הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

Summary

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

Abstract

הדמיה של היקף עצום של סמנים ביולוגיים ספציפיים ברקמות ממלאת תפקיד חיוני בחקר הארגונים המורכבים של מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, טכנולוגיות הדמיה מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מתפתחת של הדמיה ויברציונית מרובבת מאוד של חלבונים ספציפיים עם רגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית באמצעות הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) אלקטרונית המעוררת בתהודה מוקדמת של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן. שיטה זו עוקפת את הגבול של תעלות הניתנות לפתרון ספקטרלי באימונופלואורסצנציה קונבנציונלית ומספקת גישה אופטית של ירייה אחת כדי לחקור סמנים מרובים ברקמות עם רזולוציה תת-תאית. הוא תואם בדרך כלל לתכשירי רקמות סטנדרטיים, כולל רקמות קבועות פרפורמלדהיד, רקמות קפואות ורקמות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). אנו צופים שפלטפורמה זו תספק תמונה מקיפה יותר של אינטראקציות חלבונים של דגימות ביולוגיות, במיוחד עבור רקמות שלמות ועבות. פרוטוקול זה מספק את זרימת העבודה מהכנת נוגדנים להכתמת דגימת רקמות, להרכבת מיקרוסקופ SRS, להדמיית רקמות epr-SRS.

Introduction

מערכות רקמות מורכבות מורכבות מתת-אוכלוסיות תאיות נפרדות שמיקומיהן המרחביים ורשתות האינטראקציה שלהן שזורים עמוק בתפקודים ובתפקוד לקוי שלהן ^1,2. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה ולחקור את המורכבות שלה, ידע על המיקומים המרחביים של חלבונים ברזולוציה של תא יחיד הוא חיוני. לפיכך, טכנולוגיות הדמיית חלבונים מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת ויכולות להפוך לאבן פינה לחקר הביולוגיה של הרקמות ^3,4,5. ניתן לסווג את שיטות ההדמיה הנפוצות הנוכחיות של חלבונים מרובבים לשתי קטגוריות עיקריות. האחת היא הדמיה אימונופלואורסצנטית סדרתית המסתמכת על סבבים מרובים של צביעת רקמות והדמיה, והשנייה היא הדמיית ציטומטריה המונית בשילוב עם נוגדנים מתויגים במתכת כבדה 6,7,8,9,10,11,12.

כאן מוצגת אסטרטגיה חלופית להדמיית חלבונים מבוססי נוגדנים מרובבים. בניגוד לשיטת ההדמיה הפלואורסצנטית הנפוצה, שיכולה לדמיין רק 4-5 ערוצים בו זמנית בשל ספקטרום העירור והפליטה הרחב (רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) ~ 500 ס"^מ-1), מיקרוסקופיית ראמאן מציגה קו ספקטרלי צר בהרבה (FWHM ~ 10 ^cm-1) ולכן מספקת ריבוי מדרגי. לאחרונה, על ידי רתימת הספקטרום הצר, פותחה תוכנית חדשנית של מיקרוסקופיית ראמאן בשם מיקרוסקופיית קדם-תהודה אלקטרונית מגורה פיזור ראמאן (epr-SRS), המספקת אסטרטגיה רבת עוצמה להדמיה מרובבת¹³. על-ידי חקירת מצבי הרטט המצומדים אלקטרונית של צבעי ראמאן, epr-SRS משיג אפקט שיפור דרסטי של פי 10¹³ על חתכי ראמאן ומתגבר על צוואר הבקבוק הרגיש של מיקרוסקופיית ראמאן קונבנציונלית (איור 1A)13,14,15. כתוצאה מכך, גבול הגילוי של epr-SRS נדחף לתת-μM, מה שמאפשר זיהוי ראמאן של סמנים מולקולריים מעניינים כגון חלבונים ואברונים ספציפיים בתוך תאים^13,16. בפרט, תוך שימוש בנוגדנים מצומדים לצבעי ראמאן, הדמיית epr-SRS של חלבונים ספציפיים בתאים וברקמות (הנקראת immuno-eprSRS) הודגמה ברגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית (איור 1B)^13,17. על-ידי כוונון אורך הגל של המשאבה ב-2 ננומטר בלבד, אות ה-epr-SRS יהיה כבוי לחלוטין (איור 1B), המציג ניגודיות רטט גבוהה.

בצד הגשושית, פותחה קבוצה של גשושיות ראמאן דמויות קשת בשם צבעי פיזור מנהטן ראמאן (MARS) להצמדת נוגדנים 13,18,19,20. פלטת ראמאן ייחודית זו מורכבת מצבעים חדשניים הנושאים קשרים משולשים מצומדים π (חומר משלים), שכל אחד מהם מציג שיא epr-SRS יחיד וצר בטווח הספקטרלי הביו-אורתוגונלי של ראמאן (איור 1C). על ידי שינוי המבנה של כרומופור הליבה ועריכה איזוטופית של שני האטומים של הקשר המשולש (חומר משלים), פותחו גשושיות ראמאן מופרדות ספקטרלית. תוך מינוף המולטיפלקסיות הניתנות להרחבה, מיקרוסקופיית epr-SRS בשילוב עם פלטת הצבעים MARS מציעים אסטרטגיה אופטית להדמיית חלבונים מולטיפלקס בצילום אחד בתאים וברקמות.

Immuno-eprSRS מספק אסטרטגיה חלופית לשיטות הדמיית חלבוני המולטיפלקס הנוכחיות עם חוזקות ייחודיות. בהשוואה לגישות פלואורסצנטיות עם צביעה מחזורית, הדמיה והסרת אותות, פלטפורמה מבוססת ראמאן זו מבטיחה צביעה והדמיה של סיבוב יחיד. לכן, הוא עוקף את המורכבות המעשית בהליכים מחזוריים ובמידה רבה מפשט את הפרוטוקול, ומכאן פותח טריטוריות חדשות של הדמיית חלבונים מרובבים. לדוגמה, רתימת פרוטוקול ניקוי רקמות המותאם לצבע ראמן, immuno-eprSRS הורחב לשלושה ממדים למיפוי חלבונים מרובב מאוד ברקמות עבות שלמות¹⁷. יותר מ-10 מטרות חלבונים צולמו לאורך רקמות מוח של עכברים בעובי מילימטר¹⁷. לאחרונה,^הודגם גם צימוד אימונו-eprSRS עם פרוטוקול מיקרוסקופיית הרחבה אופטימלית לשימור ביו-מולקולות (ExM)²¹, הדמיה בקנה מידה ננומטרי של ירייה אחת של מטרות מרובות. בהשוואה לספקטרוסקופיית מסות הדמיה ^4,9, epr-SRS הוא לא-דיסטרוקטיבי ובעל יכולת חתך אופטית פנימית. יתר על כן, epr-SRS יעיל יותר בזמן בסריקת רקמות. בדרך כלל, אזור רקמה של 0.25 מ"מ² עם גודל פיקסל של 0.5 מיקרומטר לוקח רק כמה דקות כדי לצלם עבור ערוץ epr-SRS יחיד. לדוגמה, זמן ההדמיה הכולל של ארבעה ערוצי SRS ועוד ארבעה ערוצים פלואורסצנטיים באיור 4 הוא בערך 10 דקות.

Protocol

הפרוטוקול נערך בהתאם לפרוטוקול הניסוי בבעלי חיים (AC-AABD1552) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה.

1. הכנת נוגדנים מצומדים בצבע רמאן

1. הכן את מאגר ההצמדה כ~ 0.1 M NaHCO₃ במאגר PBS, pH = 8.3, אחסן ב- 4 °C (74 °F).
2. הכן תמיסת גשושית MARS (חומר משלים) N-hydroxysuccinimidy (NHS) המתפקדת על-ידי אסטר-מתפקדת כ-3 mM ב-DMSO נטול מים. ניתן להפנות סינתזה של בדיקות MARS לדיווחים קודמים 13,17,18.
   הערה: למטרות אחסון, יש להגן על פתרון האסטר של NHS בצבע NHS מפני אור ולשמור עליו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. ממיסים את מוצקי הנוגדנים במאגר ההצמדה לריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. עבור נוגדנים המומסים במאגרים אחרים, החליפו אותם למאגר ההצמדה לריכוז של 1-2 מ"ג/מ"ל עם מסננים צנטריפוגליים.
   הערה: נוגדנים משניים בעלי ספיחה צולבת מאוד עדיפים על צביעת מולטיפלקס כדי למזער את תגובתיותם של מינים שונים. הנוגדנים המשניים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
4. בצע את תגובת ההצמדה.
   1. עבור נוגדנים משניים, הוסיפו עודף טוחן פי 15 של תמיסת צבע לתמיסת הנוגדן בבקבוקון זכוכית באיטיות עם ערבוב. לדוגמה, בתמיסת נוגדנים של 0.5 מ"ל 2 מ"ג/מ"ל, יש להוסיף תמיסת צבע של 35 μL 3 mM.
   2. דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורת החדר (RT) עם ערבוב במשך שעה אחת. הגן על התגובה מפני אור.
5. טיהור.
   1. הכן את שרף סינון הג'ל (טבלת החומרים) במאגר PBS, לאחר שלבים 1.5.2-1.5.4.
   2. הוסיפו 10 מ"ל של אבקת שרף סינון ג'ל לתוך 40 מ"ל של מאגר PBS בתוך צינור של 50 מ"ל.
   3. שמור את הפתרון באמבט מים של 90 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   4. דקאנט את הסופרנטנט והוסף מחדש PBS ל-40 מ"ל. אחסן את הסלורי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. ארזו את עמודת אי-הכללת הגודל (קוטר 1 ס"מ, עמודי זרימת כבידה) עם תמיסת ההחלקה לגובה של 10-15 ס"מ.
   6. שטפו ושטפו את העמודה בכ-10 מ"ל של מאגר PBS כדי לארוז עוד יותר את השרף.
   7. הצמידו את תערובת תגובת ההצמדה (כ-0.5 מ"ל) לטור. הוסף מיד 1 מ"ל של מאגר PBS כמאגר elution כאשר כל תערובת התגובה נטענת. כל הזמן מלאו מחדש את מאגר האלוטיון (PBS) לעמודה.
   8. אספו את ההתרוממות של תמיסת ההצמדה על ידי התבוננות בצבע העמוד (לצבעי MARS יש צבעים ירוקים בהירים עד כחולים) או למדוד את הספיגה ב-280 ננומטר (A280).
6. ריכז את התמיסה שנאספה ל-1-2 מ"ג/מ"ל באמצעות מסנן צנטריפוגלי.
7. קבע את הריכוז ואת מידת הסימון הממוצעת (DOL, יחס צבע לחלבון) על-ידי מדידת הספקטרום האולטרה-סגול-גלוי (UV-Vis) של התמיסה המצומדת באמצעות קורא לוחות ננו.
   הערה: חומר משלים מספק תכונות של NHS-esters בצבע MARS לצורך חישוב. ה- DOL הרגיל עבור הנוגדן המשני הוא בסביבות 3.

2. הכנת דגימת רקמות

1. Paraformaldehyde קבוע רקמות המוח של העכבר.
   1. להרדים את העכברים (C57BL/6J, נקבה, 25 d לאחר הלידה) עם איזופלורן. הערך את ההרדמה הנכונה באמצעות בדיקת צביטה בבוהן.
   2. להרוג את העכברים על ידי תזוזה צוואר הרחם. יש להחדיר לעכברים מיד 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS באופן טרנסקרדיאלי.
   3. אסוף את מוח העכבר, בהתאם לשלבים 2.1.4-2.1.5
   4. חותכים כלפי מעלה מגזע המוח לאורך התפר הסגיטלי. מקלפים את שני חצאי הגולגולת הצידה ומוציאים את המוח עם פינצטה.
   5. תקן את המוח שנאסף ב-4% PFA ב-PBS ב-4 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, שטפו את המוח במאגר PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להסיר עודפי PFA.
   6. מכניסים אגרוז מוצק למים לריכוז סופי של 7% (w/v) בכוס, עם מכסה רופף. מערבבים את התמיסה עם מוט ערבוב מזכוכית. מחממים את ההברקה במיקרוגל עד שהתמיסה ברורה.
   7. אפשרו לאגרוז להתקרר ל-45-55 מעלות צלזיוס.
   8. יוצקים את האגרוז הנוזלי לתוך תא קטן, ואז מעבירים את המוח מ-PBS לאגרוז נוזלי ומכוונים אותו עם מרית כדי להטמיע את המוח. המתן עד שגוש הרקמות-אגרוז יתקשה.
   9. חתכו את הרקמה-אגרוז לפרוסות קורונליות בעובי 40 מיקרומטר באמצעות ויברטום.
   10. מעבירים את הרקמה לצלחת של 4 בארות לצורך ההכתמה הבאה. הסר את האגרוס עם פינצטה. לשטוף את הרקמה עם 1 מ"ל של PBS, שלוש פעמים.
2. קבוע רקמות לבלב עכבר קפוא.
   1. תקן את הלבלב של העכבר ב-4% PFA ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך 16-20 שעות.
   2. שטפו את הדגימה ב-1 מ"ל של PBS (4 °C) שלוש פעמים כדי להסיר PFA.
   3. הטבע את הדגימה (בגודל של כ-0.3-0.5 ס"מ) בבלוקים מורכבים אופטימליים של טמפרטורת חיתוך (OCT). שים 2 טיפות של OCT לתוך cryomold פלסטיק. מניחים את הרקמה בכיוון הנכון ושופכים OCT על גבי הרקמות עד שאף אחת מהרקמה לא נשארת חשופה.
   4. חתכו את הלבלב לפרוסות בעובי 8 מיקרומטר ושיתקו אותן לשקופית זכוכית קושרת רקמות, אחסנו אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   5. לפני ההכתמה, שיזבו את הדגימה ל-RT. שטפו את הרקמה עם PBS כדי להסיר בלוקי OCT.
3. דגימות FFPE.
   1. יש לאפות את שקופית רקמת ה-FFPE בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. דפראפיניזציה והתייבשות: מקם דגימות ברצף בתמיסות הבאות בצינור 50 מ"ל ב- RT למשך 3 דקות בכל פעם עם רעידות קלות:
      קסילן פעמיים,
      אתנול פעמיים,
      95% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים,
      70% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים,
      50% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת,
      מים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת.
   3. העבירו את הדגימה ל-20 mM נתרן ציטראט (pH 8.0) ב-100 מעלות צלזיוס בצנצנת זכוכית. ודא שהרקמות שקועות בתמיסה.
   4. שים את הצנצנת באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
   5. שטפו את הדגימה עם מים שעברו דה-יוניזציה ב-RT למשך 5 דקות.

3. צביעת רקמות אימונו-eprSRS

1. השתמש בעט הידרופובי כדי לשרטט גבול סביב חלקי הרקמה במגלשה.
   הערה: צנצנת צביעת שקופיות משמשת לביצוע שלבי הדגירה של הרקמה בשקופית. רקמות צפות (מקטעי מוח עכברים בעובי 40 מיקרומטר) מוכתמות בלוחות באר.
2. דגירה של הרקמות עם 0.3-0.5% PBST (טריטון X-100 ב- PBS) למשך 10 דקות.
3. דגירה של הרקמות עם חיץ חוסם (5% סרום חמור, 0.5% טריטון X-100 ב-PBS) למשך 30 דקות.
4. הכינו את תמיסת ההכתמה העיקרית: הוסיפו את כל הנוגדנים הראשוניים ל-200-500 μL של מאגר צביעה (2% סרום חמורים, 0.5% Triton X-100 ב-PBS) בריכוזים הרצויים. צנטריפוגה היא תמיסת הכתם העיקרית ב-13,000 x גרם למשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט רק אם נוצרים משקעים.
5. דגירה של הרקמה בתמיסת הנוגדן העיקרית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים.
   הערה: להכתמת מקטעי רקמות על המגלשה, שים את הדגימה בקופסת צביעה עם מגבון לח כדי לשמור על לחות.
6. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 0.3-0.5% PBST ב-RT למשך 5 דקות כל אחת. השתמש ב- 1 mL PBST עבור רקמות צפות. עבור רקמות על המגלשה, לשטוף את השקופיות בצנצנת צביעה החלקה ולוודא שהרקמות כולן שקועות בתמיסה.
7. דגירה של הרקמה ב 200-500 μL של חיץ חוסם במשך 30 דקות.
8. הכינו את תמיסת הכתם המשנית: הוסיפו את כל הנוגדנים המשניים (והלקטינים במידת הצורך) ל-200-500 μL של מאגר צביעה עם ריכוזים רצויים (בדרך כלל 10 מיקרוגרם/מ"ל). צנטריפוגה תמיסת הכתם המשנית ב 13,000 x g למשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט רק אם נוצרים משקעים.
9. דגירה של הרקמות ב 200-500 μL של תמיסת נוגדנים משנית ב 4 °C (4 °F) למשך 1-2 ימים.
10. שטפו את המגלשות פעמיים עם 0.3-0.5% PBST ב-RT למשך 5 דקות כל אחת.
11. אינקובציה עם 200-500 μL של פתרון DAPI למשך 30 דקות.
12. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS ב-RT למשך 5 דקות כל אחת.
13. עבור קטעי רקמות צפות, העבר אותם למגלשות זכוכית עם פיפטה מפילת זכוכית. מורחים את הרקמה עם מברשת טישו ומנקים את הסביבה במגבונים במידת הצורך.
14. הרכיבו את הרקמה בטיפה של ריאגנטים נגדיים עם כיסוי זכוכית והצמידו אותה לציפורניים.

4. הרכבה של מיקרוסקופ SRS

הערה: מערכת פלואורסצנציה קונפוקלית מסחרית משמשת בהדמיית SRS-פלואורסצנציה טנדם. תיאורים נוספים ניתן למצוא בדו"ח קודם¹⁷. פרוטוקול זה יתמקד בצד ההדמיה של SRS באמצעות עירור בפס צר.

1. הכינו שולחן אופטי מבודד רטט בחדר עם בקרת טמפרטורה.
2. הניחו מערכת לייזר כפול מסונכרנת (משאבה וסטוקס) על השולחן האופטי (איור 2A) עם צ'ילר מחובר.
   הערה: הלייזר הבסיסי במערכת הלייזר הכפול מספק רכבת פולס יציאה ב-1064 ננומטר עם רוחב פולס של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ. קרן סטוקס היא מהלייזר הבסיסי. עוצמתה של קרן סטוקס הופנתה באופן סינוסואידי על ידי אפנן משרעת אלקטרו-אופטית מובנה (EOM) ב-8 מגה-הרץ עם עומק אפנון של יותר מ-90%. החלק השני של הלייזר היסודי מוכפל תדרים ל-532 ננומטר, המשמש גם לזריעה סינכרונית של מתנד פרמטרי אופטי פיקוס-שניות (OPO) כדי לייצר רכבת פולסים נעולה במצב עם רוחב פולסים של 5-6 ps (קרן האידלר של ה-OPO חסומה באמצעות מסנן אינטרפרומטרי). אורך הגל של הפלט של ה- OPO ניתן לכוונון בין 720-950 ננומטר, המשמש כקרן המשאבה.
3. הרכיבו את המראות (טווח אורכי גל: 750-1100 ננומטר), מפצלי אלומות דיכרואיים (DBS, מסנן מעבר ארוך של 980 ננומטר, מלבני), ועדשה (achromatic, ציפוי AR עבור 650-1050 ננומטר) לתושבות המתאימות שלהם. השתמש בתושבות מראה יציבות מאוד עבור המראות ומפצלי הקרן הדיכרואיים.
4. מדוד את גובה פלט הלייזר ואת גדלי הקרן של המשאבה ואת קרני סטוקס. התאם את גובה המראות והעדשות כדי להבטיח שהאור יפגע במרכז כל האלמנטים האופטיים.
5. הניחו את מראה M1 על הטבלה האופטית והכינו אותה כ-45° ליציאת הלייזר (איור 2B). השתמש בידיות שעל התושבת הקינמטית כדי לבצע התאמות קצה והטיה. ודא שהאור נע באותו גובה לאורך השולחן וקו ישר ביחס לשולחן.
6. מקם ויישר את מפצלי הקרן הדיכרואיים (מסנני מעבר ארוך של 980 ננומטר) ואת המראות כדי לפצל את המשאבה ואת אלומות סטוקס (איור 2A-B).
7. מקם ויישור זוגות עדשות (L1, L2 ו-L3, L4) בכל אחד מנתיבי הקרן כדי לרכז את הקורות ולהרחיב את קוטרי הקרן כך שיתאימו לאישון האחורי של המטרה (איור 2A-B).
8. השתמשו במראות M7 ו-M8 כדי ליישר קרני לייזר משולבות לתוך המיקרוסקופ (איור 2C). יישמו תחילה קרן אחת למיקרוסקופ והשתמשו בזוגות המראה על הקרן השנייה כדי להבטיח את החפיפה המרחבית של שתי האלומות.
9. הגדר את חלק הזיהוי.
   1. הרכיבו מעבה שמן מצופה אינפרא-אדום (1.4-NA) כדי לאסוף את המשאבה ההולכת קדימה ואת קורות סטוקס לאחר שעברו דרך הדגימות (איור 2C).
   2. הרכיבו פוטודיודה Si בעלת שטח גדול על קופסה מסוככת עם מחברי BNC (איור 2E). הוסף ספק כוח DC 64-V לפוטודיודה המותקנת כדי להגדיל את סף הרוויה ואת רוחב הפס של התגובה.
   3. שחזרו את האור ההולך קדימה באמצעות מראה בגודל 2 אינץ'. מקד מחדש את האור על הפוטודיודה לאחר מסנן אופטי כדי לחסום את קרן סטוקס המווסתת (איור 2D).
   4. שלח את זרם הפלט של הפוטודיודה למגבר נעילה מהיר המסתיים עם 50 להדגמת אותות. שלח הדק של 8 מגה-הרץ למגבר הנעילה כאות הייחוס.
   5. שלח את רכיב ה- X הפאזה של מגבר הנעילה לתוך תיבת הממשק האנלוגית של המיקרוסקופ.
10. מטב את החפיפה הטמפורלית עם שלב ההשהיה הממונע המובנה על ידי מדידת אות ה-SRS של נוזל D₂O טהור במיקרוסקופ.

5. רכישה וניתוח של תמונות

1. בצע הדמיית epr-SRS רב-ערוצית עם כוונון אורך גל רציף של משאבה.
   1. הגדר את כוח הלייזר _למשאבת P = 10-40 mW ו- P_Stokes = 40-80 mW בלוח הבקרה של הלייזר.
   2. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים ל- 2-4 μs והשתמש במסגרות מרובות בממוצע של 10-20 פריימים בתוכנת המיקרוסקופיה.
      הערה: הימנע משימוש קומבינטורי בהספק לייזר גבוה (_משאבת P> 40 mW, P_Stokes> 80 mW) וגודל פיקסלים קטן (<0.2 מיקרומטר), אשר ככל הנראה גורמים ל'אפקט הלבנה' של צבעי ראמאן עקב עירור מרובה-פוטון.
   3. הגדר את קבועי הזמן של מגבר הנעילה למחצית מזמן השהייה של הפיקסל.
2. אי-התערבבות ספקטרלית ליניארית.
   הערה: epr-SRS עוקב אחר תלות ליניארית קפדנית באות לריכוז על פני כל טווח הריכוזים; לפיכך, אי-ערבוב ספקטרלי ליניארי יעיל להסרת כל שיחות צולבות פוטנציאליות בין ערוצים. עבור מדידת epr-SRS של ערוץ N עם N גשושיות MARS, אותות מדודים (S) יכולים לבוא לידי ביטוי כ- S = MC, כאשר C הוא ריכוזי הגשושית MARS, ו- M היא מטריצת N x N הנקבעת על ידי חתכי ראמאן של גשושיות MARS.
   1. מדוד מטריצה M על דגימות אימונו-eprSRS בצבע יחיד המסומנות בבדיקות MARS שונות.
   2. השתמש במשוואה C = M−1· S כדי לקבוע את מטריצת הריכוז של גשושית MARS באמצעות מדידת אותות מדגם מולטיפלקס S.

תוצאות

איור 3 מציג תמונות לדוגמה של epr-SRS בדגימות שונות, כולל תאים קבועים (איור 3A), רקמות עכבר קבועות של פרפורמלדהיד (PFA) (איור 3B) ודגימות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) (איור 3C). הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיית SRS מוגבלת עקי...

Discussion

כאן אנו מציגים את פרוטוקול immuno-eprSRS אשר ישים באופן נרחב לסוגי רקמות נפוצים, כולל רקמות עכברים שזה עתה השתמרו, רקמות אנושיות FFPE ורקמות עכבר קפואות. Immuno-eprSRS אומת עבור פאנל של אפיטופים בתאים וברקמות, כמפורט בטבלה 1. פלטפורמה זו של ירייה אחת מתאימה במיוחד ליישומים שבהם אסטרטגיות מחזורי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
α-tubulin	Abcam	ab18251	Primary antibodies
α-tubulin	BioLegend	625902	Primary antibodies
β-III-tubulin	BioLegend	657402	Primary antibodies
β-III-tubulin	Abcam	ab41489	Primary antibodies
β-tubulin	Abcam	ab131205	Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature	Sigma Aldrich	A9414	For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin)	Abcam	ab52866	Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2  antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primary antibodies
Anti-Glucagon  antibody produced in mouse (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin)	DAKO	IR00261-2	Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP)	Abcam	ab7349	Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin)	Abcam	ab24525	Primary antibodies
Band-pass filter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC cable	Thorlabs	2249-C	Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Centrifuge
Condenser	Olympus		oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primary antibodies
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primary antibodies
DC power supply	TopWard	6302D	Bias voltage is 64 V
Dichroic mount	Thorlabs	KM100CL	Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primary antibodies
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-speed look-in amplifier	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primary antibodies
Giantin	Abcam	ab24586	Primary antibodies
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primary antibodies
H2B	Abcam	ab1790	Primary antibodies
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter	Chroma Technology	ET890/220m	Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primary antibodies
Integrated SRS laser system	Applied Physics & Electronics, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope	Olympus	FV1200MPE
Kinematic mirror mount	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2	BioLegend	801810	Primary antibodies
Microscopy imaging software	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well Dishes	Fisher Scientific	12-566-300
Objective lens	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly	Thorlabs	RS99	includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader	Tecan	Infinite 200 PRO	An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors	Pomona Electronics	2902	Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode	Thorlabs	FDS1010	350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides	Fisher Scientific	22-035813	Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primary antibodies
Xylenes	Sigma Aldrich	214736