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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2), implicate nell'infiammazione di tipo 2, partecipano principalmente alla risposta all'infezione da elminti, alle malattie allergiche, all'omeostasi metabolica e alla riparazione dei tessuti. In questo studio, viene dimostrata una procedura per isolare le ILC2 dalla mucosa nasale murina e rilevare l'espressione di CD226.

Abstract

Con abbondanti ricerche sulle cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) pubblicate nel corso degli anni, le ILC2 sono ampiamente note per essere implicate nella regolazione di vari processi patologici, tra cui l'immunità anti-elminti, la riparazione dei tessuti, la termogenesi e le malattie autoimmuni come l'asma e la rinite allergica (AR). Le ILC2 risiedono permanentemente nei tessuti periferici come la pelle, l'intestino, i polmoni e la cavità nasale; Tuttavia, ci sono informazioni limitate sulle loro esatte funzioni nell'immunità della mucosa nasale. CD226 è una molecola costimolatoria attivante, espressa principalmente su cellule natural killer (NK), cellule T e monociti infiammatori. Tuttavia, se le ILC2 esprimono CD226 o svolgono un ruolo nella patogenesi delle malattie correlate alle ILC2 rimane sconosciuto. Qui, abbiamo stabilito un metodo per isolare e identificare ILC2 dalla mucosa nasale e rilevato l'espressione di CD226 su ILC2 ottenute da topi sani e AR. Qui, descriviamo questo protocollo per l'isolamento e l'identificazione di ILC2 dalla mucosa nasale del topo, che aiuterà a esplorare il meccanismo patologico interno dei disturbi immunologici nelle malattie della mucosa nasale.

Introduzione

Le cellule linfoidi innate del gruppo 2 (ILC2) sono state scoperte per la prima volta nei tessuti della cavità peritoneale dei topi e successivamente hanno dimostrato di essere presenti nel sangue e in altri tessuti periferici come polmoni, pelle e cavità nasale 1,2,3. Come cellule residenti nei tessuti, le ILC2 sono principalmente mantenute e proliferate localmente e funzionano come le prime guardie che rispondono agli stimoli dannosi esogeni producendo numerose citochine di tipo 2 e inducendo l'immunità di tipo 2 4,5,6. Le ILC2 possono anche esercitare i loro effetti attraverso il traffico verso i tessuti infetti 7,8.

Analogamente alle cellule T-helper 2 (Th2), le complicate reti regolatorie delle ILC2 assicurano il loro coinvolgimento significativo nella progressione di varie malattie infiammatorie di tipo 2, comprese le malattie allergiche delle vie aeree 8,9. Nell'asma, le allarmine derivate dalle cellule epiteliali possono attivare ILC2, che promuovono ulteriormente l'infiammazione polmonare attraverso la secrezione di interleuchina (IL)-4, IL-5 e IL-1310. Studi clinici hanno anche indicato che i livelli di ILC2 erano significativamente elevati nell'espettorato e nel sangue dei pazienti con asma grave, suggerendo un'associazione di ILC2 con la gravità dell'asma e la loro funzione come predittore della progressione dell'asma11.

La rinite allergica (AR) è una malattia infiammatoria cronica comune che colpisce milioni di persone ogni anno e i trattamenti efficaci per questa malattia sono limitati12,13. Le ILC2 svolgono un ruolo cruciale nella fisiopatologia dell'AR, sia nella fase di sensibilizzazione che nella generazione di sintomi e nella fase14 dell'infiammazione. Nei pazienti con AR, i livelli di ILC2 nel sangue periferico sono stati segnalati per essere elevati sia localmente che sistemicamente15. Tuttavia, alcuni effetti e i meccanismi alla base delle ILC2 sulla fisiopatologia e sulla progressione dell'AR richiedono ancora ulteriori esplorazioni.

CD226 - una glicoproteina transmembrana che funge da molecola costimolatoria - è espressa principalmente su cellule natural killer (NK), cellule T e altri monociti infiammatori16,17. L'interazione di CD226 e dei suoi ligandi (CD155 e/o CD112) o concorrente (TIGIT) gli consente di partecipare alle funzioni biologiche di varie cellule immunitarie18. Il legame dei ligandi sulle cellule presentanti l'antigene a CD226 sui linfociti citotossici (CTL) promuove l'attivazione di entrambe le cellule contemporaneamente, mentre l'attivazione della CTL può essere ulteriormente soppressa da TIGIT (immunorecettore delle cellule T con domini Ig e ITIM), il concorrente di CD22619,20. Uno studio umano ex vivo ha rivelato che CD226 e CD155 sulle cellule T regolano l'equilibrio tra Th1 / Th17 e Th2 attraverso la modulazione differenziale dei sottoinsiemi Th21. CD226 può anche mediare l'adesione piastrinica e l'attività di uccisione del tumore NK22,23. Nel frattempo, CD226 è ben studiato nella patogenesi di varie malattie infettive, malattie autoimmuni e tumori 18,24,25. Allo stato attuale, CD226 è diventato un nuovo punto luminoso per l'immunoterapia. Gli studi hanno scoperto che le vescicole extracellulari possono invertire l'espressione di CD226 sulle cellule NK per ripristinare la loro attività citotossica e intervenire nella progressione del cancro del polmone26. Uno studio recente ha rivelato un sottogruppo di ILC intestinali fetali di gruppo 3 caratterizzati da un'elevata espressione di CD226 mediante sequenziamento dell'RNA a singola cellula27, che ha indicato che CD226 potrebbe esercitare ruoli nell'immunità innata linfoide-mediata dalle cellule.

La nostra conoscenza delle ILC2 nell'infiammazione delle vie aeree si basa principalmente su studi sull'asma; Tuttavia, si sa poco sulle loro funzioni nell'immunità della mucosa nasale. Pertanto, è stato stabilito un protocollo per isolare e identificare le ILC2 dalla mucosa nasale. Lo studio si concentra sull'espressione di CD226 sulle ILC2 nei tessuti nasali e sulla sua variazione tra topi sani e AR. Ciò può fornire nuove informazioni sui meccanismi alla base della regolazione mediata da ILC2 nell'immunità locale e servire come base per lo sviluppo di nuovi approcci per il trattamento dell'AR.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure e i protocolli sono stati approvati dal Comitato Etico per la Ricerca Scientifica della Quarta Università Medica Militare (n. 20211008).

1. Creazione di modelli AR murini

  1. Ospitare topi selvatici maschi e femmine (WT) C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane in specifiche condizioni prive di agenti patogeni e fornire chow e acqua standard di laboratorio.
  2. Emulsionare 50 μg di ovoalbumina (OVA) in 0,2 mL di PBS sterile contenente 2 mg di idrossido di alluminio su un banco pulito per mantenere la sterilità. Nei giorni 0, 7 e 14, iniettare per via intraperitoneale topi femmina o maschio con 50 μg ciascuno di OAV emulsionati.
  3. Nei giorni 21, 22, 23, 24 e 25, i topi instillati per via intranasale con 50 μg di OAV disciolti in 30 μL di PBS sterile (15 μL per narice) in anestesia per inalazione (isoflurano al 2-3% con una portata di ossigeno o 0,5 L / min).
  4. Eutanasia dei topi 24 ore dopo l'ultima sfida (giorno 26).

2. Isolamento delle cellule mononucleate (MNC) dalla mucosa nasale

  1. Eutanasia dei topi per lussazione cervicale in anestesia profonda. Immergere i topi a testa in su in etanolo al 75% per 5 minuti ed evitare che l'etanolo entri nella narice esterna. Posizionare l'addome verso il basso sul tavolo operatorio.
  2. Taglia i denti anteriori. Sulla linea mediana della testa, fai un'incisione e apri la pelle usando le forbici.
  3. Rimuovere la mascella inferiore, tagliare l'intero naso lungo la fine del palato e posizionare il tessuto in una capsula di Petri da 60 mm contenente 5 ml di PBS ghiacciato. Usando forbici e pinze, rimuovere la carne e i muscoli che aderiscono alle ossa.
  4. Trasferire il naso del topo in una nuova capsula di Petri da 60 mm contenente 5 ml di PBS ghiacciato. Lavare le ossa due volte con 5 ml di PBS ghiacciato.
  5. Trasferire il naso in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
  6. Rompere e trasferire sufficientemente il naso in una provetta da 15 mL contenente 2 mL di tampone digest preriscaldato (RPMI 1640 medium integrato con 1 mg/mL di collagenasi IV e 10 U/mL DNasi I).
  7. Fissare il coperchio e posizionare il tubo verticalmente in uno shaker orbitale a 37 °C, con agitazione continua a 120-150 giri/min per 40 minuti.
    NOTA: Preriscaldare il tampone digestivo a 37 °C per ottenere la massima attività enzimatica.
  8. Aggiungere 5 ml di terreno RPMI 1640 ghiacciato contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) per interrompere il processo di digestione.
  9. Filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere i frammenti solidi.
  10. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti, quindi eliminare delicatamente il surnatante.
  11. Risospendere il pellet in RPMI 1640 a freddo ghiacciato e centrifugare a 500 x g per 5 minuti. Scartare delicatamente il surnatante.
  12. Risospendere il pellet cellulare in 4 mL di fluido gradiente al 40% (160 μL di 10x PBS + 1,44 mL di soluzione madre di fluido a gradiente di densità + 2,4 mL di mezzo RPMI 1640).
  13. Inserire delicatamente una pipetta Pasteur sul fondo del tubo e aggiungere lentamente 2,5 ml di fluido con gradiente all'80% (200 μL di 10x PBS + 1,8 mL di soluzione madre di fluido con gradiente di densità + 0,5 mL di fluido RPMI 1640).
  14. Impostare la velocità di accelerazione e decelerazione della centrifuga più bassa rispetto alla terza marcia e centrifugare a 400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
  15. Rimuovere lo strato superiore di impurità prima di drenare le celle all'interfaccia per evitare potenziali contaminazioni. Drenare accuratamente lo strato di celle mononucleate (MNC) all'interfaccia del fluido con gradiente di densità del 40%/80% in un tubo da 15 mL contenente 2 mL di PBS ghiacciato utilizzando una pipetta. Lavare le cellule con PBS ghiacciato due volte.

3. Colorazione superficiale per l'analisi FCM

  1. Raccogliere le cellule e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in tampone colorante (PBS integrato con 2% FBS e 0,1% NaN3) e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si prepara il tampone anti-colorazione. NaN3 è molto tossico e può causare danni agli organi se ingerito, inalato o a contatto con la pelle. Inoltre, evitare il rilascio nell'ambiente.
  2. Risospendere le cellule in una soluzione bloccante da 80 μL (anticorpo anti-CD16/32 (1:100) diluito in tampone colorante) per provetta. Incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.
  3. Senza lavare, aggiungere 20 μL della diluizione appropriata del cocktail di anticorpi che colora la superficie (Tabella 1).
  4. Aggiungere 1 μL (per test) di colorante vitalità fissabile 520 (FVD) appena prima di aggiungere il cocktail di anticorpi ai campioni. Incubare al buio a 4 °C per 30 min. Impostare gli anticorpi isotipo corrispondenti e la fluorescenza meno uno (FMO) come controlli negativi.
  5. Lavare le celle in 500 μL di tampone colorante centrifugando a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone colorante. Aggiungere 50 μL di perline di conteggio assoluto a vortice alle cellule colorate e agitare. Sottoporli a un'analisi di citometria a flusso (FCM).
    NOTA: I dati FCM sono stati ottenuti utilizzando un analizzatore di cellule spettrali e analizzati con il software di analisi della citometria a flusso (FCM).

Risultati

È stato sviluppato un modello murino indotto da OAV per esplorare il ruolo delle ILC2 nell'AR. La costruzione del modello murino AR si è basata su studi precedenti con lievi modifiche 28,29,30,31. È stato catturato un video di 10 minuti per misurare la frequenza degli starnuti e dei graffi nasali dopo l'ultima sfida nasale. I sintomi allergici dei topi AR indotti da OAV sono stati presentati...

Discussione

Le ILC2 sono strettamente associate all'infiammazione di tipo 2 e ai disturbi infiammatori, come dimostrato da un numero crescente di studi. Sia i modelli murini che l'osservazione umana contribuiscono a una migliore comprensione della sua funzione nelle vie aeree superiori. Nella fisiopatologia asmatica, le ILC2 sono attivate attraverso la linfopoietina stromale timica, IL-25 e IL-33, che sono per lo più prodotte dalle cellule epiteliali. Quindi, rispecchiando le cellule Th2, le ILC2 producono IL-4, IL-5 e IL-13 per ag...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

R.Z. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81871258) e dai fondi forniti dalla Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). Y.Z. è stato supportato dal Programma di ricerca di base di scienze naturali dello Shaanxi (n. 2021JM-081).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum hydroxideMeilun biological Technology21645-51-2
CD11beBioscience11-0112-82Used in antibody coctail
CD11cBioLegend117306Used in antibody coctail
CD16/32BioLegend101302Clone: 93; Dilution 1:100
CD226BioLegend128812Used in antibody coctail
CD3eBioLegend100306Used in antibody coctail
CD45BioLegend103128Used in antibody coctail
CD45ReBioscience11-0452-82Used in antibody coctail
CD90.2BD Pharmingen553014Used in antibody coctail
Collagenase IVDIYIBioDY40128
CountBright absolute counting beadsInvitrogenC36950absolute counting beads
Dnase figure-materials-1052BeyotimeD7076
Fetal Bovine Serumgibco10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC)eBioscience65-0867-14FVD
HBSS, calcium, magnesiumServicebioG4204-500
KLRG1eBioscience17-5893-81Used in antibody coctail
NaN3SIGMAS2002
NovoExpress softwareAgilentTechnologiesVersion 1.5.0flow cytometry (FCM) analysis software
OVASIGMA9006-59-1
PBS, 1xServicebioG4202-500
PBS, 10xServicebioG4207-500
PercollYeasen40501ES60density gradient media
RPMI 1640 culture mediaCorning10-040-CVRV
Spectral cell analyzerSONYSA3800

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