小鼠小肠上皮类器官与先天性淋巴细胞的共培养

摘要

该协议为建立小鼠小肠类器官，从小鼠小肠固有层中分离1型先天淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立3维（3D）共培养物以研究肠上皮细胞和1型先天淋巴细胞之间的双向相互作用提供了详细的说明。

摘要

类器官与免疫细胞的复杂共培养物为询问支持粘膜稳态微妙平衡的双向相互作用提供了一种多功能工具。这些3D，多细胞系统提供了一种还原论模型，用于解决多因素疾病并解决在研究组织驻留先天淋巴细胞（ILC）等稀有细胞类型时出现的技术难题。本文介绍了一种小鼠系统，该系统结合了小肠类器官和小肠固有层衍生的辅助性1型ILCs（ILC1s），可以很容易地扩展到其他ILC或免疫人群。ILCs是一种组织居民群体，在粘膜中特别丰富，在那里它们促进体内平衡并对损伤或感染迅速反应。与ILC的类器官共培养已经开始揭示肠道中新的上皮免疫信号传导模块，揭示了不同的ILC亚群如何影响肠道上皮屏障的完整性和再生。该协议将能够进一步研究上皮细胞和免疫细胞之间的相互相互作用，这有可能为粘膜稳态和炎症的机制提供新的见解。

引言

肠上皮和肠道驻留免疫系统之间的沟通是维持肠道稳态^{的核心 1}。这些相互作用的破坏与局部和全身性疾病有关，包括炎症性肠病（IBD）和胃肠道癌²。最近描述的稳态关键调节因子的一个显着例子来自对先天性淋巴细胞（ILCs）的研究，这些细胞已成为肠道免疫景观中的关键参与者³。ILC是一组异质性先天免疫细胞，主要通过细胞因子介导的信号传导来调节肠道稳态并协调炎症⁴。

小鼠 ILC 根据转录因子、受体和细胞因子表达谱广泛分为亚型⁵。1 型 ILC，包括细胞毒性自然杀伤 （NK） 细胞和辅助性 1 型 ILCs （ILC1s），分别由 T 细胞中表达的转录因子 （eomesodermin） Eomes 和 T-box 蛋白 （T-bet）⁶ 以及与 T 辅助性 1 型 （T_H1） 免疫相关的分泌细胞因子来定义:干扰素-γ （IFNγ） 和肿瘤坏死因子 （TNF），以响应白细胞介素 （IL）-12， IL-15和IL-18⁷。在体内平衡期间，组织常驻ILC1s分泌转化生长因子β（TGF-β）以驱动上皮增殖和基质重塑⁸。2 型 ILC （ILC2s） 主要 通过 分泌 2 型 T 辅助性 T 辅助细胞 （T_H2） 相关细胞因子 IL-4、IL-5 和 IL-13 对蠕虫感染作出反应，其特征在于表达视黄酸相关孤儿受体 （ROR） α （ROR-α）⁹ 和 GATA 结合蛋白 3 （GATA-3）^10，11，12.在小鼠中，肠道"炎症性"ILC2s进一步表征为表达杀伤细胞凝集素样受体（亚家族G成员1，KLRG）¹³ ，其中它们响应上皮簇状细胞衍生的IL-25^14，15。最后，3型ILCs，包括淋巴组织诱导细胞和辅助性3型ILCs（ILC3s），依赖于转录因子ROR-γt¹⁶，并聚集在分泌粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），IL-17或IL-22以响应局部IL-1β和IL-23信号¹⁷的组。淋巴组织诱导细胞聚集在Peyer贴片中，对于发育过程中这些次级淋巴器官的发育至关重要¹⁸，而ILC3s是成年鼠小肠固有层中最丰富的ILC亚型。利用最早的鼠肠类器官共培养系统之一与ILC3s来梳理细胞因子IL-22对信号传感器和转录激活剂3（STAT-3）介导的富含亮氨酸重复序列含有G蛋白偶联受体5（Lgr5）⁺ 肠干细胞增殖^的影响19，这是再生ILC上皮相互作用的有力例子。ILC表现出器官^20，21 之间的印记异质性，并且响应于极化细胞因子²²，在亚群之间表现出可塑性。是什么推动了这些组织特异性印记和可塑性差异，以及它们在IBD²³等慢性疾病中的作用，仍然是令人兴奋的话题，可以使用类器官共培养来解决。

肠道类器官已成为研究肠道上皮^24，25的成功和可靠的模型。这些是由培养肠上皮Lgr5 ⁺ 干细胞或整个分离的隐窝产生的，其中包括作为Wnt家族成员3A（Wnt3a）的内源性来源的Paneth细胞。这些3D结构在合成水凝胶²⁶ 或模仿基底层固有体的生物材料中维持，例如，热交联基底细胞外基质（TBEM），并进一步补充模仿周围生态位的生长因子，最着名的是上皮生长因子（EGF），骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂Noggin，以及Lgr5配体和Wnt激动剂R-Spondin1²⁷.在这些条件下，类器官维持上皮蜂基极性，并用萌芽的干细胞隐窝来概括肠上皮的隐窝绒毛结构，这些隐窝在类器官的中心最终分化为吸收细胞和分泌细胞，然后通过anoikis²⁸脱落到内部假羽化物中。虽然单独使用肠道类器官作为上皮发育和动力学的还原论模型具有巨大的优势^29，30，但它们在理解这些行为如何被免疫区室调节，影响甚至破坏方面具有巨大的未来潜力。

在下面的方案中，描述了小鼠小肠类器官和固有层衍生的ILC1s之间的共培养方法，该方法最近用于鉴定该人群如何意外地减少炎症的肠道特征，而不是 通过 该系统中的TGF-β促进上皮增殖的增加⁸。

研究方案

所有实验必须按照并遵守所有相关的动物使用监管和制度指南完成。以下文章和视频中描述的研究的伦理批准是根据并符合所有相关的动物使用监管和制度指南获得的。

所有小鼠均根据标准伦理程序通过宫颈脱位进行剔除，由训练有素的个体进行。在器官和组织采集之前，进行股动脉切片或斩首（根据手头的方案）作为死亡的确认性评估。根据1986年英国动物（科学程序）法案（英国内政部项目许可证（PPL:70/7869至2018年9月;P9720273E，2018年9月起）。

1. 建立鼠小肠类器官

注意:方案的这一部分描述了从小鼠小肠产生肠道类器官。首先从组织中分离隐窝，重悬于TBEM中，然后与含有EGF，Noggin和R-Spondin（ENR）的培养基一起孵育。建立鼠小肠类器官在其他地方也有很好的描述^24，25，27。

1. 将TBEM放在冰上解冻（40μL /孔），并将处理过的标准组织培养物（指具有亲水和带负电荷的表面的板）24孔板置于37°C培养箱中预热。
   注意:500μLTBEM将在大约2-4小时内解冻;不要将其放在室温下。
2. 通过将EGF，Noggin和R-Spondin添加到基础培养基中（表1）并置于37°C培养箱中，每孔制备〜4mL或550 mL ENR培养基。
3. 剔除一只6-12周龄的动物，用镊子和显微解剖剪刀切除小肠。将其放入冰上15毫升磷酸盐缓冲盐（PBS）中。
4. 使用胃和盲肠作为方向点，分离小肠的所需区域（十二指肠，空肠或回肠）。在该协议中，回肠被分离。
5. 将肠道浸入PBS中，放在冰上10厘米² 的培养皿上。使用镊子，轻轻地，但完全地从肠道中去除脂肪。
6. 使用显微切割剪刀纵向切割组织（最好使用圆形尖端以避免穿孔）。保持肠道浸没在PBS中，摇动以去除粪便物质，并保持粘液面向上以跟踪组织方向。
7. 将组织转移到冰上培养皿的干盖上，将肠粘液/绒毛侧朝上放置。用镊子握住肠的一端，使用干净的载玻片的倾斜边缘轻轻刮掉粘液。
8. 在盘子里装满冰冷的PBS，然后冲洗纸巾。
9. 用PBS2（PBS + 2%FCS;见 表1）预涂覆50毫升管以防止组织粘附到塑料上，并向该管中加入10mL冰冷的PBS。将肠道切成小（~2 mm）段，并将其转移到预先涂有PBS2的50 mL管中。
10. 使用预先涂有PBS2的25 mL移液器，将段上下移液5-10次以清洁组织碎片。
11. 让片段沉降15-30秒，除去并丢弃PBS上清液，并重复步骤1.10和1.11，直到溶液清澈（约3-4次）。
12. 让片段沉降并丢弃PBS上清液。加入30 mL冰冷隐窝隔离缓冲液（表1）。
13. 将管置于水平辊或摇臂上，在4°C下以30-60rpm（或轻柔）放置30分钟。 不要以更快的速度，更高的温度或更长的持续时间孵育，因为隐窝会过早地脱落并成为具有较低活力和产量的单细胞。
    注意:从这个阶段开始，所有程序都应在无菌环境中使用无菌材料和试剂进行。
14. 让肠段沉降在50 mL管的底部。在不破坏沉降片段的情况下取出隐窝隔离缓冲液，并将其转移到冰上的50 mL管中。
    注意:如果密码隔离过程过于严格，则可能会在此部分中看到密码。因此，它可以保留为保留，但最好在协议结束时被丢弃。
15. 向肠段添加20毫升冰冷的PBS。使用预先涂有PBS2的25 mL移液器，移液器将肠段上下移液5-8次。
16. 让这些段静置 30 秒。用 PBS2 预涂覆 50 mL 试管和 25 mL 移液器。使用此移液器，将上清液（级分1）收集到预先包被的50mL管中，并将管放在冰上。
    注意:该分数用于冲洗掉剩余的密码隔离缓冲液。但是，它也可以作为额外的质量控制步骤;如果移液太剧烈，这种漂洗馏分中的隐窝会很丰富，如果太温和，这种馏分中的碎屑会很少。理想情况下，在方案结束时丢弃分数1，但如果下面获得的分数2-4出现问题，它可用于制造类器官。
17. 重复步骤1.15和1.16，但加入10mL冰冷的PBS而不是20mL，并将上清液置于预先涂有PBS2（级分2）的新鲜50mL管中。
18. 重复步骤1.17两次，但将得到的上清液与级分2（从步骤1.17到相同的50mL管中）合并以获得级分2-4。这个单根50 mL管应将移位的隐窝包含在30 mL冰冷的PBS中。
19. 从合并的2-4个级分中取出50μL等分试样，并将其放在盖玻片上。使用倒置光学显微镜评估上皮隐窝的存在。
    注意:如果不存在密码，请在移液过程中使用更大的力重复步骤1.17和1.18，直到释放密码。确保在步骤 1.14 中的密码隔离缓冲区中或步骤 1.16 中的第 1 部分中未过早移除隐窝。
20. 用PBS2预涂覆100μm过滤器和50mL管。将池化的地穴级分通过该过滤器并进入预涂覆的50 mL管中。
21. 在4°C下以300× g 旋转5分钟的应变隐窝部分。
22. 丢弃上清液并将隐窝重悬于10 mL冰冷的高级DMEM / F12中。将隐窝移至15 mL管中。
23. 在4°C下以210× g 旋转隐窝5分钟以除去单细胞和淋巴细胞。
24. 将隐窝重悬于1 mL冰冷的高级DMEM / F12中。
25. 取出10μL等分试样并将其放在盖玻片上。使用倒置光学显微镜，计算隐窝的数量以确定隐窝浓度。
26. 计算 ~400 和 ~1，500 个地穴所需的体积。用PBS2预涂覆p1000吸头，并使用此吸头将所需体积（包含约400和约1，500个窝）移液到单独的1.5 mL管中。
27. 在4°C下以300× g 旋转隐窝5分钟。
28. 除去尽可能多的上清液，然后将隐窝重悬于置于冰上的80μLTBEM中（在4°C下预冷移液器吸头以防止基质凝胶化，这在12°C下发生）。
29. 从培养箱中取出放置在步骤1.1中的24孔板。轻轻地将40μL隐窝以缓慢的圆周运动移液到孔的中心，以形成平坦但3D圆顶结构，或进入三个独立的小圆顶。
    注意:类器官的活力在圆顶中心是最低的，其中营养物质和气体渗透的效率较低³¹;因此，最大化暴露于介质的表面积，同时保持清晰的3D结构至关重要。
30. 重复步骤1.29，总共创建两个孔，密度为每孔约200个隐窝，另外两个孔的密度为每孔约750个隐窝。直接将板放在培养箱（37°C和5%CO₂）中15-20分钟，注意不要破坏粘稠但仍然液体的基质圆顶。
31. 每孔加入550μL预热的ENR培养基（从步骤1.2开始），并在37°C和5%CO 2下孵育_24小时。 在该阶段，建议在分离后的前24小时用5μM Wnt激动剂（CHIR 99021）和5μM Rho激酶抑制剂（Y-27632）补充ENR培养基，以提高从组织中新鲜分离的隐窝的类器官生成的产量和效率。
    注意:隐窝应在24小时内关闭以形成圆形结构，隐窝芽应在2-4天内出现（图1A）。
32. 在步骤1.31中孵育结束时用新鲜的ENR培养基替换，然后每〜2天或当培养基中的苯酚pH指示剂变成淡橙色但在变黄之前。

2.维持鼠小肠类器官

注意:方案的这一部分描述了小鼠小肠类器官的维持和传代。首先收获类器官，然后使用弯曲的p1000尖端进行机械破坏。这个过程将由许多密码组成的大型类器官分解成多个较小的碎片以进行扩增，并释放积聚在假体中的死细胞。小鼠小肠类器官维持在其他地方也得到了很好的描述^24，25，27。所有程序都应在无菌环境中使用无菌材料和试剂进行。每4-5天通过或扩张一次类器官，然后类器官破裂，因为类器官管腔中的碎片大量积聚而发生。类器官可以以1:2-1:3的比例传代，这取决于类器官密度，最好是每孔100-200个类器官。

1. 与步骤1.1和1.2一样，在冰上解冻TBEM（40μL/孔）并制备ENR培养基（每孔550μL）。将处理过的培养基和标准组织培养物置于37°C培养箱中处理过的24孔板中。
2. 从培养箱中取出含有类器官的板。从孔中丢弃要传代的培养基。
3. 向孔中加入500μL冰冷的高级DMEM / F12。使用p1000吸头（预先涂有培养基以避免类器官粘附在吸头内部），将类器官收获到15 mL管中。
4. 用250-300μL冰冷的高级DMEM / F12冲洗孔的底部，确保孔中没有类器官残留，并汇入含有步骤2.3中收获的类器官的15mL管中。在传代多个孔时重复步骤2.3和2.4，并将多个孔中的类器官池化物放入同一个15 mL管中。
5. 在4°C下以300× g 旋转3分钟。
6. 离心时，确保有四个可见的组分:具有健康类器官的碱基部分，中心和透明基质部分，含有单个和死细胞的基质部分，以及包含单个和死细胞的上清液层。除去上清液，碎片部分和尽可能多的透明基质碎片，而不会破坏类器官的沉淀。
7. 轻轻弯曲p1000移液器吸头的尖端（弯曲约2-5毫米）。将此尖端预涂在 PBS2 或高级 DMEM/F12 中。使用此吸头，上下移液类器官10-20次，以机械方式破坏类器官和剩余的基质。
8. 在4°C下以210× g旋转3分钟。
9. 与步骤2.6一样，除去上清液，碎片部分和尽可能多的透明基质碎片，而不会破坏解离隐窝的沉淀。如果健康的隐窝或小类器官尚未形成透明的沉淀，则在4°C下以300× g 再次离心3分钟。
10. 计算所需的TBEM体积（每孔收获的类器官80-120μL，取决于是否使用1:2或1:3的传代比）。
11. 将沉淀重悬于TBEM的计算体积中，并将每孔40μL施加到预热的24孔板上以形成圆顶。直接将板置于培养箱（37°C; 5%CO₂）中15-20分钟。
12. 每孔加入550μLENR培养基，并在37°C和5%CO₂下孵育。检查24小时后培养物的类器官形成_。 在传代后每2-3天更换一次新鲜的ENR培养基。

3. 小肠固有层先天淋巴细胞的分离

注意:方案的这一部分描述了ILC1从 RORγt^GFP报告小鼠的小鼠小肠固有层中分离出来。这涉及上皮细胞去除，组织消化，淋巴细胞的密度梯度分离以及 通过 荧光活化细胞分选（FACS）分离ILC1。遵循 图2 中的浇口策略进行的FACS分离需要细胞外染色主混料（表4），并设置 表2 和 表3 中描述的机器（表2）和浇口（表3）的附加染色控制。 RORγt^GFP报告基因小鼠用于分离活的纯ILC1和栅极 Rγt^GFP+ ILC3。 用于分离固有层淋巴细胞的组织处理在其他地方也得到了很好的描述³²。

1. 组织加工
   注意:来自单个生物动物复制的组织在本方案中保持分离。这些样品应尽可能贴上适当的标签并保存在冰上。除消化酶外，所有试剂均应达到室温，以确保快速组织消化。
   1. 将TBEM放在冰上解冻（40μL /孔）。将标准组织培养处理的24孔板保存在37°C培养箱中预热。
   2. 制备新鲜的上皮去除缓冲液和消化缓冲液（见 表1）。在中和缓冲液中制备等渗低粘度密度梯度介质（LVDGM）（90%LVDGM和10%10x PBS），40%等渗LVDGM和80%等渗LVDGM（表1）。
   3. 剔除一只6-12周龄的动物，用镊子和显微解剖剪刀切除小肠，并将肠放入15毫升PBS的冰上。
   4. 将肠道浸入PBS中，放在冰上10厘米² 的培养皿上，并使用镊子轻轻但完全地从肠道中去除脂肪。
   5. 使用微切割剪刀去除Peyer的贴片（〜5-10;在与脂肪组织线相反的线中运行）以耗尽淋巴组织诱导细胞和B细胞。
      注意:Peyer的斑块在Rag^-/- 和其他谱系耗尽的动物中不存在。与气泡不同，如果轻推，Peyer的贴片将保留在原位。
   6. 使用显微切割剪刀纵向切割组织（最好使用圆形尖端以避免穿孔）。保持肠道浸没在PBS中，摇晃以去除粪便。
   7. 将组织切成2-4厘米长的块，并将其转移到50 mL管中。
   8. 加入约20-40毫升冰冷的PBS，用力摇晃5-15秒，以除去粘液和碎屑。
   9. 将管中的内容物丢弃到新鲜的培养皿上，并使用镊子将肠碎片置入相同的50mL管中。
   10. 重复步骤 3.1.8 和 3.1.9 3-4 次，或直到 PBS 清除。
2. 上皮去除
   1. 将肠道碎片放入冰上的新鲜培养皿中。使用镊子，拾取肠道节段，并通过轻敲干燥的表面去除多余的液体。
   2. 将组织切成约0.75-1厘米的碎片，并将其转移到新鲜的50毫升管中。加入5-7mL上皮去除缓冲液（表1）。涡旋管并确保所有肠段都浸没在缓冲液中。
   3. 将样品在37°C下摇动（100-150rpm）孵育12-15分钟。涡旋管20-30秒。
   4. 再次重复步骤3.2.1-3.2.3，丢弃混浊的上清液（部分含有上皮和上皮内细胞）并用新鲜的上皮去除缓冲液替换它。
3. 组织的消化
   1. 将内容物倒入新鲜的培养皿上。使用镊子，拿起肠道节段，轻拍干燥的表面以丢弃多余的液体。将切片放入冰上的新鲜培养皿中。
   2. 将段聚集到培养皿的中心，形成一个致密的质量。使用两把手术刀或锋利的剪刀，将组织切碎，直到达到可以通过p1000移液器吸头的粘稠度。
   3. 使用镊子将切碎的组织放入干净的50 mL管中。用1-2mL消化缓冲液冲洗培养皿（表1）以收集任何剩余的组织并将其与切碎的组织一起池化到50mL管中。
   4. 向切碎的组织中加入5-7mL消化缓冲液，并确保所有组织都收集在管的底部。
   5. 将样品在37°C下孵育，用中等振荡（〜100-150rpm）孵育15分钟。每5分钟涡旋管20-30秒，以帮助消化。
   6. 在样品孵育时，将40μm细胞过滤器放在每个样品的新鲜50mL管的顶部。在过滤器上涂上1-2 mL中和缓冲液（表1）。
   7. 孵育完成后，涡旋样品20-30秒。
   8. 通过包被的40μm过滤器将部分消化的组织过滤到含有中和缓冲液的50mL管中。
   9. 使用镊子从40μm过滤器中收集未消化的组织，并将其放回进行消化的50mL管中，以进行第二轮消化。取出过滤器并用消化缓冲液冲洗它们，以清除粘附在过滤器上的任何未消化的组织。
   10. 一旦从过滤器中取出尽可能多的未消化组织并放回进行消化的50 mL管中，用1-2 mL中和缓冲液在含有过滤上清液的50 mL管上冲洗过滤器。
   11. 向过滤的上清液中加入20-25mL中和缓冲液，并将其置于冰上，以在第二轮组织消化期间保持分离细胞的活力。
   12. 向未消化的组织中再加入5-10mL消化缓冲液，并重复步骤3.3.5-3.3.10，确保将消化组织过滤到与步骤3.3.8中使用的相同管中（相同的过滤器也可以重复使用）。用中和缓冲液冲洗过滤器，直到达到50 mL管路，然后丢弃任何剩余的未消化组织。
4. 按密度梯度分离淋巴细胞
   1. 将收集的上清液以500× g 旋转每个生物重复10分钟。
   2. 在步骤3.4.1期间，为每个生物重复向15mL管中加入5mL的80%等渗LVDGM。
   3. 离心后，从过滤的消化组织中丢弃上清液。将沉淀重悬于10 mL的40%等渗LVDGM中，确保沉淀均匀化，并且没有大块残留。
   4. 将移液器辅助设置为最慢的设置，倾斜含有80%等渗LVDGM的15 mL管，并非常轻柔地将10 mL细胞悬浮液覆盖在40%等渗LVDGM中，确保细胞悬浮液不与80%部分混合。
      注意:如果馏分意外混合，请在两个装满PBS的50mL管之间快速分布达到80%组分的淋巴细胞，并以500×g离心10分钟。然后，弃去上清液，并重复步骤3.4.3-3.4.4。
   5. 在900 x g 和20°C下旋转管子，将加速度和解收率设置为最低设置，以确保馏分不会中断。离心20分钟（不包括休息时间）。
      注意:从此步骤开始的所有程序都应使用无菌材料和试剂在无菌组织培养罩中进行。
   6. 用PBS2预涂覆每个样品的50 mL试管，并加入45 mL冰冷的PBS。
   7. 离心后，轻轻地从15 mL管中除去上部碎屑层。用PBS2涂覆p1000尖端，并使用它收集40%-80%梯度之间的淋巴细胞间期到含有45 mL冰冷PBS的50 mL管中。
   8. 在4°C下以300× g 旋转管5分钟。
   9. 弃去上清液并将沉淀重悬于500μLFACS缓冲液（PBS，2%FCS，0.5mM EDTA和10mM HEPES;见 表1） 中。用FACS缓冲液预涂覆40μm过滤器，并使用它来将细胞悬浮液过滤到流管中。用另外500μL FACS缓冲液冲洗50 mL管，并过滤到同一流管中。
   10. 从得到的1mL细胞悬浮液中取出10μL等分试样。使用细胞计数器或血细胞计数器计数淋巴细胞产量，并计算每个样品的细胞浓度。
5. 分选样品制备 - 细胞外染色
   注意:用于细胞外染色主混料的抗体，以及制备可固定活性染料和Fc嵌段溶液的试剂，其浓度足以达到5 x 10⁶ 每100μL细胞，体积应相应调整。对于FACS机器补偿以对ILC1进行分类，需要对细胞外染色主混料中的每个荧光团进行单色对照。对于抗体，可以使用含有阳性抗体结合珠群体和阴性抗体非结合磁珠群体的补偿磁珠。对于紫外 （UV） 可固定活性染料单色对照，可以使用含有胺反应性（对于阳性信号）和非反应性（对于负信号）群体的补偿珠。不建议使用 RORγt^GFP报告小鼠用于UV可固定活性染料的单色对照，因为这些细胞将含有GFP⁺ 信号。
   1. 从每个样品中取出约10μL的小等分试样，并将其池化到含有250μLFACS缓冲液的单独流管中。将管子放在冰上。这将用于未染色的控件。
   2. 向样品管中的剩余体积中加入1 mL PBS。以300-400× g 离心3-5分钟。
   3. 每个样品制备200μL紫外固定活性染料溶液。在PBS中稀释UV可固定活性染料（按照制造商的说明重悬于DMSO中）1:500（或按照制造商的说明）。
   4. 弃去上清液并将样品重悬于200μL紫外可固定活性染料溶液中。涡旋管并在4°C的黑暗中孵育10-15分钟。
   5. 向管中加入2mL FACS缓冲液以淬灭UV可固定的活性染料，涡旋10秒，并在4°C下以300-400× g 离心管3-5分钟。 从离心管中丢弃上清液。
   6. 每个样品制备200μLFc块溶液（FACS缓冲液中0.25mg / mL Fc块）。
   7. 向步骤3.5.5的每个样品中加入200μLFc嵌段溶液，涡旋10秒，并在4°C的黑暗中孵育10分钟。
   8. 向新鲜流管中加入500μLFACS缓冲液。从每个样品中取出2-5μL等分试样，并将其池化到试管中以进行荧光减一（FMO）对照。
   9. 涡旋FMO管10秒，并均匀分布（每管100μL）到为每个FMO对照（谱系鸡尾酒FMO，CD127 FMO，KLRG1 FMO，NKp46 FMO和NK1.1 FMO;见 表3）标记的新鲜流动管中。将除目标抗体以外的所有抗体加入每个试管（如 表3所述）并涡旋10秒。将FMO控制在4°C的黑暗中放在一边。
   10. 将样品（非FMO对照）在4°C下以300-400× g 离心3-5分钟。
   11. 制备细胞外染色主混料（每个样品200μL）与最终抗体稀释液，如 表4所述。根据步骤3.4.10中的细胞计数，调整染色体积以获得适当的细胞浓度（每100μL最多5 x 10⁶ 个细胞）。
   12. 向样品中加入细胞外染色母混料，涡旋10秒，并将其置于4°C的黑暗中。
   13. 为用于门控策略的每种抗体准备新鲜的单色对照（图2）。涡旋抗体补偿珠20秒，向流管中加入1滴微球，用0.5μL抗体染色（如 表2所示，或按照制造商的说明），涡旋10秒。
   14. 使用胺反应性补偿珠试剂盒制备UV可固定活性染料单色对照。涡旋胺反应性补偿珠20 s，加入1μL活/死UV染料（如 表2所示，或按照制造商的说明）并涡旋10s。
   15. 将样品，FMO和单色对照在4°C下在黑暗中孵育30分钟。
   16. 在此期间，准备试管以收集分选的细胞。将高级 DMEM/F12 中 400-500 μL 10% FBS 加入到每个样品的 1.5 mL 试管中。
   17. 孵育后，向每个样品，FMO对照和单色对照中加入2mL PBS2。
   18. 在4°C下以300-400× g 离心样品，FMO对照和单色对照3-5分钟。
   19. 从所有离心管中丢弃上清液。将样品和FMO对照重悬于250μLFACS缓冲液中并涡旋10秒。
   20. 将单色对照重悬于 250 μL PBS2 中。仅向UV可固定活性染料单色对照中加入1滴胺非反应性珠。涡旋所有控件 10 秒。
   21. 单元格现在已准备好进行排序。尽可能将样品、FMO质控品和单色质品放在黑暗中的冰上，以提高细胞活力并防止光漂白造成的信号丢失。

4. 小肠类器官与先天性淋巴细胞共培养

注意:本节描述了分类的小鼠小肠ILC1（根据第3节中的协议分离）与小鼠小肠类器官（在第1节和第2节中描述）的共同培养。类器官应在通过后1-2天使用。共培养包括收获类器官，添加适当数量的ILC1，离心至颗粒状类器官和ILC1，并在TBEM中重悬。隔离 ILC1 后，请尽快完成本节。所有程序都应使用无菌材料和试剂在无菌环境中进行。

1. 确保步骤 3.1.1 中的 TBEM 已解冻。
2. 按照步骤2.3和2.4所述收获1-2天大的类器官。
3. 将类器官沉淀重悬于1 mL冷冰冷的高级DMEM / F12中。在传代类器官时，不要像传递类器官时那样弯曲p1000尖端，因为这里的目的是保持共培养的类器官结构。如果需要，将类器官放在单独的PBS2包被的1.5mL冰管中，短时间分布在不同的共培养条件下。
   注意:只有在ILC样品准备好进行共培养后，才开始制备类器官;在冰上工作，一旦收获了类器官，就迅速工作，以尽量减少上皮细胞死亡。
4. 用每个ILC复制样品的PBS2预涂覆一个1.5 mL管。将约100-200个类器官（约1孔24孔板）分配到每个管中。
5. 在PBS2中预涂p1000吸头，并用它来评估FACS纯化后ILC1的体积（250-300μL+分选体积）。使用从分类中记录的细胞数确定每毫升ILC1的浓度，并确定所需的体积。
6. 使用相同的PBS2涂层p1000吸头，向含有类器官的PBS2涂层1.5 mL管中加入不少于500个ILC1。如果从分类中产生的ILC1s数量小于500，则将类器官直接添加到含有原始分类的管中，以尽量减少转移过程中细胞的损失。
7. 在4°C下以300× g旋转ILC1和类器官5分钟。 如果可能的话，避免使用小直径的台式离心机，因为这些离心机会沿着管内部的边缘聚集细胞，而不是在管的尖端产生沉淀。由于细胞数量非常低，因此在这些步骤中必须最大限度地减少细胞损失。
8. 缓慢而轻柔地去除尽可能多的上清液，而不会干扰沉淀（肉眼可能看不到，特别是在无类器官ILC对照中）。将样品放在冰上。
9. 将冷沉淀重悬于每孔TBEM的30μL中。将管保持在冷表面上（例如，将一小盒冰放在组织培养罩中）时，将类器官和ILC混合至少10-15次以确保均匀分布。经常但轻轻地研磨，以避免破坏类器官和形成气泡。
10. 将TBEM中每孔ILC类器官30μL施用于预热的24或48孔板以形成单个圆顶。直接将板置于培养箱（37°C和5%CO₂）中10-20分钟。
    注意:强烈建议为下游分析设置仅 ILC 和仅类器官对照。ILC1 很少见，但在科学上适当的情况下，GFP-ILC2 可替代免疫荧光或 FSC/SSC 流式细胞术质控品。
11. 加入550μL（每孔）完全ILC1培养基（ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-巯基乙醇;见 表1）与任何所需的实验细胞因子或封闭抗体，并在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
12. 24小时后，轻轻地从培养箱中取出板，让板在组织培养罩中静置1分钟，以确保淋巴细胞沉降。
13. 取出200-250μL培养基，并将其放入24孔板的空孔中。用倒置显微镜检查该上清液，以确保没有淋巴细胞被移除。
    1. 如果上清液是透明的，则在原始孔中加入300μL新鲜ILC1培养基。如果上清液中存在淋巴细胞，则在4°C下以300-400× g 离心3-5分钟，并重悬于300μL新鲜ILC1培养基中，并将其加入原始孔中剩余的200-250μL培养基中。确保每 1-2 天补充一次介质，或在介质变为淡橙色/黄色时补充一次。
       注:不要让介质充分蒸发，以致矩阵圆顶的尖端破坏介质表面。始终确保基质完全浸没。通过使用组织培养板中的中心孔并向周围孔中添加约600μLPBS，可以避免过量蒸发。与成年ILC共培养物稳定1-4天，之后，在没有重大破坏的情况下播种的类器官将破裂并重新播种为新的隐窝。如果分析上皮，建议在建立共培养物后 1-4 天内分析培养物。
    2. 使用免疫荧光、流式细胞术或 FACS 纯化目标群体到裂解缓冲液中进行下游分析，以便通过单细胞或本体 RNA-seq 或 RT-qPCR 进行基因表达分析，如参考文献⁸ 中所述。

结果

成功完成后，新分离的隐窝应在2-4天内形成萌芽的隐窝结构（图1A）。健康和健壮的类器官培养物应积极生长，并可以按照方案中的详细说明进行传代和扩增。

该协议描述了从RORγt^GFP 小鼠转基因报告系中分离小肠ILC1，这允许通过FACS分离活ILC1（图2）。使用此处概述的方案，预期的ILC1计数范围为350-3，500个分离的细胞。

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讨论

该协议描述了建立小鼠小肠类器官的方法，通过在肠道解离方案期间最小化淋巴细胞的丢失来分离罕见的ILC1，并在这两个区室之间建立共培养。该方案有许多步骤，虽然有些步骤特定于ILC1s，但这种方法可以应用于其他肠道免疫细胞类型，并且共培养设置可以模块化地适应个别研究问题。这里重点介绍了几个关键步骤（建议不要偏离），以及该协议中技术上更具挑战性的元素的故障排除指南。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Anti-mouse CD45 (BV510)	BioLegend	103137
Anti-mouse NK1.1 (PE)	Thermo Fisher Scientific	12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC)	Thermo Fisher Scientific	17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-0031-82
CHIR99021	Tocris	4423/10
COLLAGENASE D, 500MG	Merck	11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells	Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)	Merck	4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)	Gibco	11320033
DNASE I, GRADE II	Merck	10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)	Gibco	21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid	Thermo Fisher Scientific	BP2482-100
FC block	2B Scientific	BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated	Gibco	10500064
GlutaMAX (100X)	Gibco	3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X)	Gibco	14065056
HBSS (1X)	Gibco	12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells	Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)	Thermo Fisher Scientific	46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Thermo Fisher Scientific	L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)	Thermo Fisher Scientific	48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
N-acetylcysteine (500mM)	Merck	A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)	Thermo Fisher	25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH	Thermo Fisher Scientific	12549079
PBS (10X)	Gibco	70013032
Percoll	Cytiva	17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein	R&D Systems	AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF	R&D Systems	247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free)	BioLegend	589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)	R&D Systems	407-ML-005/CF
UltraComp eBeads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)	Bio-techne	1254
Plastics
50 mL tube	Falcon	10788561
1.5 mL tube	Eppendorf	30121023
10 mL pippette	StarLab	E4860-0010
15 mL tube	Falcon	11507411
25 mL pippette	StarLab	E4860-0025
p10 pippette tips	StarLab	S1121-3810-C
p1000 pippette tips	StarLab	I1026-7810
p200 pippette tips	StarLab	E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate	Falcon	353047
Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
CO2 and temperature controled incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter	BD equipment	FACS Aria II
Heated shaker	Stuart Equipment	SI500
Ice box	-	-
Inverted light microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette	Eppendorf	3124000016
p1000 pippette	Eppendorf	3124000063
p200 pippette	Eppendorf	3124000032
Pippette gun	Eppendorf	4430000018
Wet ice	-	-