan bağımsız kanal açılmasına neden olur. ERC bu kurucu akım üzerine bindirilmiştir.

Sonuçlar

Şekil 2, ERG tekniğinin sağlamlığını ve kullanım kolaylığını örneklemektedir. Sağlamdır, çünkü basit bir elektrofizyolojik kurulum gerektiren basit bir hücre dışı voltaj kayıtları tekniği ile neredeyse bozulmamış sinekte kaydedilir. Sağlamlık, mutasyonlar ışık tepkisini güçlü bir şekilde azalttığında veya bozduğunda bile, nispeten büyük genliklere sahip (milivolt aralığında) ışık tepkilerinin kayıtlarının elde edilmesiyle kendini gösterir. ...

Tartışmalar

Drosophila fotoreseptör preparatını kullanmanın en büyük avantajı, erişilebilirliği, ışık stimülasyonunun kolaylığı ve doğruluğu ve en önemlisi, moleküler genetiğin gücünü uygulama yeteneğidir⁷. Kapsamlı genetik çalışmalar, Drosophila'yı karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece yararlı bir model sistem olarak kurmuştur⁷. Drosophila genomunun nispeten basit yapısı (X ve Y cinsiyet kro...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X