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Erratum Notice

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Resumen

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Resumen

La capa de epitelio pigmentado de la retina (EPR) se encuentra inmediatamente detrás de los fotorreceptores y alberga un sistema metabólico complejo que desempeña varios papeles críticos en el mantenimiento de la función de los fotorreceptores. Por lo tanto, la estructura y función del EPR son esenciales para mantener la visión normal. Este manuscrito presenta un protocolo establecido para el aislamiento primario de células RPE de ratón. El aislamiento de EPR es una gran herramienta para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la patología del EPR en los diferentes modelos murinos de trastornos oculares. Además, el aislamiento de EPR puede ayudar a comparar células primarias de EPR de ratón aisladas de ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados, así como a probar medicamentos que pueden acelerar el desarrollo de la terapia para trastornos visuales. El manuscrito presenta un protocolo de aislamiento de EPR paso a paso; Todo el procedimiento, desde la enucleación hasta la siembra, dura aproximadamente 4 horas. Los medios no deben cambiarse durante 5-7 días después de la siembra, para permitir el crecimiento de las células aisladas sin perturbación. Este proceso es seguido por la caracterización de la morfología, pigmentación y marcadores específicos en las células a través de la inmunofluorescencia. Las células pueden pasar un máximo de tres o cuatro veces.

Introducción

Las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) se localizan entre la coroides y la retina neural, formando una monocapa simple de células cuboidales que se encuentra detrás de las células fotorreceptoras (PR)1. El EPR desempeña un papel crítico en el mantenimiento de un ambiente saludable para las células PR, principalmente al reducir la acumulación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consiguiente daño oxidativo1. Las células del EPR supervisan muchas funciones, como la conversión y almacenamiento de retinoides, la absorción de luz dispersa, el transporte de líquidos e iones, y la fagocitosis de la membrana del segmento externo PR desprendido 2,3. Las alteraciones en el EPR (morfología/función) pueden perjudicar su función conduciendo a la retinopatía y esta es una característica común compartida por muchos trastornos oculares4. Muchas enfermedades oculares están asociadas con alteraciones en la morfología y función de las células del EPR, incluyendo algunas enfermedades genéticas como la retinosis pigmentaria, la amaurosis congénita de Leber y el albinismo 4,5,6, así como trastornos oculares relacionados con la edad como la retinopatía diabética (RD) y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE)7,8 . Las células humanas son las más deseables, por lo que sería ideal estudiar los trastornos del EPR en células primarias del EPR humano para formar monocapas del EPR. Sin embargo, las cuestiones éticas y la disponibilidad limitada de donantes humanos debido al hecho de que la mayoría de estos trastornos conducen a la morbilidad9, pero no necesariamente a la mortalidad10, lo que impide el aislamiento de las células humanas primarias del EPR. Esto hace que el cultivo de células RPE de donantes animales no humanos sea una alternativa preferida. Los roedores, particularmente los ratones, son considerados un gran modelo para estudiar diferentes enfermedades oculares, ya que la tecnología transgénica está más ampliamente establecida en estas especies11. Aunque el uso de células RPE primarias cultivadas ofrece muchas ventajas, ha sido difícil mantener las células en crecimiento durante muchos pasajes, o almacenar y reutilizar las células. La principal limitación de este protocolo es la edad de los ratones; Los ratones que se utilizan para el aislamiento de EPR deben ser de una edad muy temprana (18-21 días de edad es óptimo) ya que ha sido difícil cultivar células de EPR de ratones adultos11,12,13. Las células del EPR se pueden aislar de los ojos de ratón a cualquier edad, sin embargo, hasta cuatro pasajes celulares solo tuvieron éxito con ratones jóvenes (18-21 días de edad). El aislamiento del EPR de las retinas de ratón, utilizando ratones C57BL6 y ratones transgénicos con deleción de los receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) en las células del EPR, se realizó para estudiar el efecto de la homocisteína de aminoácidos elevados en el desarrollo y la progresión de la DMAE14. Además, las células primarias aisladas del EPR ayudaron a proponer una diana terapéutica para la DMAE mediante la inhibición de los NMDAR en las células del EPR14. Hay algunos bloqueadores NMDAR que están aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y actualmente se usan para tratar la confusión moderada a severa (demencia) relacionada con la enfermedad de Alzheimer (EA), como la memantina16, que podría ser un objetivo terapéutico potencial para la DMAE14. Además, se utilizaron células primarias aisladas de RPE de ratón para la detección de marcadores inflamatorios y la inducción propuesta de inflamación como mecanismo subyacente para las características de DMAE y EA inducidas por homocisteína utilizando un ratón modificado genéticamente (CBS), que presenta un alto nivel de homocisteína16,17.

Este protocolo se utilizó para aislar células RPE tanto de ratones C57BL / 6 de tipo salvaje como de ratones transgénicos desarrollados en nuestro laboratorio como una adaptación simplificada de otros protocolos de aislamiento publicados13,18,19 para alcanzar un protocolo fácilmente aplicable y confiable. No hay preferencia sexual en este protocolo. Si bien las edades de los ratones son críticas para el proceso de aislamiento, se utilizaron ratones jóvenes y envejecidos (18-21 días de edad) y ratones más viejos a cualquier edad (hasta 12 meses) para el aislamiento del EPR. Sin embargo, notamos que las células del EPR aisladas de los ratones jóvenes vivían más tiempo, y se podían realizar hasta cuatro pasajes. Las células del EPR aisladas de ratones más viejos podrían pasar una o dos veces, luego dejarían de crecer a un ritmo normal y cambiarían su forma para ser más alargadas (células similares a fibroblastos). También se observó pérdida de pigmentación y disminución de la adhesión a la placa de cultivo tisular seguida de desprendimiento.

Protocolo

Los animales se utilizaron según las pautas del protocolo animal IACUC número 21063 de la Universidad de Oakland y las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.

1. Preparación de la solución

  1. Prepare los medios de cultivo celular RPE completos complementando el medio de águila modificada de Dulbecco / mezcla de nutrientes F-12 (DMEM / F12) con 25% de suero bovino fetal (FBS), 1.5% de penicilina/estreptomicina y 0.02% de gentamicina.
  2. Prepare la enzima A complementando 741 μL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con 127 μL de solución madre de colagenasa y 132 μL de solución madre de hialuronidasa. Esto hace un volumen final de 1 mL, que puede tratar cuatro ojos.
    1. Preparar la solución madre de colagenasa disolviendo 1 mg de colagenasa de Clostridium histolyticum en 41 ml de HBSS (19,5 unidades/ml).
    2. Preparar la solución madre de hialuronidasa disolviendo 1 mg de hialuronidasa de testículos bovinos en 18,4 ml de HBSS (38 unidades/ml).
  3. Prepare la enzima B agregando dos partes de tripsina-EDTA al 0,25% a tres partes de HBSS. Tenga en cuenta que el volumen total depende del número de ojos disecados; Se puede usar 1 ml de enzima B para tratar cuatro ojos.

2. Enucleación

  1. Practicar la eutanasia ética al ratón mediante inhalación de dióxido de carbono (CO2) de acuerdo con las normas IACUC21.
    1. Brevemente, coloque el animal (s) en la cámara deCO2 para introducir 100% de CO 2 con una tasa de llenado de 30% -70% del volumen de la cámara por minuto con CO 2 para lograr la inconsciencia dentro de2 a 3 minutos, con una angustia mínima para los ratones.
    2. Confirme la muerte (falta de respiración y color de ojos descolorido), luego mueva el ratón de la jaula a un área quirúrgica limpia y esterilizada (frotada con alcohol) equipada con equipo quirúrgico esterilizado.
  2. Coloque el ratón sobre una almohadilla estéril.
  3. Nuclee los ojos presionando pinzas estilo 5/45 en el área orbital para inducir la proptosis, seguido de mover las pinzas hacia la parte posterior del ojo. Extraiga los ojos, con el nervio óptico intacto, tirando suavemente de los ojos de la cavidad orbitaria.
  4. Usando fórceps, sumerja los ojos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de povidona yodada al 5%. Incubar los ojos a temperatura ambiente durante 2-3 min.
  5. Retire los ojos de la solución de povidona yodada y colóquelos en una placa de Petri. Usando una pipeta de transferencia estéril, lave los ojos con HBSS hasta que el color naranja de la povidona yodada haya desaparecido. Esto toma alrededor de dos o tres lavados.
  6. Colocar los ojos en una nueva placa de Petri de 60 mm y sumergirlos en un medio de cultivo celular RPE completo frío (2-8 °C) preparado en el paso 1.1.

3. Disección

  1. Bajo un microscopio quirúrgico, use pinzas estilo M5S y tijeras Vannas para extraer el tejido conectivo y los músculos extraoculares.
    NOTA: La disección se realiza bajo una campana de tejido en un ambiente completamente estéril. Sin embargo, para fines de video, el microscopio de disección se colocó fuera de la campana para lograr una demostración / filmación de mayor calidad. Colocar un pequeño trozo de papel de seda sin pelusa debajo del ojo mejora la estabilidad durante la disección. Luego, los ojos se pueden sostener temporalmente (no por más de 1 hora) en los medios de cultivo celular RPE fríos. Sin embargo, es preferible proceder directamente al siguiente paso inmediatamente después de limpiar los ojos.
  2. Transfiera los ojos a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de solución de enzima A por cada cuatro ojos. A continuación, incubar los ojos en una incubadora a 37 °C durante 40 min.
  3. Retire los ojos de la incubadora y del tubo de microcentrífuga. Luego, transfiéralos a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenga 1 ml de solución de enzima B por cada cuatro ojos. Incubar el tubo en una incubadora a 37 °C durante 50 min.
  4. Coloque los ojos en una nueva placa de cultivo en suspensión de 60 mm que contenga 10 ml de medios de crecimiento celular RPE completos. A continuación, incubar los ojos a 4 °C durante 30 min.
  5. Coloque el plato bajo un microscopio quirúrgico y comience a diseccionar.
  6. Extraer la parte anterior del ojo (córnea, iris y cristalino) de la parte posterior del ocular (retina posterior).
    1. Agarre el ojo con pinzas estilo M5S y haga una incisión en la sección de ora serrata (parte más anterior de la retina donde termina el azul claro) con una cuchilla #11 o la aguja de una jeringa.
    2. Agarre la parte interna de la incisión con un par de fórceps y agarre la córnea con otro par de fórceps. Comience a extraer o desgarrar lentamente la córnea de la retina. Asegúrese de rasgar en pequeños incrementos y mover hacia abajo el desgarro mientras retira la córnea, para asegurarse de que el EPR permanezca casi intacto y resulte en un desgarro más limpio.
      NOTA: Una vez que la córnea está completamente separada, se puede ver el iris y el cristalino.
    3. Separe tanto la córnea como el iris.
  7. Separe el cristalino del ocular con una compresión suave de la mitad posterior del ojo.
  8. Para extraer la retina neural de la capa RPE, agarre la capa externa del ocular con un par de pinzas y coloque el brazo de un segundo par de pinzas entre el RPE y las capas neurales. A partir de ahí, tire suavemente o saque la retina neural lejos de la capa RPE. Deseche la retina neural.
    NOTA: En el video, la retina neural y el cristalino se eliminan juntos. Sin embargo, para los principiantes, será más fácil eliminar cada uno por separado. Lo que queda es el EPR, la coroides y la esclerótica.
  9. Deseche la córnea, el iris, el cristalino y la retina neural. Mueva el ocular restante a una nueva área en el plato libre de residuos.
  10. Para separar el EPR de la coroides y la esclerótica, raspe suavemente el interior del ocular con pinzas estilo 5/45 para asegurar la separación de las células del EPR. Las células del EPR aparecen turbias cuando están suspendidas en el medio completo de crecimiento de las células del EPR.
  11. Aspirar las células con una pipeta de transferencia estéril de 3,2 ml y transferirlas a un nuevo tubo centrífugo de 15 ml que contenga medios completos de crecimiento celular del EPR.

4. Centrifugación

  1. Coloque el tubo de centrífuga de 15 ml que contiene células RPE primarias dentro de una centrífuga y centrifugar las células a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet con 10 ml de medios de crecimiento RPE completos. El medio de crecimiento completo del EPR es más específico para el crecimiento del EPR que otras células contaminantes, como las células de Müller o las células endoteliales coroideas. Las células de Müller requieren medios de glucosa altos, mientras que las células endoteliales coroideas requieren factores de crecimiento específicos. Al cambiar los medios y pasar el cultivo, solo las células RPE continuarán creciendo.

5. Cultivo celular

  1. Colocar las células RPE primarias resuspendidas en una placa de Petri estéril de 100 mm y transferirlas a una incubadora (después de verificar la pureza teñiendo las células con marcadores específicos de células RPE/Müller, como se indica en la Figura 1E-N). Incubar las células a 37 °C y 5% deCO2.
    NOTA: Los marcadores utilizados se mencionan en la Tabla de materiales. Este paso se realiza después de establecer la cultura.
  2. Incubar las células durante unos 5 días para que crezcan. Durante este tiempo, no cambie los medios, perturbe las células ni mueva la placa de cultivo celular (este es un paso crítico en el protocolo; después del aislamiento, las células deben incubarse y no ser perturbadas durante 5 días).
    NOTA: El número de células depende del número de ojos utilizados para el aislamiento. Un mayor número de ojos aislados producirá un mayor número de células. El aislamiento del EPR de dos ojos producirá ~ 440,000-880,000 células, o 5% -10% de la placa de Petri de 100 mm, que puede contener 8.8 millones de células.

6. Transmisión

  1. Aspirar el medio y lavar con 2 ml de PBS. Luego aspire el PBS.
  2. Añadir 4 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (1x), o lo suficiente para cubrir la base del plato. Incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente.
  3. Agregue 8 ml de EPR precalentado o el doble del volumen de la cantidad de tripsina que se utilizó en el paso 6.2. Luego recoja las células y colóquelas en un tubo de centrífuga de 15 ml.
  4. Centrifugar a 300 x g durante 7 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de medios de cultivo celular RPE completos. Planchar toda la suspensión en una placa de Petri estéril de 100 mm.
    NOTA: Las celdas se pueden pasar hasta cuatro o cinco veces18. Sin embargo, los resultados más consistentes del experimento se encuentran después de dos o tres pasajes. Después de dos a cuatro pasajes, las células cambiaron su forma (como se muestra en la Figura 1D) para ser más alargadas, se acumularon en el centro de la placa, dejaron de crecer y se separaron.
  5. Utilizar protocolos de inmunofluorescencia, según los métodos publicados anteriormente 8,14,15,16, para teñir y validar la especificidad del EPR.

7. Inmunofluorescencia

NOTA: La inmunofluorescencia se realizó según los métodos publicados anteriormente 8,14,15,16,17,18 para teñir y validar la especificidad del EPR. La tinción de las células primarias del EPR se realizó típicamente en los pasajes P1 y P2. Aquí, se presenta una breve descripción del protocolo inmunofluorescente.

  1. Siembre las células en un portaobjetos de cámara de cultivo celular (30,000 células por pocillo para el portaobjetos de cámara de 8 pocillos).
  2. Cultivar las células en medios de cultivo celulares RPE completos a 37 °C y 5% deCO2 durante 24-48 h.
  3. Cuando las células sean 80% -90% confluentes, aspire el medio y lave el portaobjetos de la cámara con 1x PBS.
  4. Fijar el portaobjetos con paraformaldehído al 4% durante 10-15 min.
  5. Aspirar el paraformaldehído al 4% y luego bloquear con solución de bloqueo (ver Tabla de materiales).
  6. Aspirar la solución bloqueante y añadir el anticuerpo primario, RPE65, e incubar durante tres horas a 37 °C (con una concentración de anticuerpos que oscila entre 1:200-1:250 en tampón de bloqueo, a un volumen de 150-200 μL/portaobjetos). Luego, lavar tres veces con PBS/TX-100 (5-10 min cada lavado).
  7. Aspirar el anticuerpo primario y añadir el anticuerpo secundario (con una concentración de anticuerpos de 1:1.000 en tampón de bloqueo, a un volumen de 150-200 μL/portaobjetos). Incubar durante una hora a 37 °C.
  8. Aspirar el anticuerpo secundario. Lavar tres veces con PBS/Trtion X-100 (5-10 min cada lavado).
  9. Agregue una gota de medio de montaje DAPI para etiquetar los núcleos y coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos. Asegúrese de que no haya burbujas debajo del cubreobjetos.
  10. Luego, tome imágenes con un microscopio fluorescente, acompañado de una cámara de microscopio de alta resolución (HRM) y un software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales).

Resultados

Validación de la especificidad, pureza y función/formación de barrera de células aisladas del EPR
Las células aisladas se examinaron bajo un microscopio óptico para verificar su viabilidad, morfología y pigmentación. Se capturaron imágenes de P0 y P1 ( Figura 1A, B) e imágenes de P0 y P4 (Figura 1C, D) para mostrar los cambios en las células; forma, tamaño y pigmentación a medida que los pasajes avanzaban hacia e...

Discusión

El protocolo actual es un procedimiento detallado informado, modificado y simplificado para el aislamiento de RPE de los ojos del ratón. El protocolo incluye enucleación, disección, recolección, siembra, cultivo y caracterización de células RPE aisladas de ojos de ratón.

Existen algunas limitaciones y pasos críticos que deben cumplirse para un aislamiento exitoso del EPR, como la edad de los ratones, el número de ojos disecados, el tamaño de la placa o plato de cultivo de tejidos y l...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses para declarar que son relevantes para el contenido de este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Ojo (NEI), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) fondo R01 EY029751-04

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Beaker : 100mLKIMAX14000
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-AldrichC7657-25MGFor working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile13-711-20
DMEM/F12 gibco 11330Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS)gibco26140079For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solutiongibco15750-060For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Scientific88284For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 IncubatorThermo Scientific50144906
Hyaluronidase from bovine testesSigma-AldrichH3506-500MGFor working enzyme A
KimwipesKimberly-Clark34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mLB-D309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mLGrainger11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody Abcam, Cambridge, MA, USAab78036For IF staining 
Pen Strepgibco15140-122For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45Dumont72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cmGARANA INDUSTRIES2595
Sorvall St8 CentrifugeThermoScientific75007200
Stemi 305 MicroscopeZeissn/a
Surgical Blade, #11, Stainless SteelBard-Parker371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm StyleCorning430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm styleCorning353003
Tornado Tubes: 15mLMidsciC15B
Tornado Tubes: 50mLMidsciC50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25%gibco2186962For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm TipsDumont501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OALElectron Microscopy Sciences Dumont50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"McKesson4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting EdgeFST15000-08
Zeiss AxioImager Z2Zeissn/a
Zeiss Zen Blue 2.6Zeissn/a

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).

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