Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

Resumen

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Resumen

El fotopigmento acoplado a la proteína G de Drosophila rodopsina (R) está compuesto por una proteína (opsina) y un cromóforo. El proceso de activación de la rodopsina se inicia mediante la isomerización inductora de absorción de fotones del cromóforo, promoviendo cambios conformacionales de la opsina y dando como resultado un segundo estado de fotopigmento oscuro-estable (metarhodopsina, M). La investigación de este fotopigmento biestable utilizando mutagénesis aleatoria requiere métodos simples y robustos para detectar moscas mutantes. Por lo tanto, se han diseñado varios métodos para medir las reducciones en los niveles de fotopigmento funcional. Uno de estos métodos explota los desplazamientos de carga dentro del fotopigmento después de la absorción de fotones y las enormes cantidades de moléculas de fotopigmento expresadas en los fotorreceptores. Esta señal eléctrica, llamada potencial del receptor temprano (o corriente temprana del receptor), se mide mediante una variedad de métodos electrofisiológicos (por ejemplo, electrorretinograma y registros de células enteras) y es linealmente proporcional a los niveles de fotopigmento funcional. Las ventajas de este método son la alta relación señal-ruido, la medición lineal directa de los niveles de fotopigmento y la independencia de los mecanismos de fototransducción aguas abajo de la activación de rodopsina o metarhodopsina. Un método electrofisiológico adicional llamado postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota la biestabilidad del fotopigmento de Drosophila y las diferencias espectrales de absorción de los estados de pigmento R y M de la mosca. El PDA es inducido por la luz azul intensa, convirtiendo cantidades saturadas de rodopsina en metarhodopsina, lo que resulta en la falla de la terminación de la respuesta a la luz durante un tiempo prolongado en la oscuridad, pero puede ser terminado por la conversión de metarhodopsina a rodopsina utilizando luz naranja intensa. Dado que el PDA es una señal robusta que requiere una conversión masiva de fotopigmentos, incluso pequeños defectos en la biogénesis del fotopigmento conducen a un PDA anormal fácilmente detectado. De hecho, los mutantes PDA defectuosos condujeron a la identificación de nuevas proteínas de señalización importantes para la fototransducción.

Introducción

La rodopsina activada por la luz (R), que es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR), está compuesta por una proteína transmembrana 7 (opsina) y un cromóforo. En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), la absorción de fotones induce la isomerización del cromóforo 11-cis-3-OH-retinal a all-trans-3-OH-retinal¹, promoviendo el cambio conformacional de la rodopsina a metarhodopsina (M, Figura 1A). A diferencia de la rodopsina de vertebrados, la fracción predominante del cromóforo de invertebrados no se disocia de la opsina, lo que resulta en el estado de pigmento fisiológicamente activo oscuro-estable M. A su vez, la absorción adicional de fotones por el cromóforo all-trans-3-OH-retinal induce la isomerización del cromóforo ^2,3, generando el estado pigmentario R con el cromóforo 11-cis-3-OH-retinal. El estado R es un fotopigmento oscuro, estable y fisiológicamente no activo. Además de la ruta de regeneración de fotones extremadamente rápida del cromóforo⁴, al igual que los fotopigmentos de vertebrados, existe una ruta lenta enzimática alternativa para la regeneración de cromóforos en los invertebrados, en la que algunas de las etapas se realizan en las células de la retina que rodean las células fotorreceptoras ^5,6.

Drosophila conlleva grandes ventajas como organismo modelo para el estudio de fotorreceptores de invertebrados. En particular, la accesibilidad de la preparación y la capacidad de aplicar la genética molecular han hecho de Drosophila un poderoso sistema modelo⁷. Por lo tanto, se han establecido varios métodos experimentales in vivo y ex vivo para estudiar la fototransducción en general y los niveles de fotopigmento, en particular. El método in vivo más simple explota la respuesta de voltaje extracelularmente registrada relativamente grande a la luz del ojo de Drosophila. En consecuencia, la estimulación de la luz evoca una respuesta de voltaje eléctrico en todo el ojo que se puede medir utilizando el registro de electrorretinograma extracelular (ERG), que es ~ 3 órdenes de magnitud mayor que la respuesta ERG a la luz de los ojos de los vertebrados ^8,9. La respuesta ERG de Drosophila es robusta y fácil de obtener, lo que la convierte en un método conveniente para identificar anomalías en la respuesta a la luz debido a mutaciones. La respuesta del ERG a la luz surge principalmente de los fotorreceptores, las células pigmentarias (glía) y las neuronas secundarias de la lámina (ver Figura 1B). Los componentes principales del ERG son (i) la respuesta de voltaje extracelular de los fotorreceptores, (ii) los transitorios "on" y "off" al principio y al final del estímulo de luz que surgen de las neuronas de la lámina (Figura 2A, recuadro, ON, OFF), (iii) la respuesta lenta de las células gliales (Figura 2A, recuadro, flechas), y (iv) la respuesta breve y transitoria, resultante del desplazamiento de la carga durante la activación del fotopigmento que precede al transitorio^{ON 10} (Figura 2C [recuadro], D, E). Esta breve respuesta se compone de dos fases (M1 y M2, Figura 2C [recuadro]) y solo puede ser inducida por una estimulación de luz extremadamente fuerte, que activa simultáneamente millones de moléculas de fotopigmento. No se observa bajo estimulación azul (Figura 2D, traza azul) ni en mutantes con niveles de fotopigmento muy reducidos (Figura 2E, traza roja), pero su amplitud se mejora ligeramente en un mutante que abole la actividad plc (Figura 2E, traza naranja). La fase M1 es un ERP típico de la mosca que surge de la activación de M en los fotorreceptores. La fase M1, que tiene una polaridad positiva (intracelularmente), libera un neurotransmisor de forma normal en una sinapsis inversora de signos y activa las neuronas de la lámina, que responden a la despolarización del fotorreceptor generando la fase M2 amplificada sinápticamente. Así, tanto las fases M1 como M2 reflejan la activación M^10,11.

La despolarización del fotorreceptor genera el transitorio "on" corneal-positivo, que surge de la sinapsis inversora de signos entre el axón fotorreceptor y las neuronas monopolares de la lámina^10,11 (Figura 1B). El lento ascenso y decaimiento del ERG surgen de la despolarización de las células pigmentarias (Figura 2A, recuadro, flechas) debido principalmente al eflujo K⁺ de las células fotorreceptoras¹² a través de los canales de potencial receptor transitorio (TRP) y TRP-like (TRPL) 13,14,15. Estos componentes cinéticos lentos enmascaran y distorsionan en gran medida la forma de onda de la respuesta del fotorreceptor en comparación con los registros intracelulares o de células enteras de la respuesta del fotorreceptor a la luz ^9,10. Además, a iluminaciones muy fuertes, se puede observar una respuesta transitoria adicional, que precede y se fusiona parcialmente con el transitorio "encendido" (Figura 2C [recuadro],D,E). Esta señal se origina directamente a partir de la activación masiva del fotopigmento¹⁰.

Se han desarrollado varios protocolos de régimen de luz que utilizan filtros de densidad neutra (ND) y de color, así como fuertes destellos de iluminación, para investigar el ojo en general y la cascada de fototransducción en particular. Estos protocolos también se han utilizado para investigar las propiedades del fotopigmento.

El protocolo de intensidad-respuesta mide la amplitud máxima de la respuesta de voltaje ERG de todo el ojo al aumento de las intensidades de luz (Figura 2A, B). Este protocolo ayuda a detectar cambios en la sensibilidad de las células fotorreceptoras a la luz⁹.

El protocolo postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota las diferencias en los espectros de absorción de rodopsina y metarhodopsina que permite, en Drosophila, una conversión fotopigmentada masiva de R a su estado intermedio M fisiológicamente activo y oscuro-estable². En la respuesta de voltaje ERG, se da un pulso relativamente corto de luz saturada, y se registra la respuesta de voltaje resultante. Bajo esta condición, la señal de despolarización alcanza un techo (potencial de inversión) porque la activación de una fracción de un porcentaje de la enorme cantidad de moléculas de rodopsina (~ 1 x 10⁸) es suficiente para alcanzar el techo. La presencia de los componentes de fototransducción en gran abundancia asegura que este techo se alcanzará incluso en mutantes con una reducción significativa en la concentración o un mal funcionamiento sutil de los componentes de fototransducción. Esta situación impide el aislamiento de estos mutantes. Pak et al. introdujeron el PDA screening⁷ buscando una prueba confiable y reveladora para aislar mutantes visuales. En Drosophila, la respuesta PDA se produce mediante la eliminación genética del pigmento rojo de cribado, que permite la conversión de fotopigmentos, y la aplicación de luz azul, que es absorbida preferentemente por la rodopsina (Figura 3A) y, por lo tanto, da como resultado una gran conversión neta de la R al estado de fotopigmento M. La terminación de la fototransducción se interrumpe a nivel del fotopigmento por una gran conversión neta de R a M, lo que, a su vez, da como resultado una excitación sostenida mucho después de que se apaga la luz (Figura 2C, Figura 4A [arriba]). Durante el período de PDA, los fotorreceptores son menos sensibles a las luces de prueba posteriores y están parcialmente insensibilizados (inactivados). El PDA detecta incluso defectos menores en la biogénesis de rodopsina y prueba la capacidad máxima de la célula fotorreceptora para mantener la excitación durante un período prolongado. Dado que depende estrictamente de la presencia de altas concentraciones de rodopsina, califica fácilmente para la reposición deficiente de los componentes de fototransducción. Sorprendentemente, la pantalla PDA ha producido muchos mutantes visuales nuevos y muy importantes (revisados en Pak et ^al.7). Por lo tanto, los mutantes PDA aislados por Pak et ^al.7 siguen siendo extremadamente útiles para analizar el sistema visual de Drosophila .

El PDA es inducido en Drosophila por la saturación de luz azul, lo que resulta en una despolarización continua mucho después del desplazamiento de la luz (Figura 4A [arriba]). Después de saturar la luz azul inductora de PDA, los fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecen continuamente activos en la oscuridad a su capacidad máxima, alcanzando la saturación. Las luces azules saturadas adicionales durante el PDA no producen ninguna respuesta adicional en las células R1-6 durante muchos segundos, sino que inducen una respuesta en las células R7-8 que se superpone a la PDA. Las respuestas superpuestas se explican por los diferentes espectros de absorción de los fotopigmentos expresados en estas células (R7-8)¹⁶. El PDA puede ser suprimido por la fotoconversión de M de vuelta a R con luz naranja saturada (Figura 4A [arriba]). La capacidad del PDA para llevar a las células fotorreceptoras a su capacidad activa máxima, una situación que no se puede lograr con luz blanca intensa, explica por qué ha sido una herramienta importante para detectar mutantes visuales de Drosophila. Esto se debe a que permite la detección de incluso defectos menores en proteínas implicadas en la biogénesis de niveles normales de fotopigmento^17,18. Se han aislado dos grupos de mutantes defectuosos de PDA: ni mutantes de inactivación ni después de potenciales (nina) e inactivación, pero no mutantes postpotenciales (ina). El fenotipo del primero es la falta de un CAP y la inactivación asociada que surge de una gran reducción en los niveles de fotopigmento (Figura 4A [medio]). El fenotipo de este último muestra inactivación pero no despolarización oscura después de la luz azul debido a un mecanismo aún desconocido en el mutante con niveles normales de rodopsina pero carente de proteínas que interactúan con los canales TRP (Figura 4A [abajo]).

El PDA surge de la diferencia en la cantidad de fotopigmento en relación con la arrestina (ARR2), que une y termina la actividad M 19,20,21 (Figura 1A). En los fotorreceptores de Drosophila, la cantidad del fotopigmento es aproximadamente cinco veces mayor que la cantidad de ARR2¹⁹. Así, los niveles de ARR2 son insuficientes para inactivar todas las moléculas M generadas por una gran fotoconversión neta de R a M, dejando un exceso de M constantemente activo en la oscuridad 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica la eliminación de la respuesta del CAP por mutaciones o por privación de carotenoides^24,25, provocando una reducción del nivel de fotopigmento, pero no afecta a los niveles de arrestina. Además, esta explicación también explica los fenotipos del alelo²¹ mutante nulo ARR2 (^{arr2 3}), en el que se podría lograr PDA a intensidades de luz azul más tenues ~ 10 veces 19,20,21 (Figura 4B, C). El PDA no es una característica única de los fotorreceptores de mosca, y aparece en todas las especies probadas que tiene M estable oscuro con un espectro de absorción diferente al del estado R, lo que permite una fotoconversión suficiente del fotopigmento del estado R al estado M. Una especie investigada a fondo en la que se descubrió la fenomenología PDA es el fotorreceptor percebe (Balanus), en el que el espectro de absorción del estado R está en una longitud de onda más larga que el estado M² (Figura 3B). En consecuencia, a diferencia de la situación en la mosca, en el percebe, la luz naranja-roja induce un PDA, mientras que la luz azul suprime el PDA².

El protocolo de potencial del receptor temprano (ERP) explota el desplazamiento de carga que ocurre durante la activación de R o M. El pigmento visual es una parte integral de la membrana superficial del compartimento de señalización de las membranas de vertebrados e invertebrados³. En consecuencia, el proceso de activación en el que las moléculas de fotopigmento cambian de un estado intermedio a otro se acompaña de un desplazamiento de carga ^4,26. Como las moléculas de fotopigmento se alinean eléctricamente en paralelo con la capacitancia^{de membrana 4}, un cambio conformacional sincronizado rápido genera un cambio de polarización rápido de la membrana superficial, que, en las moscas, ocurre en el compartimiento de señalización compuesto por una pila de ~ 30,000-50,000 microvellosidades llamada rabdomere. Esta polarización luego se descarga pasivamente a través de la capacitancia de membrana del cuerpo celular hasta que la membrana celular está igualmente polarizada. El ERP es el registro extracelular del desplazamiento de carga. El ERP registrado intracelularmente manifiesta el ERP extracelular integrado por la constante de tiempo de la membrana celular ^4,27,28. La corriente activada por el desplazamiento de la carga visual del pigmento también podría medirse en registros de pinzas de voltaje de celda entera^29,30 (Figura 5A-D), con la gran ventaja (en registros de corriente de receptor temprano (ERC)) de minimizar el efecto de la capacitancia de membrana en la cinética de la señal.

La sección de protocolo describe cómo realizar mediciones de ERG a partir de Drosophila eye⁹ y mediciones de ERC mediante registros de células enteras de ommatidia aislada de Drosophila ^31,32. También describimos protocolos específicos que se utilizan para investigar la fototransducción en general y los fotopigmentos en particular.

Protocolo

1. Medición de la relación de respuesta de intensidad, postpotencial de despolarización prolongada (PDA) y el potencial receptor temprano (ERP) utilizando el electrorretinograma

1. Condiciones de cría adecuadas para la preparación de D. melanogaster
   1. Criar moscas D. melanogaster en botellas que contengan alimentos que contengan maíz amarillo estándar en una incubadora mantenida a una temperatura de 24 °C y en un ciclo oscuro/claro de 12 h
   2. Mantenga las botellas de mosca en la oscuridad al menos 24 horas antes del experimento.
2. Configuración general
   1. Prepare pipetas de grabación tirando de capilares de vidrio llenos de fibra de 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) llenos de fibra (Figura 6L, O). La resistencia de las pipetas debe ser de 5-10 MΩ; se puede utilizar cualquier tirador adecuado.
   2. Cubra dos cables de plata con AgCl₂, insertando alambre de plata de 0,25 mm en una solución KCl de 3 M conectada a una fuente de alimentación de 5 V hecha a medida.
   3. Inserte cada alambre de plata recubierto en los soportes de los electrodos (Figura 6N).
   4. Llene el capilar de vidrio con la solución filtrada de Ringer (ver Tabla 1) usando una jeringa de punta alargada (Figura 6M).
   5. Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata.
   6. Inserte los soportes de electrodos (Figura 7P, N) en los dos micromanipuladores de electrodos (Figura 7G).
3. Procedimiento de preparación de la mosca para grabaciones eléctricas
   NOTA: Para mantener la mosca en condiciones adaptadas a la oscuridad, use solo iluminación de luz roja tenue durante los siguientes pasos.
   1. Anestesiar las moscas en la botella con gas CO₂ utilizando el sistema fly sleeper (Figura 6A, B) y verterlas en el recipiente de la traviesa.
   2. Elija una mosca y sosténgala cuidadosamente por su ala con una pinza afilada. Cubre el resto de las moscas con una placa de Petri.
   3. Coloque la mosca en el soporte de la mosca en la orientación adecuada, acostada de lado, con la espalda hacia la mano (Figura 6P).
   4. Encienda la fuente de alimentación del soldador. Establezca la corriente en ~2.25 A. Esta corriente debe calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 mm a ~55-56 °C (consulte el archivo complementario).
   5. Coloque una gota de cera con una temperatura de fusión baja (~ 55-56 ° C) en el soldador (Figura 6F).
   6. Usando pinzas, levante la mosca de sus alas y fije sus alas al soporte de la mosca (Figura 6I) usando el soldador.
   7. Usando el soldador, conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera (Figura 6P).
   8. Baje la punta del soldador sobre el punto de unión de las patas y derrita la cera para cubrir todas las patas juntas (Figura 6P).
   9. Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y la espalda en el área del cuello (Figura 6P).
      NOTA: Tenga especial cuidado para evitar el sobrecalentamiento de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que la mosca esté correctamente fijada y no pueda moverse durante el experimento; movimientos menores pueden crear artefactos en las grabaciones. Asegúrese de que las aberturas de la tráquea (entradas de respiración) en el tórax y el abdomen no estén cubiertas con cera.
   10. Coloque el soporte para moscas (Figura 7Q) en una jaula oscura de Faraday en un bloque magnético (Figura 7I) y asegúrese de que la mosca esté a ~ 5 mm del final de la guía de luz (Figura 7L).
   11. Coloque el electrodo de grabación (Figura 7P) sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra (Figura 7N) sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores.
   12. Inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca utilizando los micromanipuladores.
   13. Inserte el electrodo de grabación en la periferia externa del ojo de la mosca, preferiblemente, utilizando los micromanipuladores.
       NOTA: Después de insertar el electrodo en el ojo, se observará un pequeño hoyuelo; tire del electrodo hacia arriba sin retirarlo del ojo hasta que el hoyuelo desaparezca. Los electrodos también se pueden sumergir en pequeñas gotas de gelatina de electrodo aplicadas en el torso y el ojo.
4. Protocolo de intensidad-respuesta
   1. Coloque un filtro naranja (filtro de borde 590) delante de la lámpara de xenón de alta presión. Utilice un filtro de densidad neutra atenuante (ND) grande (seis órdenes de magnitud).
   2. Espere 60 s en la oscuridad y dé un pulso de luz de 5 s.
   3. Reemplace el filtro ND por un filtro ND menos atenuante en incrementos de un orden de magnitud.
   4. Espere 60 s en la oscuridad y dé un segundo pulso de luz de 5 s.
   5. Repita los pasos 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente la intensidad de la luz utilizando filtros ND menos atenuantes (el último pulso debe generarse sin ningún filtro ND). Asegúrese de utilizar la serie de filtros ND en la dirección adecuada, comenzando por una gran atenuación y alcanzando una atenuación baja.
5. Protocolo PDA (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos)
   1. Dar un pulso de luz de 5 s de máxima intensidad usando un filtro naranja (filtro de borde 590, para convertir el fotopigmento máximo al estado R).
   2. Reemplace el filtro naranja por un filtro azul de banda ancha (BP450/40 nm) y dé tres pulsos de luz de 5 s a la máxima intensidad.
      NOTA: También es posible dar un pulso de luz azul de intensidad máxima continua y larga hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.
   3. Espere 60 s en la oscuridad, reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior y dé dos pulsos de luz de 5 s con intervalos de 60 s.
6. Protocolo ERP/M-potential para medir el espectro de fotoequilibrio de M (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos^10,25)
   1. Dé un pulso de luz azul continuo (paso de banda (BP) 450/40 nm) hasta alcanzar una respuesta de voltaje de estado estacionario, que convierte la cantidad máxima de fotopigmento del estado R al estado M de las celdas R1-6.
   2. Dé un breve destello de luz intensa (<3 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm (el espectro de absorción conocido del fotopigmento de las células R1-6) utilizando filtros de paso de banda estrechos (~ 20 nm) y mida la amplitud máxima de la fase M1 de la respuesta potencial M (que refleja la absorción de metarhodopsina en esta longitud de onda específica en el fotoequilibrio^10,25).
      NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para que el contenido de fotones se empaquete en una corta duración. El potencial M está compuesto por dos componentes: M1 (fase negativa corneal), que refleja el desplazamiento de carga de la metarhodopsina en el fotorreceptor, y M2 (fase^11,33 positiva corneal), que refleja la respuesta M1 amplificada de los fotorreceptores en la lámina ^9,10,11 . Cada uno de estos componentes puede ser identificado y medido. Sin embargo, es preferible medir el potencial M1 ya que es una manifestación lineal directa de los niveles M. Si se utiliza M2, asegúrese de que su amplitud esté en el rango lineal mediante el uso de privación leve de carotenoides^24,25.
   3. Vuelva a dar un pulso de luz azul continuo (BP450/40 nm), seguido de un breve destello de luz intensa (<1 ms) de una longitud de onda diferente.
   4. Repita este protocolo hasta que se cubra todo el espectro de absorción de M en el equilibrio fotográfico.

2. Protocolo ERC para medir el espectro de acción de los estados R y M de las celdas R1-6 utilizando registros de pinzas de voltaje de celda entera

NOTA: Para obtener un protocolo detallado para el uso de grabaciones de pinzas de voltaje de celda entera, véase Katz et ^al.34. El potencial M utiliza el ERG para medir la activación del estado M solo porque la contribución del estado R es suprimida por la capacitancia de la membrana. Por el contrario, el ERC mide la activación de los estados R (ERC positivo) y M (ERC negativo) porque los registros de pinza de voltaje eliminan el efecto de la capacitancia de la membrana (ver introducción).

1. Convierta el fotopigmento al estado deseado (R o M). Para la conversión de R a M, primero, adapte las moscas mediante un breve (<1 ms) flash azul adaptativo (BP450/40 nm). Para la conversión de M a R, proporcione un flash naranja adaptativo corto (filtro de borde OG590).
2. Dé un breve destello de luz (<1 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm y mida la amplitud máxima negativa o positiva de la respuesta ERC, que refleja la absorción M / R en esta longitud de onda específica.
   NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para empacar el contenido de fotones en una corta duración. La conversión máxima de fotopigmento de R a M por flash azul puede alcanzar ~ 80% del total de moléculas de fotopigmento debido a la superposición en el espectro de absorción de R y M (Figura 3A). Por lo tanto, en longitudes de onda inferiores a ~ 550 nm, el ERC tiene dos componentes: una fase negativa que refleja la respuesta de la metarhodopsina y una fase positiva que refleja la respuesta de la rodopsina restante. El ERC depende linealmente de la intensidad de la luz (Figura 5D). En consecuencia, para derivar la sensibilidad espectral de los estados R y M, cada fase del ERC necesita ser normalizada en las diversas longitudes de onda para una energía igual²⁹.
3. Repita los pasos 2.1.-2.2. utilizando destellos de diferentes longitudes de onda.
4. Trazar el ERC positivo y negativo normalizado en función de la longitud de onda.
   NOTA: El fuerte destello de luz induce una corriente masiva a través de los canales sensibles a la luz que conduce a un estrés metabólico en el fotorreceptor, que, a su vez, causa la apertura del canal independiente de la luz. El ERC se superpone a esta corriente constitutiva.

Resultados

La Figura 2 ejemplifica la robustez y facilidad de uso de la técnica ERG. Es robusto porque se registra en la mosca prácticamente intacta mediante una técnica simple de registros de voltaje extracelular que requieren una configuración electrofisiológica simple. La robustez se manifiesta mediante la obtención de registros de respuestas de luz con amplitudes relativamente grandes (en el rango de milivoltios) incluso cuando las mutaciones reducen o distorsionan fuertemente la respuesta de...

Discusión

La principal ventaja de usar la preparación de fotorreceptores Drosophila es su accesibilidad, la facilidad y precisión de la estimulación de la luz y, lo más importante, la capacidad de aplicar el poder de la genética molecular⁷. Extensos estudios genéticos han establecido Drosophila como un sistema modelo extremadamente útil para la disección genética de procesos biológicos complejos⁷. La estructura relativamente simple del genoma de Drosop...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X