Выделение первичных пигментированных клеток эпителия сетчатки мыши

Резюме

Эта рукопись описывает упрощенный протокол для выделения клеток пигментированного эпителия сетчатки (RPE) из глаз мыши ступенчатым образом. Протокол включает в себя энуклеацию и рассечение глаз мыши с последующим выделением, посевом и культивированием клеток RPE.

Аннотация

Слой пигментированного эпителия сетчатки (RPE) находится непосредственно за фоторецепторами и содержит сложную метаболическую систему, которая играет несколько критических ролей в поддержании функции фоторецепторов. Таким образом, структура и функция RPE необходимы для поддержания нормального зрения. В этой рукописи представлен установленный протокол для первичной изоляции клеток RPE мыши. Изоляция RPE является отличным инструментом для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии RPE в различных мышиных моделях глазных расстройств. Кроме того, изоляция RPE может помочь в сравнении первичных клеток RPE мышей, выделенных у диких и генетически модифицированных мышей, а также в тестировании лекарств, которые могут ускорить разработку терапии зрительных расстройств. В рукописи представлен пошаговый протокол изоляции RPE; вся процедура, от энуклеации до посева, занимает примерно 4 часа. Среда не должна быть изменена в течение 5-7 дней после посева, чтобы обеспечить рост изолированных клеток без нарушения. За этим процессом следует характеристика морфологии, пигментации и специфических маркеров в клетках посредством иммунофлуоресценции. Клетки могут быть пройдены максимум три или четыре раза.

Введение

Клетки пигментированного эпителия сетчатки (RPE) расположены между сосудистой оболочкой и нервной сетчаткой, образуя простой монослой кубоидальных клеток, который лежит за фоторецепторными (PR) клетками¹. RPE играет решающую роль в поддержании здоровой окружающей среды для PR-клеток, главным образом путем уменьшения чрезмерного накопления активных форм кислорода (АФК) и последующего окислительного повреждения¹. Клетки RPE контролируют многие функции, такие как преобразование и хранение ретиноидов, поглощение рассеянного света, транспорт жидкости и ионов и фагоцитоз сброшенной PR наружной сегментной мембраны

протокол

Животные использовались в соответствии с руководящими принципами оклендского университета IACUC для животных No 21063 и руководящими принципами Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Приготовление раствора

1. Подготовьте полную среду для культивирования клеток RPE, дополнив модифицированную смесь F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco 25% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1,5% пенициллина/стрептомицина и 0,02% гентамицина.
2. Приготовьте фермент А, дополнив 741 мкл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) 127 мкл раствора коллагеназы и 132 мкл раствора гиалуронид....

Результаты

Валидация специфичности, чистоты и барьерной функции/формирования изолированных клеток RPE
Изолированные клетки исследовали под световым микроскопом, чтобы проверить их жизнеспособность, морфологию и пигментацию. Были получены изображения из P0 и P1 (рисуно?.......

Обсуждение

Текущий протокол представляет собой отчетную, модифицированную и упрощенную подробную процедуру изоляции RPE от глаз мыши. Протокол включает энуклеацию, рассечение, сбор, посев, культивирование и характеристику клеток RPE, выделенных из глаз мыши.

Существуют некоторые огр.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C7657-25MG	For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM/F12	gibco	11330	Media to grow RPE cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15750-060	For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Scientific	88284	For working enzymes (A&B)
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma-Aldrich	H3506-500MG	For working enzyme A
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab78036	For IF staining
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25%	gibco	2186962	For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a