Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Özet

Retinal pigmentli epitel (RPE) tabakası, fotoreseptörlerin hemen arkasında yer alır ve fotoreseptörlerin işlevini sürdürmede birkaç kritik rol oynayan karmaşık bir metabolik sistemi barındırır. Bu nedenle, RPE yapısı ve işlevi normal görüşü sürdürmek için gereklidir. Bu yazıda primer fare RPE hücre izolasyonu için belirlenmiş bir protokol sunulmaktadır. RPE izolasyonu, oküler bozuklukların farklı fare modellerinde RPE patolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için harika bir araçtır. Ayrıca, RPE izolasyonu, vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş farelerden izole edilen birincil fare RPE hücrelerinin karşılaştırılmasında ve görme bozuklukları için tedavinin gelişimini hızlandırabilecek ilaçların test edilmesinde yardımcı olabilir. Makale adım adım RPE izolasyon protokolü sunmaktadır; enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm prosedür yaklaşık 4 saat sürer. İzole hücrelerin bozulmadan büyümesine izin vermek için tohumlamadan sonra 5-7 gün boyunca ortam değiştirilmemelidir. Bu süreci, immünofloresan yoluyla hücrelerdeki morfoloji, pigmentasyon ve spesifik belirteçlerin karakterizasyonu izler. Hücreler en fazla üç veya dört kez geçirilebilir.

Giriş

Retinal pigmentli epitel (RPE) hücreleri, koroid ve nöral retina arasında bulunur ve fotoreseptör (PR) hücrelerinin arkasında yatan basit bir küboidal hücre tabakası oluşturur¹. RPE, PR hücreleri için sağlıklı bir ortamın korunmasında, esas olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı birikimini ve bunun sonucunda oksidatif hasarı azaltarak kritik bir rol oynar¹. RPE hücreleri, retinoidlerin dönüşümü ve depolanması, dağınık ışığın emilimi, sıvı ve iyon taşınması ve dökülen PR dış segment membranının fagositozu ^2,3 gibi birçok işlevi denetler. RPE'deki değişiklikler (morfoloji/fonksiyon) retinopatiye yol açan fonksiyonlarını bozabilir ve bu birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan ortak bir özelliktir⁴. Birçok oküler hastalık, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amauroz ve albinizm 4,5,6 gibi bazı genetik hastalıkların yanı sıra diyabetik retinopati (DR) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi yaşa bağlı oküler bozukluklar da dahil olmak üzere RPE hücrelerinin morfolojisi ve fonksiyonundaki değişikliklerle ^{ilişkilidir7,8} . İnsan hücreleri en çok arzu edilenlerdir, bu nedenle RPE monokatmanları oluşturmak için birincil insan RPE hücrelerindeki RPE bozukluklarını incelemek ideal olacaktır. Bununla birlikte, etik konular ve bu bozuklukların çoğunun morbiditeye yol açması nedeniyle insan donörlerinin sınırlı mevcudiyeti⁹, ancak mutlaka mortalite¹⁰ değil, böylece birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonunu engellemektedir. Bu, insan olmayan hayvan donörlerinden RPE hücrelerinin kültürlenmesini tercih edilen bir alternatif haline getirir. Kemirgenler, özellikle fareler, farklı oküler hastalıkları incelemek için harika bir model olarak kabul edilir, çünkü transgenik teknoloji bu türlerde daha yaygın olarak kurulmuştur¹¹. Kültürlenmiş primer RPE hücrelerinin kullanımı birçok avantaj sunsa da, birçok pasaj için büyüyen hücreleri korumak veya hücreleri depolamak ve yeniden kullanmak zor olmuştur. Bu protokolün ana sınırlaması farelerin yaşıdır; RPE izolasyonu için kullanılan fareler çok genç yaşta olmalıdır (18-21 günlüklük en uygunudur), çünkü yetişkin farelerden RPE hücrelerini kültürlemek zor olmuştur^11,12,13. RPE hücreleri her yaşta fare gözlerinden izole edilebilir, ancak dört hücreye kadar pasaj sadece genç farelerde (18-21 günlük) başarılı olmuştur. RPE hücrelerinde N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR'lar) silinmesiyle hem C57BL6 fareleri hem de transgenik fareler kullanılarak fare retinalarından RPE izolasyonu, yüksek amino asit homosisteinin AMD^14'ün gelişimi ve ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için gerçekleştirildi. Ek olarak, izole primer RPE hücreleri, RPE hücrelerinde NMDAR'ların inhibisyonu ile AMD için terapötik bir hedef önerilmesine yardımcı oldu¹⁴. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan ve şu anda AMD¹⁴ için potansiyel bir terapötik hedef olabilecek memantin¹⁶ gibi Alzheimer hastalığına (AD) bağlı orta ila şiddetli karışıklığı (demans) tedavi etmek için kullanılan bazı NMDAR blokerleri vardır. Ayrıca, izole primer fare RPE hücreleri, enflamatuar belirteçlerin tespiti ve yüksek düzeyde homosistein^16,17 sunan genetiği değiştirilmiş bir fare (CBS) kullanılarak AMD ve ^AD'nin homosistein kaynaklı özellikleri için altta yatan bir mekanizma olarak inflamasyonun önerilen indüksiyonu için kullanılmıştır.

Bu protokol, RPE hücrelerini hem vahşi tip C57BL / 6 farelerden hem de laboratuvarımızda geliştirilen transgenik farelerden, kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir protokole ulaşmak için diğer yayınlanmış izolasyon protokollerinin ^{13,18,19'unun} basitleştirilmiş bir uyarlaması olarak izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokolde cinsiyet tercihi yoktur. Farelerin yaşları izolasyon süreci için kritik öneme sahipken, RPE izolasyonu için genç, yaşlı fareler (18-21 günlük) ve herhangi bir yaştaki (12 aya kadar) yaşlı fareler kullanılmıştır. Bununla birlikte, genç yaşlı farelerden izole edilen RPE hücrelerinin daha uzun yaşadığını ve dört pasajın gerçekleştirilebileceğini fark ettik. Yaşlı farelerden izole edilen RPE hücreleri bir veya iki kez geçirilebilir, daha sonra normal bir oranda büyümeyi durdurur ve şekillerini daha uzun olacak şekilde değiştirirler (fibroblast benzeri hücreler). Pigmentasyon kaybı ve doku kültürü plağına yapışmanın azalması ve ardından dekolmanı da gözlendi.

Protokol

Hayvanlar, Oakland Üniversitesi IACUC hayvan protokolü numarası 21063 yönergelerine ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'nın kılavuzlarına göre kullanılmıştır.

1. Çözelti hazırlama

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Besin Karışımı F-12'yi (DMEM / F12) % 25 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1.5 penisilin / streptomisin ve% 0.02 gentamisin ile destekleyerek RPE hücre kültürü ortamının tamamını hazırlayın.
2. 741 μL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) 127 μL Kollajenaz stok çözeltisi ve 132 μL Hyaluronidaz stok çözeltisi ile destekleyerek Enzim A'yı hazırlayın. Bu, dört gözü tedavi edebilen 1 mL'lik son bir hacim yapar.
   1. Kollajenaz stok çözeltisini, 41 mL HBSS'de (19.5 ünite / mL) Clostridium histolyticum'dan 1 mg Kollajenaz çözerek hazırlayın.
   2. Hyaluronidaz stok çözeltisini, sığır testislerinden 1 mg Hyaluronidaz'ı 18.4 mL HBSS'de (38 ünite / mL) çözerek hazırlayın.
3. Üç parça HBSS'ye iki parça% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyerek B Enzimini hazırlayın. Toplam hacmin disseke edilen göz sayısına bağlı olduğunu unutmayın; Dört gözü tedavi etmek için 1 mL B Enzimi kullanılabilir.

2. Enükleasyon

1. IACUC standartları^21'e göre karbondioksit (CO₂) inhalasyonunu kullanarak fareyi etik olarak ötenazi yapın.
   1. Kısaca, farelere en az sıkıntı vererek, 2 ila 3 dakika içinde bilinç kaybı sağlamak için CO 2 ile dakikada oda hacminin% 30-70'i doldurma oranıyla% 100 CO 2'yi tanıtmak için hayvanları CO ₂ odasına yerleştirin.
   2. Ölümü onaylayın (solunum eksikliği ve soluk göz rengi), ardından fareyi kafesten sterilize edilmiş cerrahi ekipmanlarla donatılmış temiz bir sterilize cerrahi alana (alkolle temizlenmiş) taşıyın.
2. Fareyi steril bir alt panelin üzerine yerleştirin.
3. Proptozu indüklemek için orbital bölgeye 5/45 tarzı cımbız basarak gözleri enüklee edin, ardından cımbızları gözün arkasına hareket ettirin. Optik sinir bozulmadan gözleri orbital boşluktan yavaşça çekerek gözleri çıkarın.
4. Forseps kullanarak, gözleri 1mL% 5 Povidon-İyot içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne batırın. Gözleri oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca inkübe edin.
5. Gözleri povidon-iyot çözeltisinden çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanarak, povidon-iyotun turuncu rengi gidene kadar gözleri HBSS ile yıkayın. Bu yaklaşık iki veya üç yıkama gerektirir.
6. Gözleri yeni bir 60 mm'lik Petri kabına yerleştirin ve adım 1.1'de hazırlanan soğuk (2-8 °C) komple RPE hücre kültürü ortamına batırın.

3. Diseksiyon

1. Cerrahi mikroskop altında, bağ dokusunu ve ekstraoküler kasları çıkarmak için M5S tarzı cımbız ve Vannas makası kullanın.
   NOT: Diseksiyon tamamen steril bir ortamda bir doku başlığı altında yapılır. Bununla birlikte, video amaçları için, diseksiyon mikroskobu, daha yüksek kalitede bir gösterim / film elde etmek için kaputun dışına yerleştirildi. Göz altına küçük bir parça tüy bırakmayan kağıt mendil yerleştirmek, diseksiyon sırasında stabiliteyi artırır. Gözler daha sonra soğuk RPE hücre kültürü ortamında geçici olarak (1 saatten fazla olmamak üzere) tutulabilir. Bununla birlikte, gözleri temizledikten hemen sonra doğrudan bir sonraki adıma geçmek tercih edilir.
2. Gözleri, her dört göz için 1 mL Enzim A çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, gözleri 40 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin.
3. Gözleri inkübatörden ve mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. Daha sonra, bunları her dört göz için 1 mL Enzim B çözeltisi içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir inkübatörde 50 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Gözleri, 10 mL tam RPE hücre büyüme ortamı içeren yeni bir 60 mm süspansiyon kültürü kabına yerleştirin. Daha sonra gözleri 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
5. Çanağı cerrahi mikroskop altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın.
6. Gözün ön kısmını (kornea, iris ve lens) vizör adaptörünün arka kısmından (posterior retina) çıkarın.
   1. Gözü M5S tarzı forseps ile kavrayın ve ora serrata bölümünde (retinanın açık mavinin bittiği en ön kısmı) #11 bıçakla veya bir şırınganın iğnesiyle bir kesi yapın.
   2. Kesinin iç kısmını bir çift forseps ile kavrayın ve korneayı başka bir çift forseps ile kavrayın. Korneayı retinadan yavaşça çekmeye veya yırtmaya başlayın. RPE'nin çoğunlukla sağlam kalmasını ve daha temiz bir yırtılma ile sonuçlanmasını sağlamak için korneayı çıkarırken küçük artışlarla yırttığınızdan ve yırtığı aşağı doğru hareket ettirdiğinizden emin olun.
      NOT: Kornea tamamen ayrıldıktan sonra, iris ve lens görülebilir.
   3. Hem korneayı hem de irisi ayırın.
7. Gözün arka yarısının hafifçe sıkıştırılmasıyla lensi vizör adaptöründen ayırın.
8. Nöral retinayı RPE katmanından çıkarmak için, vizör adaptörünün dış tabakasını bir çift cımbızla kavrayın ve ikinci bir cımbız çiftinin kolunu hem RPE hem de nöral katmanlar arasında konumlandırın. Oradan, nöral retinayı RPE katmanından yavaşça çekin veya kepçeyle alın. Nöral retinayı atın.
   NOT: Videoda, nöral retina ve lens birlikte çıkarılmıştır. Ancak, yeni başlayanlar için, her birini ayrı ayrı kaldırmak daha kolay olacaktır. Geriye kalan RPE, koroid ve skleradır.
9. Korneayı, irisi, lensi ve nöral retinayı atın. Kalan vizör adaptörünü tabakta döküntü içermeyen yeni bir alana taşıyın.
10. RPE'yi koroid ve skleradan ayırmak için, RPE hücrelerinin ayrılmasını sağlamak için vizör adaptörünün içini 5/45 tarzı cımbızla hafifçe kazıyın. RPE hücreleri, RPE hücresi büyüme ortamının tamamında askıya alındığında bulutlu görünür.
11. 3,2 mL'lik steril transfer pipeti kullanarak hücreleri aspire edin ve eksiksiz RPE hücre büyüme ortamı içeren yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.

4. Santrifüjleme

1. Birincil RPE hücrelerini içeren 15 mL santrifüj tüpünü bir santrifüjün içine yerleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
2. Süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL tam RPE büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Tam RPE büyüme ortamı, RPE büyümesi için Müller hücreleri veya koroidal endotel hücreleri gibi diğer kirletici hücrelerden daha spesifiktir. Müller hücreleri yüksek glukoz mediasına ihtiyaç duyarken, koroidal endotel hücreleri spesifik büyüme faktörleri gerektirir. Medyayı değiştirerek ve kültürü pasifleştirerek, sadece RPE hücreleri büyümeye devam edecektir.

5. Hücre kültürü

1. Yeniden askıya alınmış birincil RPE hücrelerini steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin ve bir inkübatöre aktarın ( Şekil 1E-N'de belirtildiği gibi hücreleri spesifik RPE / Müller hücre belirteçleriyle boyayarak saflığı doğruladıktan sonra). Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_{2'de inkübe edin}.
   NOT: Kullanılan işaretleyiciler Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Bu adım, kültür kurulduktan sonra gerçekleştirilir.
2. Hücreleri büyümek için yaklaşık 5 gün boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, medyayı değiştirmeyin, hücreleri rahatsız etmeyin veya hücre kültürü plakasını hareket ettirmeyin (bu protokolde kritik bir adımdır; izolasyondan sonra, hücreler inkübe edilmeli ve 5 gün boyunca rahatsız edilmemelidir).
   NOT: Hücre sayısı, izolasyon için kullanılan göz sayısına bağlıdır. İzole edilen daha fazla sayıda göz, daha fazla sayıda hücre verecektir. İki gözden RPE izolasyonu ~ 440.000-880.000 hücre veya 8.8 milyon hücreyi tutabilen 100 mm Petri kabının% 5-10'unu verecektir.

6. Pasaj

1. Ortamı aspire edin ve 2 mL PBS ile yıkayın. Sonra PBS'yi aspire edin.
2. 4 mL% 0.25 Tripsin-EDTA (1x) veya kabın tabanını örtecek kadar ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
3. 8 mL önceden ısıtılmış RPE ortamı veya adım 6.2'de ne kadar tripsin kullanıldığının hacminin iki katı ekleyin. Daha sonra hücreleri toplayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
4. Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL'lik tam RPE hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın. Tüm süspansiyonu steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Hücreler dört veya beş kez^18'e kadar geçirilebilir. Bununla birlikte, en tutarlı deney sonuçları iki veya üç pasajdan sonra bulunur. İki ila dört pasajdan sonra, hücreler şekillerini ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi) daha uzun olacak şekilde değiştirdiler, plakanın ortasında birikti, büyümeyi durdurdu ve ayrıldı.
5. RPE spesifikliğini boyamak ve doğrulamak için daha önce^yayınlanan 8,14,15,16 yöntemlerine göre immünofloresan protokollerini kullanın.

7. İmmünofloresan

NOT: İmmünofloresan, RPE spesifikliğini boyamak ve doğrulamak için daha önce^yayınlanan 8,14,15,16,17,18 yöntemlerine göre gerçekleştirilmiştir. Primer RPE hücrelerinin boyanması tipik olarak P1 ve P2 pasajlarında yapıldı. Burada, immünofloresan protokolüne kısa bir genel bakış sunulmaktadır.

1. Hücreleri bir hücre kültürü odası kaydırağındaki tohumlayın (8 delikli oda slaydı için kuyu başına 30.000 hücre).
2. Tam RPE hücre kültürü ortamındaki hücreleri 37 °C'de ve 24-48 saat boyunca% 5 CO 2'de kültürleyin.
3. Hücreler% 80 -% 90 birleştiğinde, ortamı aspire edin ve oda kızağını 1x PBS ile yıkayın.
4. Slaytı 10-15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
5. % 4'lük paraformaldehiti aspire edin ve daha sonra bloke edici çözelti ile bloke edin (bkz.
6. Bloke edici çözeltiyi aspire edin ve birincil antikoru RPE65'i ekleyin ve 37 ° C'de üç saat boyunca inkübe edin (blokaj tamponunda 1:200-1:250 arasında değişen bir antikor konsantrasyonuyla, 150-200 μL / slayt hacminde). Ardından, PBS / TX-100 ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5-10 dakika).
7. Birincil antikoru aspire edin ve ikincil antikoru ekleyin (bloke edici tamponda 1: 1.000 antikor konsantrasyonu ile, 150-200 μL / slayt hacminde). 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.
8. Sekonder antikoru aspire edin. PBS/Trtion X-100 ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5-10 dakika).
9. Çekirdekleri etiketlemek için bir damla DAPI montaj ortamı ekleyin ve kızağın üzerine bir kapak parçası yerleştirin. Kapak kapağının altında kabarcık olmadığından emin olun.
10. Ardından, yüksek çözünürlüklü mikroskop (HRM) kamera ve görüntü işleme yazılımı eşliğinde floresan mikroskopla görüntüler çekin (bkz.

Sonuçlar

İzole RPE hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun/oluşumunun doğrulanması
İzole edilen hücreler, canlılıklarını, morfolojilerini ve pigmentasyonlarını doğrulamak için bir ışık mikroskobu altında incelendi. Hücrelerdeki değişiklikleri göstermek için P0 ve P1'den görüntüler (Şekil 1A,B) ve P0 ve P4'ten görüntüler (Şekil 1C,D) yakalandı; Pasajlar dördüncü pasaja...

Tartışmalar

Geçerli protokol, fare gözlerinden RPE yalıtımı için raporlanmış, değiştirilmiş ve basitleştirilmiş ayrıntılı bir yordamdır. Protokol, fare gözlerinden izole edilen RPE hücrelerinin enükleasyonu, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir.

Başarılı RPE izolasyonu için farelerin yaşı, disseke edilen göz sayısı, doku kültürü tabağının veya kabının büyüklüğü ve tohumlama, depolama ve pasajdan sonra uyarılar gibi yer...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C7657-25MG	For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM/F12	gibco	11330	Media to grow RPE cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15750-060	For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Scientific	88284	For working enzymes (A&B)
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma-Aldrich	H3506-500MG	For working enzyme A
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab78036	For IF staining
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25%	gibco	2186962	For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a