Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

Резюме

Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.

Аннотация

Слой пигментированного эпителия сетчатки (RPE) находится непосредственно за фоторецепторами и содержит сложную метаболическую систему, которая играет несколько критических ролей в поддержании функции фоторецепторов. Таким образом, структура и функция RPE необходимы для поддержания нормального зрения. В этой рукописи представлен установленный протокол для первичной изоляции клеток RPE мыши. Изоляция RPE является отличным инструментом для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии RPE в различных мышиных моделях глазных расстройств. Кроме того, изоляция RPE может помочь в сравнении первичных клеток RPE мышей, выделенных у диких и генетически модифицированных мышей, а также в тестировании лекарств, которые могут ускорить разработку терапии зрительных расстройств. В рукописи представлен пошаговый протокол изоляции RPE; вся процедура, от энуклеации до посева, занимает примерно 4 часа. Среда не должна быть изменена в течение 5-7 дней после посева, чтобы обеспечить рост изолированных клеток без нарушения. За этим процессом следует характеристика морфологии, пигментации и специфических маркеров в клетках посредством иммунофлуоресценции. Клетки могут быть пройдены максимум три или четыре раза.

Введение

Клетки пигментированного эпителия сетчатки (RPE) расположены между сосудистой оболочкой и нервной сетчаткой, образуя простой монослой кубоидальных клеток, который лежит за фоторецепторными (PR) клетками¹. RPE играет решающую роль в поддержании здоровой окружающей среды для PR-клеток, главным образом путем уменьшения чрезмерного накопления активных форм кислорода (АФК) и последующего окислительного повреждения¹. Клетки RPE контролируют многие функции, такие как преобразование и хранение ретиноидов, поглощение рассеянного света, транспорт жидкости и ионов и фагоцитоз сброшенной PR наружной сегментной мембраны ^2,3. Изменения в RPE (морфология / функция) могут ухудшить их функцию, ведущую к ретинопатии, и это общая черта, общая для многих глазных расстройств⁴. Многие глазные заболевания связаны с изменениями в морфологии и функции клеток RPE, включая некоторые генетические заболевания, такие как пигментный ретинит, врожденный амавроз Лебера и альбинизм ^4,5,6, а также возрастные глазные расстройства, такие как диабетическая ретинопатия (DR) и возрастная макулярная дегенерация (AMD)^7,8 . Клетки человека являются наиболее желательными, поэтому было бы идеально изучать нарушения RPE в первичных клетках RPE человека для формирования монослоев RPE. Однако этические вопросы и ограниченная доступность человеческих доноров обусловлены тем, что большинство из этих расстройств приводят к заболеваемости⁹, но не обязательно к смертности¹⁰, тем самым предотвращая выделение первичных клеток РПЭ человека. Это делает культивирование клеток RPE от нечеловеческих доноров животных предпочтительной альтернативой. Грызуны, особенно мыши, считаются отличной моделью для изучения различных глазных заболеваний, поскольку трансгенная технология более широко распространена у этих видов¹¹. Несмотря на то, что использование культивируемых первичных клеток RPE предлагает много преимуществ, было трудно поддерживать растущие клетки в течение многих проходов или хранить и повторно использовать клетки. Основным ограничением этого протокола является возраст мышей; мыши, которые используются для изоляции RPE, должны быть очень молодого возраста (оптимально 18-21 день), так как было трудно культивировать клетки RPE у взрослых мышей 11,12,13. Клетки RPE могут быть выделены из глаз мыши в любом возрасте, однако до четырех клеточных проходов были успешными только у молодых мышей (18-21 день). Изоляция RPE от сетчатки мышей с использованием как мышей C57BL6, так и трансгенных мышей с делецией рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDAR) в клетках RPE была выполнена для изучения влияния повышенного уровня аминокислотного гомоцистеина на развитие и прогрессирование AMD¹⁴. Кроме того, изолированные первичные клетки RPE помогли предложить терапевтическую мишень для ВМД путем ингибирования NMDAR в клетках RPE¹⁴. Существуют некоторые блокаторы NMDAR, которые одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и в настоящее время используются для лечения умеренной и тяжелой путаницы (деменции), связанной с болезнью Альцгеймера (БА), таких как мемантин¹⁶, который может быть потенциальной терапевтической мишенью для ВМД¹⁴. Кроме того, изолированные первичные мышиные клетки RPE были использованы для обнаружения воспалительных маркеров и предполагаемой индукции воспаления в качестве основного механизма гомоцистеин-индуцированных признаков ВМД и AD с использованием генетически модифицированной мыши (CBS), которая представляет высокий уровень гомоцистеина^16,17.

Этот протокол был использован для изоляции клеток RPE как от мышей дикого типа C57BL/6, так и от трансгенных мышей, разработанных в нашей лаборатории в качестве упрощенной адаптации других опубликованных протоколов изоляции 13,18,19 для достижения легко применимого и надежного протокола. В этом протоколе нет предпочтения пола. В то время как возраст мышей имеет решающее значение для процесса изоляции, молодые, пожилые мыши (18-21 день) и пожилые мыши в любом возрасте (до 12 месяцев) использовались для изоляции RPE. Тем не менее, мы заметили, что клетки RPE, выделенные у молодых мышей, жили дольше, и можно было выполнить до четырех проходов. Клетки RPE, выделенные у старых мышей, могут быть пройдены один или два раза, затем они перестанут расти с нормальной скоростью и изменят свою форму, чтобы быть более вытянутыми (фибробластоподобные клетки). Также наблюдалась потеря пигментации и снижение адгезии к тканевой культуральной пластине с последующим отслоением.

протокол

Животные использовались в соответствии с руководящими принципами оклендского университета IACUC для животных No 21063 и руководящими принципами Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Приготовление раствора

1. Подготовьте полную среду для культивирования клеток RPE, дополнив модифицированную смесь F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco 25% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1,5% пенициллина/стрептомицина и 0,02% гентамицина.
2. Приготовьте фермент А, дополнив 741 мкл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) 127 мкл раствора коллагеназы и 132 мкл раствора гиалуронидазы. Это составляет конечный объем в 1 мл, который может обрабатывать четыре глаза.
   1. Приготовьте раствор коллагеназы путем растворения 1 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum в 41 мл HBSS (19,5 ед/мл).
   2. Готовят раствор гиалуронидазы путем растворения 1 мг гиалуронидазы из яичек крупного рогатого скота в 18,4 мл HBSS (38 единиц / мл).
3. Приготовьте фермент B, добавив две части 0,25% трипсина-ЭДТА к трем частям HBSS. Отметим, что общий объем зависит от количества рассеченных глаз; 1 мл фермента B можно использовать для лечения четырех глаз.

2. Энуклеация

1. Этически усыпить мышь с помощью вдыхания углекислого газа (CO₂) в соответствии со стандартами^{IACUC 21}.
   1. Вкратце, поместите животное (животных) в камеру CO₂ для введения 100% CO₂ со скоростью заполнения 30%-70% объема камеры в минуту CO₂ для достижения потери сознания в течение 2-3 мин, с минимальным стрессом для мышей.
   2. Подтвердите смерть (отсутствие дыхания и блеклый цвет глаз), затем переместите мышь из клетки в чистую стерилизованную хирургическую область (очищенную спиртом), оснащенную стерилизованным хирургическим оборудованием.
2. Поместите мышь на стерильную нижнюю панель.
3. Энуклеат глаз, нажимая пинцет в стиле 5/45 на орбитальную область, чтобы вызвать проптоз, с последующим перемещением пинцета к задней части глаза. Извлеките глаза, с неповрежденным зрительным нервом, осторожно вытягивая глаза из орбитальной полости.
4. Используя щипцы, погрузите глаза в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 1 мл 5% повидона-йода. Инкубировать глаза при комнатной температуре в течение 2-3 мин.
5. Извлеките глаза из раствора повидона-йода и поместите их в чашку Петри. Используя стерильную передаточную пипетку, промывайте глаза HBSS до тех пор, пока оранжевый цвет повидона-йода не исчезнет. Это занимает около двух или трех стирок.
6. Поместите глаза в новую чашку Петри толщиной 60 мм и погрузите их в холодную (2-8 °C) полную среду для культивирования клеток RPE, приготовленную на этапе 1.1.

3. Рассечение

1. Под хирургическим микроскопом используйте пинцет в стиле M5S и ножницы Vannas для удаления соединительной ткани и экстраокулярных мышц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение проводится под тканевым капюшоном в полностью стерильной среде. Тем не менее, для видео целей рассекающий микроскоп был размещен за пределами капота для достижения более высокого качества демонстрации / съемки. Помещение небольшого кусочка безворсовой папиросной бумаги под глаз улучшает стабильность во время рассечения. Затем глаза можно временно удерживать (не более 1 часа) в холодной среде культивирования клеток RPE. Однако предпочтительнее переходить непосредственно к следующему шагу сразу после чистки глаз.
2. Перенесите глаза в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую 1 мл раствора фермента А на каждые четыре глаза. Затем высиживают глаза в инкубаторе при 37 °C в течение 40 мин.
3. Извлеките глаза из инкубатора и микроцентрифужной трубки. Затем перенесите их в новую микроцентрифужную трубку, содержащую 1 мл раствора фермента В на каждые четыре глаза. Инкубируют трубку в инкубаторе при 37 °C в течение 50 мин.
4. Поместите глаза в новую 60-миллиметровую суспензионную культуральную чашку, содержащую 10 мл полной среды роста клеток RPE. Затем инкубируют глаза при 4 °C в течение 30 мин.
5. Поместите блюдо под хирургический микроскоп и начните рассечение.
6. Удалите переднюю часть глаза (роговицу, радужную оболочку и хрусталик) из задней части подглазника (задняя сетчатка).
   1. Захватите глаз щипцами в стиле M5S и сделайте разрез в секции ora serrata (самая передняя часть сетчатки, где заканчивается светло-синий цвет) лезвием No 11 или иглой шприца.
   2. Захватите внутреннюю часть разреза одной парой щипцов, а другой парой щипцов обхватите роговицу. Начните медленно вытягивать или отрывать роговицу от сетчатки. Обязательно разрывайте небольшими шагами и двигайтесь вниз по разрыву при удалении роговицы, чтобы гарантировать, что RPE остается в основном неповрежденным и приводит к более чистому разрыву.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только роговица полностью отделится, можно увидеть радужную оболочку и хрусталик.
   3. Разделите роговицу и радужную оболочку.
7. Отделите хрусталик от наглазника с помощью мягкого сжатия задней половины глаза.
8. Чтобы удалить нервную сетчатку из слоя RPE, захватите внешний слой глазника одной парой пинцета и расположите руку второй пары пинцета между RPE и нейронными слоями. Оттуда осторожно потяните или зачерпните нервную сетчатку подальше от слоя RPE. Отбросьте нервную сетчатку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На видео нейронная сетчатка и хрусталик удалены вместе. Однако новичкам будет проще убрать каждый по отдельности. То, что остается, это RPE, сосудистая оболочка и склера.
9. Отбросьте роговицу, радужную оболочку, хрусталик и нервную сетчатку. Переместите оставшийся наглазник в новую область на блюде, свободную от мусора.
10. Чтобы отделить RPE от сосудистой оболочки и склеры, аккуратно соскоблите внутреннюю часть наглазника пинцетом в стиле 5/45, чтобы обеспечить разделение клеток RPE. Клетки RPE кажутся мутными при суспендировании в полной среде роста клеток RPE.
11. Аспирируйте клетки с помощью стерильной трансферной пипетки объемом 3,2 мл и переносите в новую центрифужную трубку объемом 15 мл, содержащую полную среду роста клеток RPE.

4. Центрифугирование

1. Поместите 15 мл центрифужной трубки, содержащей первичные ячейки RPE, внутрь центрифуги и центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
2. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу с 10 мл полной питательной среды RPE. Полная среда роста RPE более специфична для роста RPE, чем другие загрязняющие клетки, такие как клетки Мюллера или хориоидальные эндотелиальные клетки. Клетки Мюллера требуют среды с высоким содержанием глюкозы, в то время как хориоидальные эндотелиальные клетки требуют специфических факторов роста. Изменяя среду и передавая культуру, только клетки RPE будут продолжать расти.

5. Клеточная культура

1. Нанесите повторно суспендированные первичные клетки RPE на стерильную 100-миллиметровую чашку Петри и перенесите их в инкубатор (после проверки чистоты путем окрашивания клеток специфическими маркерами клеток RPE/Müller, как показано на рисунке 1E-N). Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые маркеры указаны в Таблице материалов. Этот шаг выполняется после создания языка и региональных параметров.
2. Инкубируйте клетки в течение примерно 5 дней, чтобы расти. В течение этого времени не изменяйте среду, не тревожайте клетки и не перемещайте пластинку клеточной культуры (это критический шаг в протоколе; после выделения клетки должны быть инкубированы и не беспокоиться в течение 5 дней).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток зависит от количества глаз, используемых для изоляции. Большее количество изолированных глаз даст большее количество клеток. Изоляция RPE от двух глаз даст ~ 440 000-880 000 клеток, или 5%-10% от 100 мм чашки Петри, которая может вместить 8,8 миллиона клеток.

6. Пассаж

1. Аспирировать носитель и промыть 2 мл PBS. Затем аспирируйте PBS.
2. Добавьте 4 мл 0,25% трипсина-ЭДТА (1x), или достаточно, чтобы покрыть основу блюда. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
3. Добавьте 8 мл предварительно нагретой среды RPE или в два раза больше объема, чем было использовано на этапе 6.2. Затем соберите клетки и поместите их в центрифужную трубку объемом 15 мл.
4. Центрифуга при 300 х г в течение 7 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в 10 мл полной клеточной культуральной среды RPE. Выложите всю суспензию в стерильную чашку Петри толщиной 100 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки могут быть пройдены до четырех или пяти раз¹⁸. Однако наиболее последовательные результаты эксперимента обнаруживаются после двух-трех проходов. После двух-четырех проходов клетки изменили свою форму (как показано на рисунке 1D), чтобы стать более вытянутыми, накапливались в середине пластины, перестали расти и отделились.
5. Используйте протоколы иммунофлуоресценции, в соответствии с ранее опубликованными методами 8,14,15,16, для окрашивания и проверки специфичности RPE.

7. Иммунофлуоресценция

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресценцию проводили в соответствии с ранее опубликованными методами 8,14,15,16,17,18 для окрашивания и подтверждения специфичности RPE. Окрашивание первичных клеток RPE обычно проводилось в проходах P1 и P2. Здесь представлен краткий обзор иммунофлуоресцентного протокола.

1. Посейте клетки на слайд камеры клеточной культуры (30 000 клеток на лунку для слайда с 8-луночной камерой).
2. Культивируйте клетки в полной среде для культивирования клеток RPE при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24-48 ч.
3. Когда клетки будут на 80%-90% сливаться, аспирируйте среду и промывайте слайд камеры с 1x PBS.
4. Зафиксируйте слайд 4% параформальдегидом в течение 10-15 мин.
5. Аспирировать 4% параформальдегид, а затем блокировать блокирующим раствором (см. Таблицу материалов).
6. Аспирировать блокирующий раствор и добавить первичное антитело, RPE65, и инкубировать в течение трех часов при 37 °C (с концентрацией антител в диапазоне от 1:200-1:250 в блокирующем буфере, в объеме 150-200 мкл/слайд). Затем трижды вымойте PBS/TX-100 (по 5-10 мин каждая стирка).
7. Аспирировать первичное антитело и добавить вторичное антитело (с концентрацией антител 1:1000 в блокирующем буфере, в объеме 150-200 мкл/слайд). Инкубировать в течение одного часа при 37 °C.
8. Аспирировать выводится из вторичного антитела. Трижды мойте PBS/Trtion X-100 (5-10 мин каждая стирка).
9. Добавьте каплю монтажного носителя DAPI, чтобы обозначить ядра, и поместите крышку поверх слайда. Убедитесь, что под крышкой нет пузырьков.
10. Затем делайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа в сопровождении камеры микроскопа высокого разрешения (HRM) и программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов).

Результаты

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции/формирования изолированных клеток RPE
Изолированные клетки исследовали под световым микроскопом, чтобы проверить их жизнеспособность, морфологию и пигментацию. Были получены изображения из P0 и P1 (рисуно?...

Обсуждение

Текущий протокол представляет собой отчетную, модифицированную и упрощенную подробную процедуру изоляции RPE от глаз мыши. Протокол включает энуклеацию, рассечение, сбор, посев, культивирование и характеристику клеток RPE, выделенных из глаз мыши.

Существуют некоторые огр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C7657-25MG	For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM/F12	gibco	11330	Media to grow RPE cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15750-060	For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Scientific	88284	For working enzymes (A&B)
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma-Aldrich	H3506-500MG	For working enzyme A
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab78036	For IF staining
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25%	gibco	2186962	For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a