从小鼠鼻粘膜中分离第2组先天淋巴细胞以检测CD226的表达

摘要

与 2 型炎症有关的第 2 组先天淋巴细胞 （ILC2） 主要参与对蠕虫感染、过敏性疾病、代谢稳态和组织修复的反应。在这项研究中，展示了从鼠鼻粘膜中分离ILC2s并检测CD226表达的程序。

摘要

随着多年来发表的对2组先天淋巴细胞（ILC2s）的大量研究，ILC2s被广泛认为与调节各种病理过程有关，包括抗蠕虫免疫，组织修复，产热和自身免疫性疾病，如哮喘和过敏性鼻炎（AR）。ILC2 永久存在于皮肤、肠道、肺和鼻腔等外周组织中;然而，关于它们在鼻粘膜免疫中的确切功能的信息有限。CD226是一种活化共刺激分子，主要在自然杀伤（NK）细胞、T细胞和炎性单核细胞上表达。然而，ILC2是否表达CD226或在ILC2s相关疾病的发病机制中发挥作用仍然未知。在这里，我们建立了一种从鼻粘膜中分离和鉴定ILC2的方法，并在从健康和AR小鼠获得的ILC2上检测CD226表达。在本文中，我们描述了该协议用于从小鼠鼻粘膜中分离和鉴定ILC2s，这将有助于探索鼻粘膜疾病中免疫疾病的内部病理机制。

引言

第2组先天淋巴细胞（ILC2s）首先在小鼠的腹膜腔组织中发现，随后被证明存在于血液和其他外周组织（如肺，皮肤和鼻腔1，^2，3）中。作为组织驻留细胞，ILC2 主要在局部维持和增殖，并通过产生大量 2 型细胞因子和诱导 2 型免疫作为对外源性有害刺激做出反应的第一保护⁴，^5，6。ILC2还可以通过向感染组织贩运7^，8来发挥其作用。

与辅助性T细胞2（Th2）类似，ILC2的复杂调控网络确保它们显着参与各种2型炎症性疾病的进展，包括气道过敏性疾病^8，9。在哮喘中，上皮细胞来源的警报蛋白可以激活ILC2，ILC2s通过分泌白细胞介素（IL）-4，IL-5和IL-13¹⁰进一步促进肺部炎症。临床研究还表明，重度哮喘患者的痰液和血液中ILC2水平显着升高，表明ILC2与哮喘严重程度及其作为哮喘进展预测因子的功能有关¹¹。

过敏性鼻炎（AR）是一种常见的慢性炎症性疾病，每年影响数百万人，这种疾病的有效治疗方法有限^12，13。ILC2 在 AR 的病理生理学中起着至关重要的作用，无论是在致敏阶段还是在症状产生和炎症阶段¹⁴。据报道，在AR患者中，外周血中的ILC2水平在局部和全身均升高¹⁵。然而，ILC2s对AR病理生理学和进展的某些影响及其机制仍有待进一步探索。

CD226 - 一种用作共刺激分子的跨膜糖蛋白 - 主要在自然杀伤（NK）细胞，T细胞和其他炎性单核细胞上表达^16，17。CD226与其配体（CD155和/或CD112）或竞争对手（TIGIT）的相互作用使其能够参与各种免疫细胞的生物学功能¹⁸。抗原呈递细胞上的配体与细胞毒性淋巴细胞（CTL）上的CD226的结合同时促进两个细胞的活化，而CTL的活化可以被CD226^19，20的竞争对手TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）进一步抑制。一项人类 离体 研究表明，T细胞上的CD226和CD155通过差异调节Th亚群^{21来调节Th1} / Th17和Th2之间的平衡。CD226同样可以介导血小板粘附和NK肿瘤杀伤活性^22，23。同时，CD226在各种传染病，自身免疫性疾病和肿瘤的发病机制中得到了很好的研究^18，24，25。目前，CD226已成为免疫治疗的新亮点。研究发现，细胞外囊泡可以逆转NK细胞上的CD226表达，以恢复其细胞毒性活性并干预肺癌的进展²⁶。最近的一项研究揭示了胎儿肠道3组ILC的亚簇，其特征是通过单细胞RNA测序²⁷具有高CD226表达的，这表明CD226可能在先天淋巴细胞介导的免疫中发挥作用。

我们对气道炎症中ILC2的了解主要基于对哮喘的研究;然而，人们对它们在鼻粘膜免疫中的功能知之甚少。因此，建立了一个从鼻粘膜中分离和鉴定ILC2的方案。该研究的重点是CD226在鼻组织中ILC2s上的表达及其在健康小鼠和AR小鼠之间的变异。这可能为ILC2介导的局部免疫调节的潜在机制提供新的见解，并作为开发AR治疗新方法的基础。

研究方案

所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。所有程序和协议均由第四军医大学科学研究伦理委员会（第20211008号）批准。

1. 鼠AR模型建立

1. 在特定无病原体条件下饲养8-12周龄的雄性和雌性野生型（WT）C57BL / 6小鼠，并提供标准的实验室食物和水。
2. 在干净的工作台上将 50 μg 卵清蛋白 （OVA） 乳化在含有 2 mg 氢氧化铝的 0.2 mL 无菌 PBS 中以保持无菌。在第0，7和14天，腹膜内注射雌性或雄性小鼠，每只50μg乳化OVA。
3. 在第21，22，23，24和25天，鼻内向小鼠灌注50μgOVA溶解在30μL无菌PBS（每个鼻孔15μL）下吸入麻醉（2-3%异氟醚，氧流速或0.5L / min）。
4. 最后一次挑战后24小时（第26天）对小鼠实施安乐死。

2. 从鼻粘膜中分离单核细胞 （MNC）

1. 在深度麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。将小鼠头浸泡在75%乙醇中5分钟，避免乙醇进入外鼻孔。将腹部向下放在手术台上。
2. 切掉前牙。在头部的中线，做一个切口，然后用剪刀切开皮肤。
3. 移除下颌，沿着上颚末端切掉整个鼻子，然后将组织放入含有 60 mL 冰冷 PBS 的培养皿中。使用剪刀和镊子去除粘附在骨头上的肉和肌肉。
4. 将小鼠鼻子转移到含有 5 mL 冰冷 PBS 的新 60 mm 培养皿中。用 5 mL 冰冷的 PBS 清洗骨头两次。
5. 将鼻端转移到 1.5 mL 微量离心管中。
6. 充分粉碎并将鼻子转移到含有 2 mL 预热消化缓冲液（补充有 1 mg/mL 胶原酶 IV 和 10 U/mL DNase I 的 RPMI 1640 培养基）的 15 mL 管中。
7. 盖上盖子并将管垂直置于37°C的轨道振荡器中，以120-150rpm连续搅拌40分钟。
   注意:将消化缓冲液预热至37°C，以获得最高的酶活性。
8. 加入 5 mL 含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的冰冷 RPMI 1640 培养基以停止消化过程。
9. 通过70μm细胞过滤器过滤以去除固体碎片。
10. 以500× g 离心5分钟，然后轻轻弃去上清液。
11. 将沉淀重悬于冰冷的RPMI 1640培养基中，并以500× g 离心5分钟。轻轻丢弃上清液。
12. 将细胞沉淀重悬于 4 mL 40% 密度梯度培养基（160 μL 10x PBS + 1.44 mL 密度梯度培养基储备溶液 + 2.4 mL RPMI 1640 培养基）中。
13. 将巴斯德移液器轻轻插入试管底部，缓慢加入 2.5 mL 80% 密度梯度培养基（200 μL 10x PBS + 1.8 mL 密度梯度培养基储备溶液 + 0.5 mL RPMI 1640 培养基）。
14. 将离心机的加速和减速速率设置为低于三档，并在室温（RT）下将离心机以400× g 离心15分钟。
15. 在排出界面处的细胞之前，请去除顶层杂质，以避免潜在的污染。使用移液器小心地将 40%/80% 密度梯度培养基界面处的单核细胞 （MNC） 层排入含有 2 mL 冰冷 PBS 的 15 mL 管中。用冰冷的PBS清洗细胞两次。

3. 用于FCM分析的表面染色

1. 收获细胞并在4°C下以500× g 离心5分钟。 将细胞沉淀重悬于染色缓冲液（补充有2%FBS和0.1%NaN₃的PBS）中，并在4°C下以500× g 离心5分钟。 弃去上清液。
   注意:制备染色缓冲液时要小心。NaN3 毒性很大，如果吞咽、吸入或与皮肤接触，可能会对器官造成损害。此外，避免释放到环境中。
2. 将细胞重悬于每管 80 μL 封闭溶液（在染色缓冲液中稀释的抗 CD16/32 抗体 （1:100） ）中。在4°C的黑暗中孵育30分钟。
3. 在不洗涤的情况下，加入20 μL适当稀释的表面染色抗体混合物（表1）。
4. 在将抗体混合物添加到样品之前，加入 1 μL（每次测试）可固定活性染料 520 （FVD）。在4°C的黑暗中孵育30分钟。设置匹配的同种型抗体和荧光减一（FMO）作为阴性对照。
5. 通过在4°C下以500× g 离心5分钟，在500μL染色缓冲液中洗涤细胞。
6. 将细胞沉淀重悬于 200 μL 染色缓冲液中。向染色细胞中加入 50 μL 涡旋绝对计数珠并搅拌。对它们进行流式细胞术（FCM）分析。
   注意:使用光谱细胞分析仪获得FCM数据，并使用流式细胞术（FCM）分析软件进行分析。

结果

开发OVA诱导的小鼠模型以探索ILC2在AR中的作用。AR小鼠模型的构建基于先前的研究，略有修改²⁸，²⁹，^30，31。拍摄了一段 10 分钟的视频，以测量上次鼻腔挑战后打喷嚏和抓鼻的频率。OVA诱导的AR小鼠的过敏症状如图1所示。AR小鼠揉鼻和打喷嚏的频率明显高于对照组。

讨论

ILC2与2型炎症和炎症性疾病密切相关，越来越多的研究表明。小鼠模型和人类观察都有助于更好地了解其在上气道中的功能。在哮喘病理生理学中，ILC2 通过胸腺基质淋巴生成素、IL-25 和 IL-33 激活，这些药物主要由上皮细胞产生。然后镜像Th2细胞，ILC2产生IL-4，IL-5和IL-13以加重2型炎症³²。此外，ILC2的不同亚群也产生IL-10和IL-17³³，^34?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum hydroxide	Meilun biological Technology	21645-51-2
CD11b	eBioscience	11-0112-82	Used in antibody coctail
CD11c	BioLegend	117306	Used in antibody coctail
CD16/32	BioLegend	101302	Clone: 93; Dilution 1:100
CD226	BioLegend	128812	Used in antibody coctail
CD3e	BioLegend	100306	Used in antibody coctail
CD45	BioLegend	103128	Used in antibody coctail
CD45R	eBioscience	11-0452-82	Used in antibody coctail
CD90.2	BD Pharmingen	553014	Used in antibody coctail
Collagenase IV	DIYIBio	DY40128
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950	absolute counting beads
Dnase	Beyotime	D7076
Fetal Bovine Serum	gibco	10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)	eBioscience	65-0867-14	FVD
HBSS, calcium, magnesium	Servicebio	G4204-500
KLRG1	eBioscience	17-5893-81	Used in antibody coctail
NaN3	SIGMA	S2002
NovoExpress software	AgilentTechnologies	Version 1.5.0	flow cytometry (FCM) analysis software
OVA	SIGMA	9006-59-1
PBS, 1x	Servicebio	G4202-500
PBS, 10x	Servicebio	G4207-500
Percoll	Yeasen	40501ES60	density gradient media
RPMI 1640 culture media	Corning	10-040-CVRV
Spectral cell analyzer	SONY	SA3800