小鼠原代视网膜色素上皮细胞的分离

摘要

本手稿描述了一种逐步从小鼠眼睛中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼睛的剜除和解剖，然后是RPE细胞的分离，接种和培养。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）层紧邻光感受器后面，并拥有一个复杂的代谢系统，在维持光感受器的功能中起着几个关键作用。因此，RPE结构和功能对于维持正常视力至关重要。该手稿介绍了原代小鼠RPE细胞分离的既定方案。RPE分离是研究不同眼部疾病小鼠模型中RPE病理学分子机制的好工具。此外，RPE分离可以帮助比较从野生型和转基因小鼠中分离的原代小鼠RPE细胞，以及测试可以加速视觉障碍治疗开发的药物。手稿提出了一个循序渐进的RPE隔离方案;整个过程，从眼球摘除到播种，大约需要4个小时。接种后5-7天内不应更换培养基，以使分离的细胞不受干扰地生长。该过程之后通过免疫荧光 表征 细胞中的形态、色素沉着和特异性标志物。细胞最多可以传代三到四次。

引言

视网膜色素上皮（RPE）细胞位于脉络膜和神经视网膜之间，形成位于感光器（PR）细胞后面的简单单层立方体细胞¹。RPE在维持PR细胞的健康环境中起着关键作用，主要是通过减少活性氧（ROS）的过度积累和随之而来的^{氧化损伤1}。RPE细胞监督许多功能，例如类视黄醇的转化和储存，散射光的吸收，液体和离子运输以及脱落的PR外段膜^2，3的吞噬作用。RPE（形态/功能）的改变会损害其功能，导致视网膜病变，这是许多眼部疾病的共同特征⁴。许多眼部疾病与RPE细胞形态和功能的改变有关，包括一些遗传性疾病，如色素性视网膜炎、Leber先天性黑朦和白^化病4，⁵，^6，以及与年龄相关的眼部疾病，如糖尿病视网膜病变（DR）和年龄相关性黄斑变性（AMD）^7，8.人类细胞是最理想的，因此研究原代人RPE细胞中的RPE疾病以形成RPE单层是理想的。然而，伦理问题和人类供体的可用性有限，因为大多数这些疾病导致发病率⁹，但不一定导致死亡率¹⁰，从而阻止了原代人RPE细胞的分离。这使得培养来自非人类动物供体的RPE细胞成为首选的替代方案。啮齿动物，特别是小鼠，被认为是研究不同眼部疾病的绝佳模型，因为转基因技术在这些物种中得到了更广泛的建立¹¹。尽管使用培养的原代RPE细胞具有许多优点，但很难维持生长的细胞进行多次传代，或者储存和重复使用细胞。该协议的主要限制是小鼠的年龄;用于RPE分离的小鼠应该非常年轻（18-21天大是最佳的），因为很难从成年小鼠^11，12，13培养RPE细胞。RPE细胞可以在任何年龄从小鼠眼睛中分离出来，但是多达四次细胞传代仅在年轻小鼠（18-21天大）中成功。使用C57BL6小鼠和在RPE细胞上缺失N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）的转基因小鼠从小鼠视网膜中分离RPE以研究升高的氨基酸同型半胱氨酸对AMD¹⁴发育和进展的影响。此外，分离的原代RPE细胞通过抑制RPE细胞的NMDAR来帮助提出AMD的治疗靶点¹⁴。有一些NMDAR阻滞剂已获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准，目前用于治疗与阿尔茨海默病（AD）相关的中度至重度混乱（痴呆），例如美金刚¹⁶，这可能是AMD¹⁴的潜在治疗靶点。此外，分离的原代小鼠RPE细胞用于检测炎症标志物，并使用转基因小鼠（CBS）诱导炎症作为同型半胱氨酸诱导的AMD和AD特征的潜在机制，其表现出高水平的同型半胱氨酸^16，17。

该方案用于从我们实验室开发的野生型C57BL / 6小鼠和转基因小鼠中分离RPE细胞，作为其他已发布的分离方案¹³，¹⁸，¹⁹的简化改编^，以达到易于应用和可靠的方案。该协议中没有性别偏好。虽然小鼠年龄对分离过程至关重要，但年轻，年龄的小鼠（18-21天大）和任何年龄（长达12个月）的老年小鼠用于RPE分离。然而，我们注意到从年轻小鼠中分离的RPE细胞寿命更长，最多可以进行四次传代。从老年小鼠中分离的RPE细胞可以传代一次或两次，然后它们将停止以正常速率生长并改变其形状以更细长（成纤维细胞样细胞）。还观察到色素沉着丧失和对组织培养板的粘附降低，随后出现脱落。

研究方案

根据奥克兰大学IACUC动物协议编号21063的指南和ARVO在眼科和视觉研究中使用动物的声明的指南使用动物。

1. 溶液制备

1. 通过补充 Dulbecco 的改良鹰培养基/营养混合物 F-12 （DMEM/F12） 和 25% 胎牛血清 （FBS）、1.5% 青霉素/链霉素和 0.02% 庆大霉素来制备完整的 RPE 细胞培养基。
2. 通过向 741 μL Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 补充 127 μL 胶原酶储备溶液和 132 μL 透明质酸酶储备溶液来制备酶 A。这使得最终体积为 1 mL，可以治疗四只眼睛。
   1. 通过将 1 mg 溶 组织梭 菌中的胶原蛋白酶溶解在 41 mL HBSS（19.5 单位/mL）中来制备胶原酶储备溶液。
   2. 通过将 1 mg 来自牛睾丸的透明质酸酶溶解在 18.4 mL HBSS（38 单位/mL）中来制备透明质酸酶储备溶液。
3. 通过将两份 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 添加到三份 HBSS 中来制备酶 B。请注意，总体积取决于解剖的眼睛数量;1 mL 酶 B 可用于治疗四只眼睛。

2. 去核

1. 根据IACUC标准²¹，使用二氧化碳（CO₂）吸入对小鼠实施道德安乐死。
   1. 简而言之，将动物置于CO 2室中以每分钟30%-70%的CO₂填充速率引入100%CO 2，以在₂至3分钟内实现无意识，对小鼠的痛苦最小。
   2. 确认死亡（缺乏呼吸和褪色的眼睛颜色），然后将鼠标从笼子移动到配备无菌手术设备的清洁灭菌手术区域（用酒精擦洗）。
2. 将鼠标放在无菌垫上。
3. 通过在眼眶区域按压 5/45 型镊子来诱导眼球突出，然后将镊子移到眼睛的后部，使眼睛去核。在视神经完好无损的情况下，通过将眼睛轻轻地从眼眶腔中拉出来提取眼睛。
4. 使用镊子将眼睛浸入含有 1mL 5% 聚维酮碘的 2 mL 微量离心管中。在室温下孵育眼睛2-3分钟。
5. 从聚维酮碘溶液中取出眼睛，并将它们放入培养皿中。使用无菌转移移液器，用HBSS清洗眼睛，直到聚维酮碘的橙色消失。这大约需要两到三次洗涤。
6. 将眼睛放在新的60mm培养皿中，并将其浸没在步骤1.1中制备的冷（2-8°C）完全RPE细胞培养基中。

3. 解剖

1. 在手术显微镜下，使用M5S型镊子和Vannas剪刀去除结缔组织和眼外肌。
   注意:解剖是在完全无菌环境中的组织罩下进行的。但是，出于视频目的，解剖显微镜放置在引擎盖外，以实现更高质量的演示/拍摄。在眼睛下方放置一小块不起毛的薄纸可以提高解剖过程中的稳定性。然后可以将眼睛暂时（不超过1小时）放在冷的RPE细胞培养基中。但是，最好在清洁眼睛后立即直接进行下一步。
2. 将眼睛转移到每四只眼睛含有 1 mL 酶 A 溶液的 2 mL 微量离心管中。然后，将眼睛在37°C的培养箱中孵育40分钟。
3. 从培养箱和微量离心管中取出眼睛。然后，将它们转移到每四只眼睛含有 1 mL 酶 B 溶液的新微量离心管中。将管在37°C的培养箱中孵育50分钟。
4. 将眼睛放在含有 10 mL 完整 RPE 细胞生长培养基的新 60 mm 悬浮培养皿中。然后将眼睛在4°C孵育30分钟。
5. 将培养皿放在手术显微镜下并开始解剖。
6. 从眼罩的后部（视网膜后部）取出眼睛的前部（角膜、虹膜和晶状体）。
   1. 用M5S型镊子抓住眼睛，并用#11刀片或注射器的针头在锯齿口部分（浅蓝色末端的视网膜最前部）切开一个切口。
   2. 用一对镊子抓住切口的内部，用另一对镊子抓住角膜。开始慢慢地从视网膜上拉出或撕裂角膜。确保以小增量撕裂并在去除角膜的同时向下移动撕裂，以确保 RPE 基本保持完整并导致更干净的撕裂。
      注意:一旦角膜完全分离，就可以看到虹膜和晶状体。
   3. 将角膜和虹膜分开。
7. 将晶状体与眼罩分开，轻轻按压眼睛的后半部分。
8. 要从 RPE 层中去除神经视网膜，请用一对镊子抓住眼罩的外层，并将第二对镊子的手臂定位在 RPE 和神经层之间。从那里，轻轻地将神经视网膜从RPE层拉开或舀开。丢弃神经视网膜。
   注意:在视频中，神经视网膜和晶状体一起被移除。但是，对于初学者来说，单独删除每个会更容易。剩下的是 RPE、脉络膜和巩膜。
9. 丢弃角膜、虹膜、晶状体和神经视网膜。将剩余的眼罩移动到培养皿上没有碎屑的新区域。
10. 要将 RPE 与脉络膜和巩膜分离，请用 5/45 型镊子轻轻刮擦眼罩内部，以确保 RPE 细胞的分离。当悬浮在完整的RPE细胞生长培养基中时，RPE细胞看起来混浊。
11. 使用 3.2 mL 无菌转移移液管吸出细胞，并转移到含有完整 RPE 细胞生长培养基的新 15 mL 离心管中。

4. 离心

1. 将含有初级RPE细胞的15 mL离心管放入离心机内，并在室温下以300 x g 离心细胞10分钟。
2. 吸出上清液并用 10 mL 完全 RPE 生长培养基重悬沉淀。完整的 RPE 生长培养基比其他污染细胞（如 Müller 细胞或脉络膜内皮细胞）对 RPE 生长更具特异性。Müller细胞需要高葡萄糖培养基，而脉络膜内皮细胞需要特定的生长因子。通过改变培养基和传代培养物，只有RPE细胞会继续生长。

5. 细胞培养

1. 将重悬的原代RPE细胞接种到无菌100mm培养皿上，并将它们转移到培养箱中（通过用特定的RPE / Müller细胞标记物染色细胞来验证纯度后，如图 1E-N所示）。将细胞在37°C和5%CO₂下孵育。
   注意:使用的标记在 材料表中提及。此步骤在建立区域性后执行。
2. 孵育细胞约5天以生长。在此期间，请勿更换培养基，干扰细胞或移动细胞培养板（这是方案中的关键步骤;分离后，应孵育细胞并且5天内不要受到干扰）。
   注意:细胞数量取决于用于隔离的眼睛数量。隔离的眼睛数量越多，细胞数量就越多。从两只眼睛中分离的RPE将产生~440，000-880，000个细胞，或100毫米培养皿的5%-10%，可容纳880万个细胞。

6. 传代

1. 吸出培养基并用 2 mL PBS 洗涤。然后吸出PBS。
2. 加入 4 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1x），或足以覆盖培养皿底部。在室温下孵育5-10分钟。
3. 加入 8 mL 预热的 RPE 培养基或步骤 6.2 中使用的胰蛋白酶体积的两倍。然后收集细胞并将其放入 15 mL 离心管中。
4. 在室温下以300 ×g 离心7分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于 10 mL 的完整 RPE 细胞培养基中。将整个悬浮液铺在无菌的100毫米培养皿中。
   注意:细胞最多可传代四到五次¹⁸。然而，最一致的实验结果是在两到三次传代后发现的。经过两到四次传代后，细胞改变其形状（如图 1D所示）以更加细长，积聚在板的中间，停止生长并分离。
5. 按照先前发表的方法⁸，¹⁴，^15，16，使用免疫荧光方案对RPE特异性进行染色和验证。

7. 免疫荧光

注意:按照先前发表的方法⁸，^14，15，16，¹⁷，¹⁸进行免疫荧光^，以染色和验证RPE特异性。原代RPE细胞的染色通常在P1和P2传代处进行。这里简要概述了免疫荧光方案。

1. 将细胞接种在细胞培养室载玻片上（8孔室载玻片每孔30，000个细胞）。
2. 在37°C和5%CO₂ 的完整RPE细胞培养基中培养细胞24-48小时。
3. 当细胞汇合80%-90%时，吸出培养基并用1x PBS清洗腔室载玻片。
4. 用4%多聚甲醛固定载玻片10-15分钟。
5. 吸出4%的多聚甲醛，然后用封闭溶液封闭（见 材料表）。
6. 吸出封闭溶液并加入一抗RPE65，并在37°C下孵育3小时（封闭缓冲液中的抗体浓度范围为1:200-1:250，体积为150-200μL/载玻片）。然后，用PBS / TX-100洗涤三次（每次洗涤5-10分钟）。
7. 吸出一抗并加入二抗（封闭缓冲液中的抗体浓度为1:1，000，体积为150-200μL/载玻片）。在37°C孵育一小时。
8. 吸出二抗。用PBS / Trtion X-100洗涤三次（每次洗涤5-10分钟）。
9. 添加一滴DAPI封片剂以标记细胞核，并在载玻片上放置盖玻片。确保盖玻片下方没有气泡。
10. 然后，用荧光显微镜拍摄图像，并配合高分辨率显微镜（HRM）相机和图像处理软件（见 材料表）。

结果

验证分离的 RPE 细胞的特异性、纯度和屏障功能/形成
在光学显微镜下检查分离的细胞以验证其活力，形态和色素沉着。捕获来自P0和P1的图像（图1A，B）以及来自P0和P4的图像（图1C，D）以显示细胞的变化;当传代进行到第四代时，形状，大小和色素沉着（黑色箭头指向P4中分离的RPE细胞）。RPE65蛋白的抗体用于验证分离细胞的?...

讨论

当前协议是从小鼠眼睛中分离RPE的报告，修改和简化的详细程序。该协议包括从小鼠眼睛分离的RPE细胞的剜除，解剖，收集，接种，培养和表征。

成功进行RPE分离必须满足一些限制和关键步骤，例如小鼠年龄，解剖的眼睛数量，组织培养板或培养皿的大小以及接种，储存和传代后的注意事项。为了能够传代分离的细胞多达三到四次，最好的小鼠年龄在18-21天之间。为了获得合...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C7657-25MG	For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM/F12	gibco	11330	Media to grow RPE cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15750-060	For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Scientific	88284	For working enzymes (A&B)
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma-Aldrich	H3506-500MG	For working enzyme A
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab78036	For IF staining
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25%	gibco	2186962	For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a