Высокомультиплексная визуализация тканей с помощью рамановых красителей

Электронная предрезонансная стимуляция рамановского рассеяния (epr-SRS) радужных рамановских красителей является новой платформой для высокомаплексированной эпитопной визуализации белков. Здесь мы представляем практическое руководство, включающее подготовку антител, окрашивание образцов тканей, сборку микроскопа SRS и визуализацию тканей epr-SRS.

Аннотация

Визуализация обширного спектра специфических биомаркеров в тканях играет жизненно важную роль в изучении сложных организаций сложных биологических систем. Следовательно, технологии визуализации с высокой степенью мультиплексирования получают все большую оценку. Здесь мы описываем новую платформу высокомультиплексированной вибрационной визуализации специфических белков с сопоставимой чувствительностью со стандартной иммунофлуоресценцией с помощью электронной предрезонансной стимулированной рамановской рассеяния (epr-SRS) визуализации радужных рамановских красителей. Этот метод обходит предел спектрально-рассасываемых каналов в обычной иммунофлуоресценции и обеспечивает однократный оптический подход для опроса нескольких маркеров в тканях с субклеточным разрешением. Как правило, он совместим со стандартными тканевыми препаратами, включая параформальдегид-фиксированные ткани, замороженные ткани и формалин-фиксированные парафиновые (FFPE) ткани человека. Мы предполагаем, что эта платформа обеспечит более полную картину белковых взаимодействий биологических образцов, особенно для толстых интактных тканей. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс от подготовки антител до окрашивания образца ткани, сборки микроскопа SRS и визуализации тканей epr-SRS.

Введение

Сложные тканевые системы состоят из различных клеточных субпопуляций, пространственные расположения и сети взаимодействия которых глубоко переплетены с их функциями и дисфункциями ^1,2. Чтобы выявить архитектуру ткани и исследовать ее сложность, знание пространственных расположений белков при одноклеточном разрешении имеет важное значение. Следовательно, высоко мультиплексированные технологии визуализации белка получают все большую оценку и могут стать краеугольным камнем для изучения биологии ^тканей ^3,4,5. Современные распространенные методы визуализации мультиплексированного белка можно разделить на две основные категории. Одним из них является серийная иммунофлуоресцентная визуализация, основанная на нескольких раундах окрашивания и визуализации тканей, а другая - визуализация массовой цитометрии в сочетании с антителами с метками тяжелых металлов ^{6,7,8,9,10,11,12}.

Здесь представлена альтернативная стратегия визуализации белка на основе мультиплексированных антител. В отличие от распространенной модальности флуоресцентной визуализации, которая может визуализировать только 4-5 каналов одновременно из-за широкого спектра возбуждения и излучения (полная ширина при половинном максимуме (FWHM) ~ 500 ^см-1), рамановская микроскопия демонстрирует гораздо более узкую спектральную ширину линии (FWHM ~ 10 ^см-1) и, следовательно, обеспечивает масштабируемую мультиплексию. Недавно, используя узкий спектр, была разработана новая схема рамановской микроскопии, названная электронной предрезонансной стимулированной рамановской микроскопией (epr-SRS), обеспечивающая мощную стратегию для мультиплексированной визуализации¹³. Исследуя вибрационные режимы с электронной связью рамановских красителей, epr-SRS достигает резкого эффекта усиления в 10¹³ раз на рамановских поперечных сечениях и преодолевает узкое место чувствительности обычной рамановской микроскопии (рисунок 1A)13,14,15. В результате предел обнаружения epr-SRS был увеличен до суб-мкМ, что позволяет рамановскому обнаружению интересных молекулярных маркеров, таких как специфические белки и органеллы внутри клеток^13,16. В частности, с использованием рамановских красителеконъюгированных антител была продемонстрирована эпр-SRS-визуализация специфических белков в клетках и тканях (называемая иммуно-эпр-СРСРС) с сопоставимой чувствительностью со стандартной иммунофлуоресценцией (рисунок 1B)^13,17. Настроив длину волны насоса всего на 2 нм, сигнал epr-SRS будет полностью отключен (рисунок 1B), что демонстрирует высокий вибрационный контраст.

На стороне зонда был разработан набор радужных рамановских зондов, называемых красителями Манхэттенского рамановского рассеяния (MARS), для конъюгации антител 13,18,19,20. Эта уникальная рамановская палитра состоит из новых красителей, несущих π-сопряженные тройные связи (дополнительный материал), каждый из которых отображает один и узкий пик epr-SRS в биоортогональном спектральном диапазоне рамановского диапазона (рисунок 1C). Путем модификации структуры основного хромофора и изотопного редактирования обоих атомов тройной связи (дополнительного материала) были разработаны спектрально разделенные рамановские зонды. Используя масштабируемую мультиплексность, микроскопия epr-SRS в сочетании с палитрой красителей MARS предлагает оптическую стратегию для однократной мультиплексной визуализации белка в клетках и тканях.

Immuno-eprSRS обеспечивает альтернативную стратегию современным методам мультиплексной визуализации белка с уникальными сильными сторонами. По сравнению с флуоресцентными подходами с циклическим окрашиванием, визуализацией и удалением сигнала, эта платформа на основе комбинационного рассеяния обеспечивает однокруглое окрашивание и визуализацию. Таким образом, он обходит практическую сложность в циклических процедурах и в значительной степени упрощает протокол, тем самым открывая новые области мультиплексированной белковой визуализации. Например, используя протокол очистки тканей, адаптированный к рамановскому красителю, иммуно-eprSRS был расширен до трех измерений для картирования сильно мультиплексированного белка в толстых интактных тканях¹⁷. Более 10 белковых мишеней были визуализированы вдоль миллиметровых тканей мозга мыши¹⁷. Совсем недавно было продемонстрировано соединение иммуно-eprSRS с оптимизированной расширительной микроскопией с биомолекулами (ExM) по протоколу²¹, однокадровая наноразмерная визуализация нескольких мишеней²². По сравнению с визуализационной масс-спектроскопией ^4,9, epr-SRS является неразрушающим и обладает внутренне оптической способностью к сечению. Кроме того, epr-SRS более экономит время при сканировании тканей. Как правило, область ткани 0,25^мм2 с размером пикселя 0,5 мкм занимает всего несколько минут для изображения одного канала epr-SRS. Например, общее время визуализации четырех каналов SRS плюс четыре флуоресцентных канала на рисунке 4 составляет около 10 мин.

протокол

Протокол был проведен в соответствии с протоколом экспериментов на животных (AC-AABD1552), одобренным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Колумбийском университете.

1. Получение раман-краситель-конъюгированных антител

Подготовьте буфер сопряжения как ~0,1 M NaHCO₃ в буфере PBS, pH = 8,3, хранить при 4 °C.
Готовят N-гидроксисукцинимидию (NHS) эфирно-функционирующий раствор зонда MARS (дополнительный материал) в виде 3 мМ в безводном ДМСО. Синтез зондов MARS можно отнести к предыдущим отчетам 13,17,18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей хранения раствор эфира красителя NHS должен быть защищен от света и храниться при температуре -20 °C.
Растворяют твердые антитела в буфере конъюгации до концентрации 2 мг/мл. Для антител, которые растворяются в других буферах, обменивают их в буфер конъюгации до концентрации 1-2 мг/мл с центробежными фильтрами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мультиплексного окрашивания предпочтительны вторичные антитела с высокой степенью перекрестной адсорбции, чтобы свести к минимуму межвидовую реактивность. Используемые вторичные антитела перечислены в Таблице 1 и Таблице материалов.
Выполните реакцию сопряжения.
1. Для вторичных антител добавляют 15-кратный молярный избыток раствора красителя к раствору антител в стеклянном флаконе медленно при перемешивании. Например, в 0,5 мл 2 мг/мл раствора антител добавляют 35 мкл 3 мМ раствора красителя.
2. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре (РТ) с перемешиванием в течение 1 ч. Защитите реакцию от света.
Очистка.
1. Подготовьте суспензию из гелевой фильтрационной смолы (Таблица материалов) в буфере PBS, следуя шагам 1.5.2-1.5.4.
2. Добавьте 10 мл порошка гелевой фильтрационной смолы в 40 мл буфера PBS внутри 50-мл пробирки.
3. Держите раствор на водяной бане при температуре 90 °C в течение 1 ч.
4. Декантируйте супернатант и повторно добавляйте PBS до 40 мл. Хранить навозную жижу при температуре 4 °C.
5. Упакуйте столбик исключения размеров (диаметр 1 см, самотечные колонны) раствором навозной жижи высотой 10-15 см.
6. Промыть и промыть колонну ~10 мл буфера PBS для дальнейшей упаковки смолы.
7. Пипетка реакционной смеси сопряжения (~0,5 мл) в колонну. Немедленно добавьте 1 мл буфера PBS в качестве буфера элюирования, когда вся реакционная смесь загружена. Постоянно пополняйте буфер элюирования (PBS) в столбец.
8. Соберите элюат сопряженного раствора, посмотрев на цвет на колонке (красители MARS имеют светло-зеленый до синего цвета) или измерив поглощение при 280 нм (A280).
Концентрировать собранный раствор до 1-2 мг/мл с помощью центробежного фильтра.
Определение концентрации и средней степени маркировки (DOL, отношение красителя к белку) путем измерения ультрафиолетово-видимого (UV-Vis) спектра сопряженного раствора с помощью считывателя нанопластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный материал обеспечивает свойства MARS-красителя NHS-эфиров для расчета. Нормальный DOL для вторичного антитела составляет около 3.

2. Пробоподготовка тканей

Параформальдегид фиксируется тканями мозга мыши.
1. Обезболивают мышей (C57BL/6J, самка, 25 d после родов) изофлураном. Оцените правильную анестезию с помощью теста на щипки пальца ноги.
2. Убивайте мышей путем смещения шейки матки. Перфицитируйте мышей сразу же с 4% параформальдегидом (PFA) в PBS транскардиально.
3. Соберите мозг мыши, выполнив шаги 2.1.4-2.1.5
4. Вырежьте вверх от ствола мозга вдоль сагиттального шва. Отойдите две половинки черепа в сторону и вычерпните мозг пинцетом.
5. Зафиксируйте собранный мозг в 4% PFA в PBS при 4 °C в течение 24 ч. Затем промыть мозг в буфере PBS при 4 °C в течение 24 ч, чтобы удалить избыток PFA.
6. Поместите твердую агарозу в воду до конечной концентрации 7% (мас./об.) в стакан со рыхлой крышкой. Размешайте раствор стеклянным перемешивающим стержнем. Нагрейте суспензию в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
7. Дайте агарозе остыть до 45-55 °C.
8. Налейте жидкую агарозу в небольшую камеру, затем переведите мозг из PBS в жидкую агарозу и сориентируйте его шпателем, чтобы встроить мозг. Подождите, пока ткань-агарозный блок затвердеет.
9. Разделите ткань-агрозу на корональные срезы толщиной 40 мкм с помощью вибратома.
10. Переложите ткань на 4-луночную пластину для последующего окрашивания. Удалите агарозу пинцетом. Промыть ткань 1 мл PBS, три раза.
Исправлены замороженные ткани поджелудочной железы мыши.
1. Фиксируют поджелудочную железу мыши в 4% PFA в PBS при 4 °C с раскачиванием в течение 16-20 ч.
2. Промыть образец в 1 мл PBS (4 °C) три раза, чтобы удалить PFA.
3. Вставьте образец (размером ~0,3-0,5 см) в компаундные блоки с оптимальной температурой резания (OCT). Поместите 2 капли OCT в пластиковый криомольд. Поместите ткань в правильную ориентацию и вылейте ОКТ поверх тканей, пока ни одна из тканей не останется открытой.
4. Разделите поджелудочную железу до ломтиков толщиной 8 мкм и обездвижите их на тканевую связывающую стеклянную горку, храните их при -80 °C.
5. Перед окрашиванием уравновешивайте образец до RT. Вымойте ткань PBS, чтобы удалить блоки OCT.
Образцы FFPE.
1. Выпекайте тканевый слайд FFPE при 60 °C в течение 10 мин.
2. Депарафинизация и регидратация: Поместите образцы последовательно в следующие растворы в пробирку 50 мл на RT в течение 3 мин каждый раз с легким встряхиванием:
  ксилол два раза,
  этанол в два раза,
  95% (об/об)этанола в деионизированной воде два раза,
  70% (об/об)этанола в деионизированной воде два раза,
  50% (об/об)этанола в деионизированной воде один раз,
  деионизированная вода один раз.
3. Переведите образец в 20 мМ цитрата натрия (рН 8,0) при 100 °C в стеклянной банке. Убедитесь, что ткани погружены в раствор.
4. Поставьте банку на водяную баню при температуре 60 °C на 45 минут.
5. Промыть образец деионизированной водой на RT в течение 5 мин.

3. Окрашивание тканей иммуно-ЭпрСРС

Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг участков ткани на слайде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Банка для окрашивания слайдов используется для выполнения этапов инкубации ткани на слайде. Плавающие ткани (участки мозга мыши толщиной 40 мкм) окрашиваются в пластины колодца.
Инкубируют ткани с 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 в PBS) в течение 10 мин.
Инкубируют ткани блокирующим буфером (5% ослиная сыворотка, 0,5% Тритон Х-100 в PBS) в течение 30 мин.
Готовят первичный окрашивающий раствор: добавляют все первичные антитела к 200-500 мкл окрашивающего буфера (2% ослиная сыворотка, 0,5% Тритон Х-100 в PBS) при желаемых концентрациях. Центрифугировать первичный окрашивающий раствор при 13 000 х г в течение 5 мин. Используйте супернатант только в том случае, если образуется осадок.
Инкубируют ткань в растворе первичного антитела при 4 °С в течение 1-2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания участков ткани на слайде поместите образец в ящик для окрашивания с влажной салфеткой для поддержания влажности.
Промыть слайды три раза с 0,3-0,5% PBST на RT в течение 5 мин каждая. Используйте 1 мл PBST для плавающих тканей. Для тканей на слайде вымойте слайды в банке для окрашивания слайдов и убедитесь, что все ткани погружены в раствор.
Инкубируют ткань в 200-500 мкл блокирующего буфера в течение 30 мин.
Приготовьте раствор для вторичного окрашивания: добавьте все вторичные антитела (и лектины, если это необходимо) к 200-500 мкл буфера окрашивания с желаемыми концентрациями (обычно 10 мкг/мл). Центрифугируйте раствор вторичного окрашивания при 13 000 х г в течение 5 мин. Используйте супернатант только в том случае, если образуется осадок.
Инкубируют ткани в 200-500 мкл раствора вторичных антител при 4 °С в течение 1-2 дней.
Промыть слайды дважды с 0,3-0,5% PBST на RT в течение 5 мин каждая.
Инкубировать с 200-500 мкл раствора DAPI в течение 30 мин.
Трижды мойте слайды PBS на RT в течение 5 минут каждый.
Для плавающих участков тканей переложите их на стеклянные горки с помощью пипетки, опускающей стекло. Выложите ткань тканевой щеткой и при необходимости очистите окружающую среду салфетками.
Установите ткань в каплю антизатухающих реагентов стеклянным чехлом и закрепите ее лаком для ногтей.

4. Сборка микроскопа SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая конфокальная флуоресцентная система используется в тандемной SRS-флуоресцентной визуализации. Более подробные описания можно найти в предыдущем докладе¹⁷. Этот протокол будет сосредоточен на стороне визуализации SRS с использованием узкополосного возбуждения.

Подготовьте вибрационно-изолированный оптический стол в помещении с контролем температуры.
Поместите синхронизированную двойную лазерную систему (насос и стокс) на оптический стол (рисунок 2А) с подключенным чиллером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основной лазер в двухлазерной системе обеспечивает передачу выходных импульсов на 1064 нм с шириной импульса 6 пс и частотой повторения 80 МГц. Луч Стокса исходит от фундаментального лазера. Интенсивность пучка Стокса модулировалась синусоидально встроенным электрооптическим амплитудным модулятором (ЭОМ) на частоте 8 МГц с глубиной модуляции более 90%. Другая часть фундаментального лазера удваивается по частоте до 532 нм, что дополнительно используется для синхронного засева пикосекундного оптического параметрического генератора (OPO) для получения импульсной цепи с блокировкой моды с шириной импульса 5-6 пс (луч холостого хода OPO блокируется интерферометрическим фильтром). Выходная длина волны OPO настраивается от 720-950 нм, которая служит пучком насоса.
Установите зеркала (диапазон длин волн: 750-1100 нм), дихроичные разветвители луча (DBS, 980 нм длинночастотный фильтр, прямоугольный) и объектив (ахроматический, AR-покрытие для 650-1050 нм) на соответствующие крепления. Используйте очень стабильные кинематичные зеркальные крепления для зеркал и дихроичных светоделителей.
Измерьте высоту лазерного излучения и размеры пучка накачки и лучей Стокса. Отрегулируйте высоту зеркал и линз, чтобы свет попадал в центр всех оптических элементов.
Поместите зеркало M1 на оптический стол и сделайте его ~45° к лазерному выходу (рисунок 2B). Используйте ручки на кинематическом креплении для регулировки наконечника и наклона. Убедитесь, что свет движется на той же высоте по длине стола и по прямой линии по отношению к столу.
Поместите и выровняйте дихроичные светоделители (фильтры длинных частот 980 нм) и зеркала для разделения насоса и лучей Стокса (рисунок 2A-B).
Поместите и выровняйте пары линз (L1, L2 и L3, L4) на каждом из путей луча, чтобы коллимировать лучи и расширить диаметры луча в соответствии с задним зрачком объектива (рисунок 2A-B).
Используйте зеркала M7 и M8 для выравнивания комбинированных лазерных лучей в микроскоп (рисунок 2C). Сначала выровняйте один луч в микроскоп и используйте зеркальные пары на другом луче, чтобы обеспечить пространственное перекрытие двух лучей.
Настройте часть обнаружения.
1. Наденьте масляный конденсатор с инфракрасным покрытием (1,4 NA) для сбора поступательного насоса и пучков Стокса после прохождения через образцы (рисунок 2C).
2. Установите фотодиод Si большой площади на экранированную коробку с разъемами BNC (рисунок 2E). Добавьте блок питания постоянного тока 64 В к установленному фотодиоду, чтобы увеличить его порог насыщения и пропускную способность отклика.
3. Отражайте передний свет с помощью 2-дюймового зеркала. Перефокусируйте свет на фотодиод после оптического фильтра, чтобы заблокировать модулирующий луч Стокса (рисунок 2D).
4. Отправьте выходной ток фотодиода на быстрый блокирующий усилитель, заканчивающийся на 50 для демодуляции сигнала. Отправьте триггер 8 МГц на усилитель блокировки в качестве опорного сигнала.
5. Отправьте фазный X-компонент запирающего усилителя в аналоговую интерфейсную коробку микроскопа.
Оптимизируйте временное перекрытие со встроенной моторизованной ступенью задержки, измерив сигнал SRS чистой жидкости D₂O в микроскопе.

5. Получение и анализ изображений

Выполняйте многоканальную визуализацию epr-SRS с последовательной настройкой длины волны насоса.
1. Установите мощность лазера на P_pump = 10-40 мВт и P_Stokes = 40-80 мВт на лазерной панели управления.
2. Установите время ожидания пикселя равным 2-4 мкс и используйте несколько кадров в среднем 10-20 кадров в программном обеспечении для микроскопии.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте комбинаторного использования высокой мощности лазера (P_pump> 40 мВт, P_Stokes> 80 мВт) и малого размера пикселя (<0,2 мкм), которые, вероятно, вызывают «отбеливающий эффект» рамановских красителей из-за многофотонного возбуждения.
3. Установите для констант времени блокирующего усилителя половину времени ожидания пикселя.
Линейное спектральное размешивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: epr-SRS следует строгой линейной зависимости сигнал-концентрация во всем диапазоне концентраций; таким образом, линейное спектральное размешивание эффективно для устранения любых потенциальных перекрестных помех между каналами. Для измерения N-канала epr-SRS с помощью зондов N MARS измеренные сигналы (S) могут быть выражены как S = MC, где C - концентрации зонда MARS, а M - матрица N x N , определяемая рамановскими поперечными сечениями зондов MARS.
1. Измерьте матрицу M на одноцветных образцах иммуно-eprSRS, маркированных различными зондами MARS.
2. Использовать уравнение C = M−1· S для определения матрицы концентрации зонда MARS с мультиплексным измерением сигнала образца S.

Результаты

На рисунке 3 показаны примеры изображений epr-SRS в различных образцах, включая фиксированные клетки (рисунок 3A), параформальдегидные (PFA) фиксированные ткани мыши (рисунок 3B) и образцы человека с фиксированным парафином (FFPE). ?...

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол иммуно-eprSRS, который широко применим к распространенным типам тканей, включая свежесохраненные ткани мыши, ткани человека FFPE и замороженные ткани мыши. Иммуно-eprSRS был валидирован для группы эпитопов в клетках и тканях, как указано в таблице 1. Эта ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Рут А. Сингер и Ричарда К.П. Беннингера за предоставление тканей поджелудочной железы мыши. W.M. признает поддержку со стороны NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) и армии США (W911NF-19-1-0214).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
α-tubulin	Abcam	ab18251	Primary antibodies
α-tubulin	BioLegend	625902	Primary antibodies
β-III-tubulin	BioLegend	657402	Primary antibodies
β-III-tubulin	Abcam	ab41489	Primary antibodies
β-tubulin	Abcam	ab131205	Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature	Sigma Aldrich	A9414	For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin)	Abcam	ab52866	Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primary antibodies
Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)	DAKO	IR00261-2	Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)	Abcam	ab7349	Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)	Abcam	ab24525	Primary antibodies
Band-pass filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Centrifuge
Condenser	Olympus		oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primary antibodies
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primary antibodies
DC power supply	TopWard	6302D	Bias voltage is 64 V
Dichroic mount	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primary antibodies
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-speed look-in amplifier	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primary antibodies
Giantin	Abcam	ab24586	Primary antibodies
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
H2B	Abcam	ab1790	Primary antibodies
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primary antibodies
Integrated SRS laser system	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope	Olympus	FV1200MPE
Kinematic mirror mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2	BioLegend	801810	Primary antibodies
Microscopy imaging software	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objective lens	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly	Thorlabs	RS99	includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader	Tecan	Infinite 200 PRO	An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primary antibodies
Xylenes	Sigma Aldrich	214736