使用拉曼染料进行高度多重组织成像

摘要

彩虹状拉曼染料的电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像是高度多重表位蛋白质成像的新平台。在这里，我们提供了一个实用指南，包括抗体制备，组织样品染色，SRS显微镜组装和epr-SRS组织成像。

摘要

可视化组织中广泛的特定生物标志物在探索复杂生物系统的复杂组织方面起着至关重要的作用。因此，高度多路复用的成像技术越来越受到赞赏。在这里，我们描述了一个新兴的平台，通过彩虹状拉曼染料的电子预共振激发拉曼散射（epr-SRS）成像，对特定蛋白质进行高度多重振动成像，其灵敏度与标准免疫荧光相当。该方法规避了传统免疫荧光中光谱可分辨通道的极限，并提供了一种一次性光学方法，以亚细胞分辨率询问组织中的多个标记物。它通常与标准组织制剂相容，包括多聚甲醛固定组织，冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人体组织。我们设想该平台将提供生物标本蛋白质相互作用的更全面图片，特别是对于厚的完整组织。该协议提供了从抗体制备到组织样品染色，再到SRS显微镜组装，再到epr-SRS组织成像的工作流程。

引言

复杂的组织系统由不同的细胞亚群组成，其空间位置和相互作用网络与其功能和功能障碍深深交织在一起^1，2。为了揭示组织结构并质疑其复杂性，了解蛋白质在单细胞分辨率下的空间位置至关重要。因此，高度多重的蛋白质成像技术越来越受到赞赏，并可能成为研究组织生物学的基石^3，4，5。目前常用的多重蛋白质成像方法可分为两大类。一种是依靠多轮组织染色和成像的连续免疫荧光成像，另一种是成像大量细胞术与重金属标记抗体^6，7，^{8，9，10，11，12}。

在这里，介绍了基于多重抗体的蛋白质成像的替代策略。与流行的荧光成像模式不同，由于激发和发射光谱宽（半最大值全宽（FWHM）~500 ^cm-1），拉曼显微镜只能同时显示4-5个通道，拉曼显微镜表现出更窄的光谱线宽（FWHM~10 ^cm-1），因此提供可扩展的多重性。最近，通过利用窄光谱，开发了一种名为电子预共振激发拉曼散射（epr-SRS）显微镜的拉曼显微镜新方案，为多路复用成像提供了强大的策略¹³。通过探测拉曼染料的电子耦合振动模式，epr-SRS在拉曼横截面上实现了^10倍的大幅增强效果，并克服了传统拉曼显微镜的灵敏度瓶颈（图1A）^13，14，15。因此，epr-SRS的检测限已被推至亚μM，这使得拉曼能够检测出有趣的分子标记物，例如细胞内的特定蛋白质和细胞器^13，16。特别是，利用拉曼染料偶联抗体，细胞和组织中特定蛋白质的epr-SRS成像（称为免疫-eprSRS）被证明具有与标准免疫荧光相当的灵敏度（图1B）^13，17。通过仅将泵浦波长调谐2 nm，epr-SRS信号将完全关闭（图1B），这显示出高振动对比度。

在探针侧，已经开发了一组称为曼哈顿拉曼散射（MARS）染料的彩虹状拉曼探针，用于抗体偶联^{13，18，19，20}。这种独特的拉曼调色板由具有π共轭三键（补充材料）的新型染料组成，每种染料在生物正交拉曼光谱范围内显示单个窄的epr-SRS峰（图1C）。通过修改核心发色团的结构并同位素编辑三键的两个原子（补充材料），已经开发了光谱分离的拉曼探针。利用可扩展的多重性，epr-SRS显微镜与MARS染料调色板相结合，为细胞和组织中的一次性多重蛋白质成像提供了一种光学策略。

Immuno-eprSRS为当前具有独特优势的多重蛋白质成像方法提供了一种替代策略。与具有循环染色、成像和信号去除功能的荧光方法相比，这种基于拉曼的平台可确保单轮染色和成像。因此，它规避了循环程序的实际复杂性，并在很大程度上简化了方案，从而开辟了多重蛋白质成像的新领域。例如，利用拉曼染料定制的组织清除方案，immuno-eprSRS已扩展到三维，用于在厚完整组织中进行高度多重的蛋白质图谱¹⁷。沿着毫米厚的小鼠脑组织观察超过10个蛋白质靶标¹⁷。最近，将免疫-eprSRS与优化的生物分子保留膨胀显微镜（ExM）方案²¹偶联，还证明了多个靶标的一次性纳米级成像²²。与成像质谱^4，9相比，epr-SRS是无损的，并且具有固有的光学切片能力。此外，epr-SRS在组织扫描上更省时。通常，对于单个epr-SRS通道，像素尺寸为0.5μm的^{0.25 mm 2} 的组织区域只需几分钟即可成像。例如， 图4 中四个SRS通道加四个荧光通道的总成像时间约为10分钟。

研究方案

该协议是根据哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案（AC-AABD1552）进行的。

1. 拉曼染料偶联抗体的制备

1. 将偶联缓冲液制备为PBS缓冲液中〜0.1M NaHCO₃ ，pH = 8.3，储存在4°C。
2. 在无水DMSO中制备N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能MARS探针（补充材料）溶液作为3mM。MARS探测器的合成可参考先前的报告^13，17，18。
   注意:出于储存目的，必须保护染料NHS酯溶液免受光照并保持在-20°C。
3. 将抗体固体溶解在偶联缓冲液中至2mg / mL的浓度。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，用离心过滤器将它们交换到偶联缓冲液中，浓度为1-2mg / mL。
   注意:高度交叉吸附的二抗是多重染色的首选，以最大限度地减少跨物种反应性。使用的二抗列于 表1 和 材料表中。
4. 进行共轭反应。
   1. 对于二抗，在搅拌下缓慢地将15倍摩尔过量的染料溶液加入玻璃瓶中的抗体溶液中。例如，在0.5 mL 2 mg / mL抗体溶液中，加入35 μL 3 mM染料溶液。
   2. 将反应混合物在室温（RT）下搅拌1小时孵育。保护反应免受光照。
5. 纯化。
   1. 按照步骤1.5.2-1.5.4在PBS缓冲液中制备凝胶过滤树脂浆料（材料表）。
   2. 将10 mL凝胶过滤树脂粉末加入50 mL管内的40 mL PBS缓冲液中。
   3. 将溶液在90°C水浴中保持1小时。
   4. 倾析上清液，重新加入PBS至40 mL。将浆料储存在4°C。
   5. 将尺寸排阻柱（直径1厘米，重力流柱）与浆液溶液一起包装至10-15厘米的高度。
   6. 用~10 mL PBS缓冲液冲洗并洗涤色谱柱，以进一步包装树脂。
   7. 将共轭反应混合物（~0.5 mL）移入色谱柱。当加载所有反应混合物时，立即加入1 mL PBS缓冲液作为洗脱缓冲液。不断将洗脱缓冲液（PBS）重新填充到色谱柱中。
   8. 通过观察色谱柱上的颜色（MARS染料具有浅绿色至蓝色）或测量280nm处的吸光度（A280）来收集共轭溶液的洗脱液。
6. 用离心过滤器将收集的溶液浓缩至1-2mg / mL。
7. 通过使用纳米板读数仪测量偶联物溶液的紫外 -可见光 （UV-Vis） 光谱来确定标记的浓度和平均程度（DOL，染料与蛋白质的比例）。
   注意: 补充材料 提供了用于计算的MARS染料NHS酯的性质。二抗的正常DOL约为3。

2. 组织样品制备

1. 多聚甲醛固定小鼠脑组织。
   1. 用异氟醚麻醉小鼠（C57BL / 6J，雌性，产后25天）。通过脚趾捏合测试评估适当的麻醉。
   2. 通过宫颈置换杀死小鼠。立即用PBS中4%多聚甲醛（PFA）透心注射小鼠。
   3. 按照步骤2.1.4-2.1.5收集小鼠大脑
   4. 从脑干沿着矢状缝合线向上切开。将头骨的两半剥开到一边，用镊子舀出大脑。
   5. 将收集的大脑固定在4°C下PBS中的4%PFA中24小时。然后，在4°C的PBS缓冲液中洗涤大脑24小时以除去多余的PFA。
   6. 将固体琼脂糖放入水中，最终浓度为7%（w / v），放入烧杯中，盖上松动的盖子。用玻璃搅拌棒搅拌溶液。在微波炉中加热浆料，直到溶液变清。
   7. 让琼脂糖冷却至45-55°C。
   8. 将液体琼脂糖倒入一个小腔室中，然后将大脑从PBS转移到液体琼脂糖中，并用刮刀将其定向以嵌入大脑。等待组织琼脂糖阻滞硬化。
   9. 使用振动切片机将组织 - agrose切片成40μm厚的冠状切片。
   10. 将组织转移到4孔板上进行以下染色。用镊子去除琼脂糖。用1毫升PBS洗涤组织，三次。
2. 固定冷冻小鼠胰腺组织。
   1. 在4°C下将小鼠胰腺固定在PBS中的4%PFA中，摇摆16-20小时。
   2. 将样品在1mL PBS（4°C）中洗涤三次以除去PFA。
   3. 将样品（尺寸约0.3-0.5厘米）嵌入最佳切割温度（OCT）化合物块中。将2滴OCT放入塑料冷冻室中。将组织以正确的方向放置，并将OCT倒在组织上，直到没有一个组织保持暴露状态。
   4. 将胰腺切片至8μm厚的切片，并将其固定在组织结合载玻片上，将其储存在-80°C中。
   5. 染色前，将标本平衡至室温，用PBS清洗组织以除去OCT阻滞。
3. FFPE 示例。
   1. 将FFPE组织载玻片在60°C下烘烤10分钟。
   2. 脱蜡和补液:将样品按顺序置于以下溶液中，置于50mL试管中，室温静，每次3分钟，轻轻摇动:
      二甲苯两次，
      乙醇两次，
      95%（体积/体积）乙醇在去离子水中两次，
      70%（体积/体积）乙醇在去离子水中两次，
      50%（体积/体积）乙醇在去离子水中一次，
      去离子水一次。
   3. 将样品转移到玻璃罐中100°C的20mM柠檬酸钠（pH 8.0）中。确保组织浸入溶液中。
   4. 将罐子放入60°C水浴中45分钟。
   5. 用室温下去离子水洗涤样品5分钟。

3. 组织免疫免疫-eprSRS染色

1. 使用疏水笔在载玻片上的组织部分周围绘制边界。
   注意:载玻片染色罐用于跟踪载玻片上组织的孵育步骤。漂浮组织（40μm厚的小鼠脑切片）在孔板中染色。
2. 用0.3-0.5%PBST（PBS中的Triton X-100）孵育组织10分钟。
3. 用封闭缓冲液（5%驴血清，0.5%Triton X-100在PBS中）孵育组织30分钟。
4. 制备初级染色溶液:将所有一抗以所需浓度加入200-500μL染色缓冲液（2%驴血清，0.5%Triton X-100 in PBS）中。将初级染色溶液以13，000× g 离心5分钟。仅当沉淀形成时才使用上清液。
5. 将组织在4°C的一抗溶液中孵育1-2天。
   注意:要在载玻片上染色组织切片，请将样品放入带有湿擦拭布的染色盒中以保持湿度。
6. 用0.3-0.5%PBST在室温下洗涤载玻片三次，每次5分钟。对漂浮组织使用1毫升PBST。对于载玻片上的组织，在载玻片染色罐中洗涤载玻片，并确保组织全部浸入溶液中。
7. 将组织在200-500μL封闭缓冲液中孵育30分钟。
8. 制备二级染色溶液:将所有二抗（如果需要，还有凝集素）加入200-500μL具有所需浓度（通常为10μg/ mL）的染色缓冲液中。将二次染色溶液以13，000× g 离心5分钟。仅当沉淀形成时才使用上清液。
9. 将组织在4°C的200-500μL二抗溶液中孵育1-2天。
10. 在室温下用0.3-0.5%PBST洗涤载玻片两次，每次5分钟。
11. 与200-500μLDAPI溶液孵育30分钟。
12. 用PBS在室温下洗涤载玻片三次，每次5分钟。
13. 对于漂浮的组织切片，用玻璃滴管将它们转移到载玻片上。用纸巾刷铺开纸巾，并在需要时用湿巾清洁周围。
14. 用玻璃盖玻片将组织安装在一滴抗淬灭试剂中，并用指甲油固定。

4. SRS显微镜组件

注:商用共聚焦荧光系统用于串联SRS荧光成像。更多描述可以在以前的报告中找到¹⁷.该协议将专注于使用窄带激励的SRS成像侧。

1. 在具有温度控制的房间里准备一个隔振光学工作台。
2. 将同步的双激光系统（泵浦和斯托克斯）放在光学工作台上（图2A），并连接冷却器。
   注意:双激光器系统中的基本激光器在1064 nm处提供输出脉冲序列，脉冲宽度为6 ps，重复频率为80 MHz。斯托克斯光束来自基波激光。斯托克斯光束的强度由内置的电光幅度调制器（EOM）以8 MHz正弦调制，调制深度超过90%。基波激光器的另一部分将频率加倍至 532 nm ，这进一步用于同步播种皮秒光学参数振荡器（ OPO ），以产生脉冲宽度为 5 - 6 ps 的锁模脉冲序列（ OPO 的惰性光束涉滤波片阻挡）。OPO的输出波长可在720-950 nm范围内调谐，用作泵浦光束。
3. 将反射镜（波长范围:750-1100 nm）、二向色分束器（DBS，980 nm 长通滤光片，矩形）和透镜（消色差，650-1050 nm 的 AR 镀膜）安装到各自的安装座上。为镜子和二向色分束器使用非常稳定的运动镜架。
4. 测量激光输出的高度以及泵浦和斯托克斯光束的光束尺寸。调整镜子和透镜的高度，以确保光线照射到所有光学元件的中心。
5. 将反射镜M1放在光学工作台上，使其与激光输出约45°（图2B）。使用运动学安装座上的旋钮进行倾斜和倾斜调整。确保光线沿桌子的长度和相对于桌子的直线以相同的高度传播。
6. 放置并对齐二向色分束器（980 nm长通滤光片）和反射镜以分割泵和斯托克斯光束（图2A-B）。
7. 在每个光束路径上放置并对齐透镜对（L1，L2和L3，L4），以准直光束并扩大光束直径以匹配物镜的后瞳孔（图2A-B）。
8. 使用M7和M8反射镜将组合的激光束对准显微镜（图2C）。首先将一束光束对准显微镜，并在另一束上使用镜子对，以确保两束光束的空间重叠。
9. 设置检测部件。
   1. 戴上红外涂层的油冷凝器（1.4-NA），以在通过试样后收集前进泵和斯托克斯光束（图2C）。
   2. 将大面积硅光电二极管安装到带有BNC连接器的屏蔽盒上（图2E）。向安装的光电二极管添加一个64 V DC电源，以提高其饱和阈值和响应带宽。
   3. 用2英寸的镜子反射前进的光线。在光学滤光片后将光重新聚焦到光电二极管上，以阻挡调制斯托克斯光束（图2D）。
   4. 将光电二极管的输出电流发送到以50端接的快速锁相放大器，以进行信号解调。将一个8 MHz触发器作为参考信号发送到锁相放大器。
   5. 将锁相放大器的相位X分量送入显微镜的模拟接口盒中。
10. 通过在显微镜下测量纯D₂O液体的SRS信号，优化与内置电动延迟级的时间重叠。

5. 图像采集和分析

1. 通过顺序泵浦波长调谐执行多通道 epr-SRS 成像。
   1. 在激光控制面板上将激光功率设置为 P_泵浦 = 10-40 mW， P_斯托克斯 = 40-80 mW。
   2. 将像素停留时间设置为2-4 μs，并在显微镜软件上使用多帧，平均10-20帧。
      注意:避免组合使用高激光功率（P_泵浦>40 mW， P_Stokes>80 mW）和小像素尺寸（<0.2 μm），这可能导致拉曼染料的"漂白效应"，因为多光子激发。
   3. 将锁相放大器的时间常数设置为像素停留时间的一半。
2. 线性频谱解混。
   注意:epr-SRS在整个浓度范围内遵循严格的线性信致浓度依赖性;因此，线性频谱解混可以有效地消除通道之间的任何潜在串扰。对于使用N个MARS探针进行N沟道epr-SRS测量，测量信号（S）可以表示为S = MC，其中C是MARS探针浓度，M是由MARS探针的拉曼横截面确定的N x N矩阵。
   1. 在用不同MARS探针标记的单色免疫eprSRS样品上测量基质 M 。
   2. 使用等式 C = M−1·S 用多重样品信号测量 S来确定MARS探针的浓度矩阵。

结果

图3显示了不同样品中epr-SRS的示例图像，包括固定细胞（图3A），多聚甲醛（PFA）固定小鼠组织（图3B）和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人类标本（图3C）。SRS显微镜的空间分辨率受衍射限制，典型的横向分辨率约为300 nm，使用近红外光进行激发的轴向分辨率为1-2 μm。结果，通过α微管蛋白的免疫eprSRS成像，?...

讨论

在这里，我们提出了免疫-eprSRS方案，该方案广泛适用于常见的组织类型，包括新鲜保存的小鼠组织，FFPE人体组织和冷冻小鼠组织。免疫-eprSRS已经验证了细胞和组织中的一组表位，如 表1所示。这种一次性平台特别适用于循环策略不能很好地运行的应用程序。例如，循环荧光对厚组织的要求很高，因为多轮3D免疫标记是不切实际的冗长¹⁷。由于非线性3D组织学变化

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
α-tubulin	Abcam	ab18251	Primary antibodies
α-tubulin	BioLegend	625902	Primary antibodies
β-III-tubulin	BioLegend	657402	Primary antibodies
β-III-tubulin	Abcam	ab41489	Primary antibodies
β-tubulin	Abcam	ab131205	Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature	Sigma Aldrich	A9414	For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin)	Abcam	ab52866	Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2  antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primary antibodies
Anti-Glucagon  antibody produced in mouse (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)	DAKO	IR00261-2	Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)	Abcam	ab7349	Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)	Abcam	ab24525	Primary antibodies
Band-pass filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Centrifuge
Condenser	Olympus		oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primary antibodies
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primary antibodies
DC power supply	TopWard	6302D	Bias voltage is 64 V
Dichroic mount	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primary antibodies
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-speed look-in amplifier	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primary antibodies
Giantin	Abcam	ab24586	Primary antibodies
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
H2B	Abcam	ab1790	Primary antibodies
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primary antibodies
Integrated SRS laser system	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope	Olympus	FV1200MPE
Kinematic mirror mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2	BioLegend	801810	Primary antibodies
Microscopy imaging software	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objective lens	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly	Thorlabs	RS99	includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader	Tecan	Infinite 200 PRO	An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primary antibodies
Xylenes	Sigma Aldrich	214736