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요약

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

초록

수년에 걸쳐 발표된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2)에 대한 풍부한 연구를 통해 ILC2는 항기생충 면역, 조직 복구, 열 발생 및 천식 및 알레르기 비염(AR)과 같은 자가면역 질환을 포함한 다양한 병리학적 과정을 조절하는 데 연루된 것으로 널리 알려져 있습니다. ILC2는 피부, 장, 폐 및 비강과 같은 말초 조직에 영구적으로 존재합니다. 그러나 비강 점막 면역의 정확한 기능에 대한 정보는 제한적입니다. CD226은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 염증성 단핵구에서 발현되는 활성화 공동자극 분자입니다. 그러나 ILC2가 CD226을 발현하는지 또는 ILC2s 관련 질병의 발병기전에서 역할을 하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 비강 점막에서 ILC2를 분리 및 식별하는 방법을 확립하고 건강한 AR 마우스에서 얻은 ILC2에서 CD226 발현을 검출했습니다. 여기에서 우리는 비강 점막 질환에서 면역 장애의 내부 병리학적 메커니즘을 탐색하는 데 도움이 될 마우스 비강 점막에서 ILC2s의 분리 및 식별을 위한 이 프로토콜을 설명합니다.

서문

그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 생쥐의 복강 조직에서 처음 발견되었고, 이후 혈액 및 폐, 피부 및 비강과 같은 다른 말초 조직에 존재하는 것으로 입증되었다 1,2,3. 조직 상주 세포로서 ILC2는 주로 국소적으로 유지 및 증식되며 수많은 제2형 사이토카인을 생성하고 제2형 면역을 유도하여 외인성 유해 자극에 반응하는 첫 번째 가드 역할을 합니다 4,5,6. ILC2는 또한 감염된 조직으로 인신매매를 함으로써 그 효과를 발휘할 수 있다 7,8.

T-헬퍼 2(Th2) 세포와 유사하게, ILC2의 복잡한 조절 네트워크는 기도 알레르기 질환을 포함한 다양한 제2형 염증성 질환의 진행에 중요한 관여를 보장합니다 8,9. 천식에서 상피세포 유래 알람민은 인터루킨(IL)-4, IL-5, IL-13의 분비를 통해 폐 염증을 촉진하는 ILC2를 활성화시킬 수 있다10. 임상 연구에서도 중증 천식 환자의 객담과 혈액에서 ILC2 수치가 유의하게 상승한 것으로 나타났으며, 이는 ILC2가 천식 중증도와 천식 진행의 예측 인자로서의 기능과 관련이 있음을 시사한다11.

알레르기성 비염(AR)은 매년 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 만성 염증성 질환이며, 이 질환에 대한 효과적인 치료법은 제한적이다12,13. ILC2는 감작 단계 또는 증상 생성 및 염증 단계14에서 AR의 병태생리학에서 중요한 역할을 합니다. AR 환자의 경우, 말초 혈액 내 ILC2 수치가 국소 및 전신적으로 상승하는 것으로 보고되었다15. 그러나 AR의 병태생리학 및 진행에 대한 ILC2의 특정 효과와 기본 메커니즘은 여전히 추가 탐색이 필요합니다.

CD226 - 공동자극 분자 역할을 하는 막횡단 당단백질 - 은 주로 자연 살해(NK) 세포, T 세포 및 기타 염증성 단핵구에서 발현됩니다16,17. CD226과 그의 리간드 (CD155 및/또는 CD112) 또는 경쟁자 (TIGIT)의 상호작용은 다양한 면역 세포의 생물학적 기능에 참여할 수 있게 한다18. 세포독성 림프구 (CTL) 상의 CD226에 대한 항원-제시 세포 상의 리간드의 결합은 두 세포의 동시 활성화를 촉진하는 반면, CTL의 활성화는 CD226의 경쟁자인 TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체)에 의해 추가로 억제될 수 있다19,20. 인간 생체 외 연구에 따르면 T 세포의 CD226 및 CD155는 차등 조절 Th 하위 집합21을 통해 Th1/Th17과 Th2 사이의 균형을 조절합니다. CD226은 마찬가지로 혈소판 부착 및 NK 종양 사멸 활성을 매개할 수 있다22,23. 한편, CD226은 다양한 감염성 질환, 자가면역질환 및 종양의 발병기전에서 잘 연구되어 있다 18,24,25. 현재 CD226은 면역 요법의 새로운 밝은 지점이되었습니다. 연구에 따르면 세포외 소포체는 NK 세포에서 CD226 발현을 역전시켜 세포독성 활성을 회복하고 폐암의 진행에 개입할 수 있다26. 최근 연구에서는 단일 세포 RNA 시퀀싱27에 의해 높은 CD226 발현을 특징으로 하는 태아 장 그룹 3 ILC의 하위 클러스터가 밝혀졌으며, 이는 CD226이 선천성 림프 세포 매개 면역에서 역할을 발휘할 수 있음을 나타냅니다.

기도 염증에서 ILC2에 대한 우리의 지식은 주로 천식에 대한 연구를 기반으로 합니다. 그러나 비강 점막 면역에서의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 비강 점막에서 ILC2를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜이 수립되었습니다. 이 연구는 비강 조직의 ILC2에 대한 CD226의 발현과 건강한 마우스와 AR 마우스 간의 변이에 초점을 맞춥니다. 이것은 국소 면역에서 ILC2 매개 조절의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 AR 치료를 위한 새로운 접근 방식을 개발하기 위한 기초가 될 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험은 실험동물의 관리 및 사용 가이드라인에 따라 수행하였다. 모든 절차와 프로토콜은 제 4 군 의과 대학 과학 연구 윤리위원회 (No. 20211008)의 승인을 받았습니다.

1. Murine AR 모델 구축

  1. 특정 병원체가 없는 조건에서 8-12주령의 수컷 및 암컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스를 기숙하고 표준 실험실 차우와 물을 제공합니다.
  2. 무균 상태를 유지하기 위해 깨끗한 벤치에서 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2mL의 멸균 PBS에 50μg의 오브알부민(OVA)을 유화합니다. 0일, 7일 및 14일에 암컷 또는 수컷 마우스에 각각 50μg의 유화된 OVA를 복강 주사합니다.
  3. 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 흡입 마취(산소 유량 또는 0.5L/min).
  4. 마지막 챌린지 후 24시간(26일째)에 마우스를 안락사시킵니다.

2. 코 점막에서 단핵 세포 (MNC)의 분리

  1. 깊은 마취 하에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다. 생쥐 머리를 75 % 에탄올에 5 분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧 구멍으로 들어 가지 않도록하십시오. 복부를 수술대에 아래쪽으로 놓습니다.
  2. 앞니를 잘라내십시오. 머리의 정중선을 절개하고 가위로 피부를 자릅니다.
  3. 아래턱을 제거하고 입천장 끝을 따라 코 전체를 잘라낸 다음 조직을 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 넣습니다. 가위와 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 살과 근육을 제거하십시오.
  4. 마우스 코를 얼음처럼 차가운 PBS 5mL가 들어 있는 새로운 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS 5mL로 뼈를 두 번 씻으십시오.
  5. 코를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  6. 코를 충분히 부수고 2mL의 예열 소화 완충액(1mg/mL의 콜라게나제 IV 및 10U/mL DNase I이 보충된 RPMI 1640 배지)이 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다.
  7. 뚜껑을 덮고 튜브를 37°C의 오비탈 셰이커에 수직으로 놓고 120-150rpm에서 40분 동안 계속 교반합니다.
    참고: 소화 완충액을 37°C로 예열하여 최고의 효소 활성을 달성하십시오.
  8. 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지 5mL를 추가하여 소화 과정을 중지합니다.
  9. 70μm 셀 스트레이너를 통해 여과하여 고체 조각을 제거합니다.
  10. 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 부드럽게 버립니다.
  11. 펠릿을 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지에 다시 현탁하고 500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부드럽게 버립니다.
  12. 40% 밀도 구배 배지 4mL(10x PBS 160μL + 밀도 구배 배지 원액 1.44mL + RPMI 1640 배지 2.4mL)에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
  13. 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 부드럽게 삽입하고 80% 밀도 구배 배지 2.5mL(10x PBS 200μL + 밀도 구배 배지 원액 1.8mL + RPMI 1640 배지 0.5mL)를 천천히 추가합니다.
  14. 원심분리기의 가속 및 감속 속도를 3단 기어보다 낮게 설정하고 원심분리기를 400 x g 로 상온(RT)에서 15분 동안 조절한다.
  15. 잠재적인 오염을 방지하기 위해 계면에서 세포를 배출하기 전에 불순물의 최상층을 제거하십시오. 피펫을 사용하여 40%/80% 밀도 구배 배지 계면의 단핵 세포(MNC) 층을 2mL의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 15mL 튜브로 조심스럽게 배출합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

3. FCM 분석을 위한 표면 염색

  1. 세포를 수확하고, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 세포 펠렛을 염색 완충액(2% FBS 및 0.1%NaN3로 보충된 PBS)에 재현탁하고, 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하였다. 상청액을 버리십시오.
    주의 : 염색 완충액을 준비할 때 주의하십시오. NaN3는 매우 독성이 강하며 삼키거나 흡입하거나 피부에 접촉하면 장기에 손상을 줄 수 있습니다. 또한 환경으로의 방출을 피하십시오.
  2. 튜브당 80μL 블로킹 용액(염색 완충액에 희석된 항-CD16/32 항체(1:100))에 세포를 재현탁합니다. 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 세척하지 않고 표면 염색 항체 칵테일의 적절한 희석액 20μL를 추가합니다(표 1).
  4. 항체 칵테일을 샘플에 추가하기 직전에 고정 가능한 생존도 염료 520(FVD) 1μL(테스트당)을 추가합니다. 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 일치하는 이소타입 항체와 형광 마이너스 1(FMO)을 음성 대조군으로 설정합니다.
  5. 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 500 μL의 염색 완충액으로 세포를 세척한다.
  6. 세포 펠릿을 200μL의 염색 완충액에 재현탁합니다. 50 μL의 vortexed absolute counting beads를 염색된 세포에 넣고 교반합니다. 유세포 분석(FCM) 분석을 실시합니다.
    참고: FCM 데이터는 스펙트럼 세포 분석기를 사용하여 얻었고 유세포 분석(FCM) 분석 소프트웨어로 분석했습니다.

결과

AR에서 ILC2의 역할을 탐색하기 위해 OVA 유도 쥐 모델이 개발되었습니다. AR 쥐 모델의 구성은 약간의 수정 28,29,30,31을 가진 이전 연구를 기반으로 했습니다. 마지막 콧물 챌린지 후 재채기와 코 긁힘의 빈도를 측정하기 위해 10분 분량의 비디오를 캡처했습니다. OVA가 유도된 AR 마우스의 알러지 증상을

토론

ILC2는 제2형 염증 및 염증성 질환과 밀접한 관련이 있으며, 이는 점점 더 많은 연구에서 입증되고 있습니다. 마우스 모델과 인간 관찰 모두 상기도에서의 기능을 더 잘 이해하는 데 기여합니다. 천식 병태생리학에서 ILC2는 주로 상피 세포에서 생성되는 흉선 기질 림프포이에틴, IL-25 및 IL-33을 통해 활성화됩니다. 그런 다음 Th2 세포를 미러링하여 ILC2는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생성하여 유형 2 염증을 악화...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

R.Z.는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81871258)과 제 4 군 의과 대학 (No.2020rcfczr)이 제공 한 기금의 지원을 받았습니다. Y.Z.는 산시성 자연과학 기초 연구 프로그램(No. 2021JM-081)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum hydroxideMeilun biological Technology21645-51-2
CD11beBioscience11-0112-82Used in antibody coctail
CD11cBioLegend117306Used in antibody coctail
CD16/32BioLegend101302Clone: 93; Dilution 1:100
CD226BioLegend128812Used in antibody coctail
CD3eBioLegend100306Used in antibody coctail
CD45BioLegend103128Used in antibody coctail
CD45ReBioscience11-0452-82Used in antibody coctail
CD90.2BD Pharmingen553014Used in antibody coctail
Collagenase IVDIYIBioDY40128
CountBright absolute counting beadsInvitrogenC36950absolute counting beads
Dnase figure-materials-1052BeyotimeD7076
Fetal Bovine Serumgibco10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)eBioscience65-0867-14FVD
HBSS, calcium, magnesiumServicebioG4204-500
KLRG1eBioscience17-5893-81Used in antibody coctail
NaN3SIGMAS2002
NovoExpress softwareAgilentTechnologiesVersion 1.5.0flow cytometry (FCM) analysis software
OVASIGMA9006-59-1
PBS, 1xServicebioG4202-500
PBS, 10xServicebioG4207-500
PercollYeasen40501ES60density gradient media
RPMI 1640 culture mediaCorning10-040-CVRV
Spectral cell analyzerSONYSA3800

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