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Resumo

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Resumo

Co-culturas complexas de organoides com células imunes fornecem uma ferramenta versátil para interrogar as interações bidirecionais que sustentam o delicado equilíbrio da homeostase mucosa. Esses sistemas 3D e multicelulares oferecem um modelo reducionista para lidar com doenças multifatoriais e resolver dificuldades técnicas que surgem ao estudar tipos de células raras, como células linfoides inatas residentes em tecido (ILCs). Este artigo descreve um sistema murino que combina organoides intestinais pequenos e ilCs derivados do lic do tipo 1 (ILC1s) do intestino delgado, que podem ser facilmente estendidos a outras populações ILC ou imunológicas. Os ILCs são uma população residente em tecidos que é particularmente enriquecida na mucosa, onde promovem a homeostase e respondem rapidamente a danos ou infecções. Co-culturas organoides com ILCs já começaram a lançar luz sobre novos módulos de sinalização epitelial-imune no intestino, revelando como diferentes subconjuntos iLC impactam a integridade e regeneração da barreira epitelial intestinal. Este protocolo permitirá novas investigações sobre interações recíprocas entre células epiteliais e imunes, que têm o potencial de fornecer novas percepções sobre os mecanismos de homeostase mucosa e inflamação.

Introdução

A comunicação entre o epitélio intestinal e o sistema imunológico residente no intestino é central para a manutenção da homeostase intestinal1. As interrupções nessas interações estão associadas a doenças locais e sistêmicas, incluindo doença inflamatória intestinal (DIB) e cânceres gastrointestinais2. Um exemplo notável de um regulador crítico mais recentemente descrito de homeostase vem do estudo de células linfoides inatas (ILCs), que surgiram como atores-chave na paisagem imunológica intestinal3. ILCs são um grupo de células imunes heterogêneas inatas que regulam a homeostase intestinal e orquestram inflamação em grande parte através da sinalização mediada porcitocinas 4.

Os ILCs murinos são amplamente divididos em subtipos baseados nos perfis de fator de transcrição, receptor e citocina5. Os ILCs tipo 1, que incluem células citotóxicas do Natural Killer (NK) e ILCs tipo 1 (ILC1s) tipo 1, são definidos pela expressão do fator de transcrição (eomesodermina) Eomes e proteína t-box expressa em células T (T-bet)6, respectivamente, e citocinas secretas associadas à imunidade tipo 1 (TH1) auxiliar: interferon-γ (IFNγ) e fator de necrose tumoral (TNF), em resposta à interleucina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante a homeostase, os ILC1s residentes em tecidos secretam o Fator transformador de crescimento β (TGF-β) para impulsionar a proliferação epitelial e a remodelação matricial8. IlCs tipo-2 (ILC2s) respondem principalmente à infecção por helminto por secreção de cytocinas associadas ao auxiliar T-2 (TH2): IL-4, IL-5, e IL-13, e são caracterizados pela expressão do receptor órfão retinóico relacionado ao ácido (ROR) α (ROR-α)9 e GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Em camundongos, iLC2s "inflamatórios" intestinais são ainda mais caracterizados pela expressão do receptor semelhante à lectina celular assassina (membro G subfamília 1, KLRG)13 onde respondem a células epiteliais derivadas il-2514,15. Finalmente, ILCs tipo 3, que incluem células indutoras de tecido linfoide e ILCs tipo 3 (ILC3s), dependem do fator de transcrição ROR-γt16, e agrupam-se em grupos que secretam tanto o Fator Estimulante da Colônia Macifáfica Granulocyte (GM-CSF), IL-17 ou IL-22 em resposta aos sinais locais il-1β e-2317. As células indutoras de tecido linfoide se aglomeram nas manchas de Peyer e são cruciais para o desenvolvimento desses órgãos linfoides secundários durante o desenvolvimento18, enquanto os ILC3s são o subtipo ilc mais abundante no intestino delgado de murina adulto. Um dos primeiros sistemas de cocultura organoide intestinal murina com ILC3s foi aproveitado para provocar o impacto da citocina IL-22 no Transdutor de Sinal e Ativador da Transcrição 3 (STAT-3) mediado leucina-rich Repeat Contendo G Protein Acoplada Receptor 5 (Lgr5)+ proliferação de células-tronco intestinais19, um poderoso exemplo de uma interação regenerativa ILC-epitelial. Os ILCs exibem a heterogeneidade de impressão entre os órgãos20,21 e exibem plasticidade entre subconjuntos em resposta à polarização das citocinas22. O que impulsiona essas impressões específicas do tecido e as diferenças de plasticidade, e qual o papel que desempenham em doenças crônicas como o IBD23, permanecem tópicos emocionantes que poderiam ser abordados usando co-culturas organoides.

Os organoides intestinais emergiram como um modelo bem sucedido e confiável para estudar o epitélio intestinal24,25. Estas são geradas por células-tronco epiteliais intestinais, ou criptas isoladas inteiras, que incluem células paneth como uma fonte endógena do Membro da Família Wnt 3A (Wnt3a). Essas estruturas 3D são mantidas em hidrogéis sintéticos26 ou em biomateriais que imitam a ápula basal de lamina, por exemplo, a Matriz Extracelular Basal (TBEM), e são ainda complementadas com fatores de crescimento que imitam o nicho circundante, mais notavelmente o Fator de Crescimento Epitelial (EGF), o Inibidor de Proteína Morfogenética Óssea (BMP) e um Lgr5-ligante e Wnt-agonista R-Spondin127 . Nessas condições, os organoides mantêm a polaridade epitelial apico-basal e recapitulam a estrutura cript-villi do epitélio intestinal com criptas de células-tronco que se diferenciam terminalmente em células absortivas e secretas no centro da organoide, que então se derramou no pseudolumen interno por anoikis28. Embora os organoides intestinais sozinhos tenham sido extremamente vantajosos como modelos reducionistas de desenvolvimento epitelial e dinâmicaisoladamente 29,30, eles têm um enorme potencial futuro para entender como esses comportamentos são regulados, influenciados ou mesmo interrompidos pelo compartimento imunológico.

No protocolo a seguir, é descrito um método de cocultura entre organoides intestinais murinas pequenas e iLC1s derivados da lamina propria, que foi recentemente usado para identificar como essa população diminui inesperadamente as assinaturas intestinais de inflamação e, em vez disso, contribui para o aumento da proliferação epitelial via TGF-β neste sistema8.

Protocolo

Todos os experimentos devem ser concluídos de acordo com todas as diretrizes regulatórias e institucionais relevantes para o uso animal. A aprovação ética para o estudo descrita no artigo e vídeo a seguir foi adquirida de acordo com todas as diretrizes regulatórias e institucionais relevantes para o uso animal.

Todos os camundongos foram abatidos por luxação cervical de acordo com o procedimento ético padrão, conduzido por indivíduos treinados. Antes da colheita de órgãos e tecidos, foi realizado o corte da artéria femoral ou a decapitação (conforme apropriado ao protocolo em mãos) como avaliações confirmatórias de óbito. Os animais foram alojados em condições específicas sem patógenos (a menos que declarado o contrário) em uma unidade comercial credenciada e na unidade animal do King's College London, de acordo com a Lei de Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986 (Licença de Projeto do Home Office do Reino Unido (PPL:70/7869 a setembro de 2018; P9720273E a partir de setembro de 2018).

1. Estabelecer organoides intestinais murinas

NOTA: Esta seção do protocolo descreve a geração de organoides intestinais a partir do intestino delgado murina. As criptas são primeiro isoladas do tecido, resuspendidas em TBEM e, em seguida, incubadas com mídias contendo EGF, Noggin e R-Spondin (ENR). Estabelecer organoides intestinais murinas também foi bem descrito em outros lugares 24,25,27.

  1. Coloque TBEM no gelo para descongelar (40 μL/well) e coloque um tratamento padrão de cultura tecidual (refere-se a placas com superfície hidrofílica e negativamente carregada) placa de 24 poços em uma incubadora de 37 °C para pré-aquecer.
    NOTA: 500 μL de TBEM descongelará em aproximadamente 2-4 h; não deixá-lo em temperatura ambiente.
  2. Prepare ~4 mL ou 550 mL por poço de meio ENR adicionando EGF, Noggin e R-Spondin ao meio basal (Tabela 1) e coloque em uma incubadora de 37 °C.
  3. Acerde um animal de 6 a 12 semanas e disseque o intestino delgado usando fórceps e tesouras de microdisseção. Coloque-o em 15 mL de Salina Tamponada com Fosfato (PBS) no gelo.
  4. Utilizando o estômago e o caecum como pontos de orientação, isole a região desejada do intestino delgado (duodeno, jejunum ou íleo). Neste protocolo, o íleo é isolado.
  5. Submerse o intestino em PBS em uma placa de Petri de 10 cm2 no gelo. Usando fórceps, remova a gordura suavemente, mas completamente, do intestino.
  6. Corte o tecido longitudinalmente usando tesoura de microdisseção (de preferência com pontas arredondadas para evitar perfuração). Mantendo o intestino submerso na PBS, agite para remover matéria fecal e mantenha o lado mucoso até rastrear a orientação tecidual.
  7. Transfira tecido para a tampa seca de uma placa de Petri no gelo, colocando o lado mucoso/villus do intestino para cima. Segurando uma extremidade do intestino com fórceps, raspe suavemente o muco usando a borda angular de uma lâmina de vidro limpa.
  8. Encha a placa com PBS gelado e enxágue o tecido.
  9. Pré-cubra um tubo de 50 mL com PBS2 (PBS + 2% FCS; consulte a Tabela 1) para evitar a adesão do tecido ao plástico e adicione 10 mL de PBS gelado a este tubo. Corte o intestino em segmentos pequenos (~2 mm) e transfira-os para o tubo de 50 mL pré-revestido com PBS2.
  10. Usando uma pipeta de 25 mL pré-revestida com PBS2, pipeta os segmentos para cima e para baixo 5-10 vezes para limpar os fragmentos de tecido.
  11. Permitir que os segmentos se contentem com 15-30 s, removam e descartem o pbs supernatant, e repita as etapas 1.10 e 1.11 até que a solução esteja clara (aproximadamente 3-4 vezes).
  12. Permita que os segmentos se instalem e descartem o supernatante PBS. Adicione 30 mL de tampão de isolamento de cripta gelada (Tabela 1).
  13. Coloque os tubos em um rolo horizontal ou roqueiro a 30-60 rpm (ou suave) por 30 min a 4 °C. Não incubar a velocidades mais rápidas, temperaturas mais altas ou maior duração, pois as criptas se desalojarão prematuramente e se tornarão células únicas com menor viabilidade e rendimento.
    NOTA: A partir desta fase, todos os procedimentos devem ser realizados em ambiente asséptico utilizando materiais estéreis e reagentes.
  14. Permita que segmentos intestinais se instalem na base do tubo de 50 mL. Remova o buffer de isolamento da cripta sem interromper os segmentos liquidados e transfira-o para um tubo de 50 mL no gelo.
    NOTA: Se o processo de isolamento da cripta fosse muito rigoroso, as criptas podem ser vistas nesta fração. Ele pode, portanto, ser mantido como reserva, mas será descartado no final do protocolo.
  15. Adicione 20 mL de PBS gelado aos segmentos intestinais. Usando uma pipeta de 25 mL pré-revestida com PBS2, segmentos intestinais pipetas para cima e para baixo 5-8 vezes.
  16. Que os segmentos se contentem com 30 s. Pré-cubra um tubo de 50 mL e pipeta de 25 mL com PBS2. Usando esta pipeta, colete o supernatante (fração 1) no tubo pré-revestido de 50 mL e coloque o tubo no gelo.
    NOTA: Esta fração serve para enxaguar o buffer de isolamento de cripta restante. No entanto, também serve como uma etapa adicional de controle de qualidade; se a pipetação foi muito vigorosa, as criptas serão abundantes nesta fração de enxágue, e se fosse muito suave, haverá muito poucos detritos nesta fração. O ideal é que a fração 1 seja descartada no final do protocolo, mas pode ser usada para fazer organoides se surgirem problemas com frações 2-4 obtidas abaixo.
  17. Repita os passos 1.15 e 1.16 mas adicione 10 mL de PBS gelado em vez de 20 mL e coloque o supernascido em um tubo fresco de 50 mL pré-revestido com PBS2 (fração 2).
  18. Repita o passo 1.17 mais duas vezes, mas acumule o supernanato resultante com fração 2 (no mesmo tubo de 50 mL da etapa 1.17) para obter frações 2-4. Este único tubo de 50 mL deve conter as criptas desalojadas em 30 mL de PBS gelado.
  19. Remova uma alíquota de 50 μL das frações agrupadas de 2-4 e coloque-a em uma mancha de cobertura. Avalie a presença de criptas epiteliais usando um microscópio de luz invertida.
    NOTA: Se as criptas não estiverem presentes, repita as etapas 1.17 e 1.18 usando mais força durante a pipetação até que as criptas sejam liberadas. Certifique-se de que as criptas não foram prematuramente desalojadas no buffer de isolamento da cripta a partir da etapa 1.14 ou na fração 1 da etapa 1.16.
  20. Pré-cubra um coador de 100 μm e tubo de 50 mL com PBS2. Passe as frações de cripta agrupadas através deste filtro e no tubo pré-revestido de 50 mL.
  21. Gire frações de criptas tensas a 300 x g por 5 min a 4 °C.
  22. Descarte o supernatante e resuspenque as criptas em 10 mL de DMEM/F12 avançados gelados. Mova as criptas para um tubo de 15 mL.
  23. Gire as criptas a 210 x g por 5 min a 4 °C para remover células únicas e linfócitos.
  24. Resuspend criptas em 1 mL de DMEM/F12 avançados gelados.
  25. Remova uma alíquota de 10 μL e coloque-a em uma mancha de cobertura. Usando um microscópio de luz invertida, conte o número de criptas para determinar a concentração de criptas.
  26. Calcule o volume necessário para ~400 e ~1.500 criptas. Pré-cubra uma dica p1000 com PBS2 e use esta dica para pipeta os volumes necessários (contendo ~400 e ~1.500 criptas) em tubos separados de 1,5 mL.
  27. Gire as criptas a 300 x g por 5 min a 4 °C.
  28. Remova o máximo de supernaspetivo possível e, em seguida, resuspense as criptas em 80 μL de TBEM colocadas no gelo (pontas de pipeta pré-frias a 4 °C para evitar a gelação da matriz, que ocorre a 12 °C).
  29. Retire a placa de 24 poços, colocada na etapa 1.1, da incubadora. Pipeta suavemente 40 μL de criptas no centro de um poço em um movimento lento e circular para formar uma estrutura de cúpula plana, mas 3D, ou em três pequenas cúpulas separadas.
    NOTA: A viabilidade dos organoides é a mais baixa no centro da cúpula onde nutrientes e gases permeiam de forma menos eficaz31; assim, maximizar a área de superfície exposta à mídia, mantendo estruturas 3D claras é fundamental.
  30. Repita o passo 1.29 para criar um total de dois poços com uma densidade de ~200 criptas por poço e mais dois poços com uma densidade de ~750 criptas por poço. Coloque diretamente a placa em uma incubadora (37 °C e 5% DE CO2) por 15-20 min, tomando cuidado para não interromper as cúpulas de matriz viscosa, mas ainda líquida.
  31. Adicione 550 μL de mídia ENR pré-aquecida por poço (a partir da etapa 1.2) e incubar por 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Nesta fase, sugere-se complementar o meio ENR com 5 μM de Agonista Wnt (CHIR 99021) e 5 μM Rho Kinase inibidor (Y-27632) para as primeiras 24h de cultura pós-isolamento para melhorar o rendimento e eficiência da geração organoide de criptas recém-isoladas do tecido.
    NOTA: As criptas devem se aproximar para formar estruturas arredondadas dentro de 24 h, e os botões criptáticos devem aparecer dentro de 2-4 dias (Figura 1A).
  32. Substitua por meio ENR fresco no final da incubação na etapa 1.31, e depois a cada ~2 dias ou quando o indicador de pH fenol no meio de cultura fica laranja pálido, mas antes de ficar amarelo.

2. Manutenção de organoides intestinais pequenos murinos

NOTA: Esta seção do protocolo descreve a manutenção e a passagem de organoides intestinais murinas. Organoides são primeiro colhidos, e depois mecanicamente interrompidos usando uma ponta p1000 dobrada. Este processo quebra grandes organoides que consistem em numerosas criptas em múltiplos fragmentos menores para expansão e libera células mortas que se acumularam no pseudolumen. A manutenção de organoides intestinais de murina também foi bem descrita em outros lugares 24,25,27. Todos os procedimentos devem ser realizados em ambiente asséptico utilizando materiais estéreis e reagentes. Passagem ou expansão organoides uma vez a cada 4-5 dias, antes do estouro dos organoides ocorre de acúmulo substancial de detritos no lúmen organoide. Os organoides podem ser passagemdos a uma razão de 1:2-1:3, dependendo da densidade organoide, que será idealmente entre 100-200 organoides por poço.

  1. Como nas etapas 1.1 e 1.2, descongele TBEM no gelo (40 μL/well) e prepare o meio ENR (550 μL por poço). Coloque a cultura de tecido médio e padrão tratada com placa de 24 poços em uma incubadora de 37 °C.
  2. Remova a placa que contém organoides da incubadora. Descarte a mídia do poço a ser passagem.
  3. Adicione 500 μL de DMEM avançado/F12 gelado ao poço. Usando uma ponta p1000 (pré-revestida com mídia para evitar que organoide grude no interior da ponta), colde os organoides em um tubo de 15 mL.
  4. Enxágüe a parte inferior do poço com 250-300 μL de DMEM/F12 avançados a frio gelado garantindo que não haja organoides no poço, e acumule-se no tubo de 15 mL contendo organoides colhidos a partir da etapa 2.3. Repita as etapas 2.3 e 2.4 ao passar vários poços e acumule os organoides de vários poços no mesmo tubo de 15 mL.
  5. Gire os organoides a 300 x g por 3 min a 4 °C.
  6. Após a centrifugação, certifique-se de que há quatro frações visíveis: uma fração base com organoides saudáveis, uma fração de matriz central e clara, uma fração de matriz contendo células simples e mortas, e uma camada superior sobrenante contendo células simples e mortas. Remova o supernasce, a fração de detritos, e o máximo possível do fragmento de matriz clara sem interromper a pelota de organoides.
  7. Dobre suavemente a ponta de uma ponta de pipeta p1000 (aproximadamente 2-5 mm de dobra). Pré-cubra esta dica em PBS2 ou DMEM/F12 Avançado. Usando esta dica, pipeta os organoides para cima e para baixo 10-20 vezes para interromper mecanicamente os organoides e a matriz restante.
  8. Gire a 210 x g para 3 min a 4 °C.
  9. Como na etapa 2.6, remova o supernasce, a fração de detritos e o máximo possível do fragmento de matriz clara sem interromper a pelota de criptas dissociadas. Se criptas saudáveis ou organoides pequenos não tiverem formado uma pelota clara, centrífuga novamente a 300 x g por 3 min a 4 °C.
  10. Calcule o volume necessário de TBEM (80-120 μL por poço de organoides colhidos, dependendo se é utilizada uma razão de passagem de 1:2 ou 1:3).
  11. Resuspenque a pelota no volume calculado de TBEM e aplique 40 μL por poço na placa pré-aquecida de 24 poços para formar uma cúpula. Coloque diretamente a placa na incubadora (37 °C; 5% CO2) por 15-20 min.
  12. Adicione 550 μL de meio ENR por poço e incubar a 37 °C e 5% de CO2. Verifique culturas para formação organoide após 24 h. Substitua por meio ENR fresco a cada 2-3 dias de passagem pós.

3. Isolamento de pequenas células linfoides inatas de lamina intestinal

NOTA: Esta seção do protocolo descreve o isolamento do ILC1 da lamina de lamina do intestino delgado murina dos ratos repórteres RORγtGFP. Isso envolve remoção de células epiteliais, digestão tecidual, separação gradiente de densidade de linfócitos e isolamento ILC1 via triagem celular ativada por fluorescência (FACS). O isolamento FACS seguindo a estratégia de gating na Figura 2 requer o mastermix de coloração extracelular (Tabela 4), com os controles adicionais de coloração descritos na Tabela 2 e Tabela 3 para a máquina (Tabela 2) e gating (Tabela 3) configurados. Os ratos repórteres RORγtGFP são usados para isolar ilc1 ao vivo, puro e portar RORγtGFP+ ILC3. O processamento tecidual para isolamento de linfócitos de lamina propria também foi bem descrito em outros lugares32.

  1. Processamento de tecidos
    NOTA: O tecido das réplicas individuais de animais biológicos é mantido separado neste protocolo. Estas amostras devem ser adequadamente rotuladas e mantidas no gelo sempre que possível. Todos os reagentes, exceto as enzimas de digestão, devem ser autorizados a atingir a temperatura ambiente para garantir a digestão rápida do tecido.
    1. Coloque TBEM no gelo para descongelar (40 μL/well). Mantenha uma placa padrão de cultura tecidual tratada com 24 poços em uma incubadora de 37 °C para pré-aquecer.
    2. Prepare o tampão de remoção epitelial fresco e o tampão de digestão (ver Tabela 1). Prepare o gradiente isotônico de baixa densidade de densidade (LVDGM) (90% LVDGM e 10% 10x PBS), 40% isotônico LVDGM e LVDGM isotônico de 80% em tampão neutralizante (Tabela 1).
    3. Cull um animal de 6-12 semanas de idade, disseque o intestino delgado usando fórceps e tesouras de microdisseção, e coloque o intestino em 15 mL de PBS no gelo.
    4. Submerque o intestino em PBS em uma placa de Petride 10 cm no gelo e use fórceps para remover gordura suavemente, mas completamente do intestino.
    5. Remova as manchas de Peyer (~5-10; correndo em uma linha oposta à linha do tecido adiposo) usando tesouras de microdisseção para esgotar células indutoras de tecido linfoide e células B.
      NOTA: As manchas de Peyer estão ausentes em Rag-/- e outros animais esgotados de linhagem. Ao contrário das bolhas de ar, as manchas de Peyer permanecerão no lugar se forem cutucadas.
    6. Corte o tecido longitudinalmente usando tesoura de microdisseção (de preferência com pontas arredondadas para evitar perfuração). Mantendo o intestino submerso na PBS, agite para remover matéria fecal.
    7. Corte o tecido em pedaços de 2-4 cm de comprimento e transfira-os para um tubo de 50 mL.
    8. Adicione aproximadamente 20-40 mL de PBS gelado e agite vigorosamente por 5-15 s para remover mucoso e detritos.
    9. Descarte o conteúdo do tubo em uma placa de Petri fresca e substitua fragmentos intestinais no mesmo tubo de 50 mL usando fórceps.
    10. Repita as etapas 3.1.8 e 3.1.9 3-4 vezes, ou até que o PBS esteja limpo.
  2. Remoção de epitélio
    1. Coloque fragmentos intestinais em uma placa de Petri fresca no gelo. Usando fórceps, pegue segmentos intestinais e remova o excesso de líquido tocando em uma superfície seca.
    2. Corte o tecido em pedaços de ~0,75-1 cm e transfira-os para um tubo fresco de 50 mL. Adicione 5-7 mL de tampão de remoção epitelial (Tabela 1). Vórtice do tubo e certifique-se de que todos os segmentos intestinais estejam submersos no tampão.
    3. Incubar as amostras a 37 °C com balanço (100-150 rpm) por 12-15 min. Vórtice do tubo para 20-30 s.
    4. Repita as etapas 3.2.1-3.2.3 mais uma vez, descartando o sobrenante nublado (fração contém células epiteliais e intra-epiteliais) e substituindo-o por um tampão de remoção epitelial fresco.
  3. Digestão do tecido
    1. Coloque o conteúdo em uma placa de Petri fresca. Usando fórceps, pegue os segmentos intestinais e bata em uma superfície seca para descartar o excesso de líquido. Coloque os segmentos em uma placa de Petri fresca no gelo.
    2. Aglomerado os segmentos no centro da placa de Petri em uma massa densa. Usando dois bisturis ou tesouras afiadas, desfie finamente o tecido até atingir uma consistência viscosa que poderia passar por uma ponta de pipeta p1000.
    3. Usando pinças, coloque o tecido picado em um tubo limpo de 50 mL. Enxágüe a placa de Petri com 1-2 mL de tampão de digestão (Tabela 1) para coletar qualquer tecido restante e junte-o no tubo de 50 mL com o tecido desfiado.
    4. Adicione 5-7 mL de tampão de digestão ao tecido desfiado e certifique-se de que todo o tecido seja coletado na parte inferior do tubo.
    5. Incubar as amostras a 37 °C, com balanço médio (~100-150 rpm) por 15 min. Vórtice o tubo para 20-30 s a cada 5 minutos para ajudar na digestão.
    6. Enquanto as amostras estão incubando, coloque um coador de células de 40 μm em cima de um tubo fresco de 50 mL para cada amostra. Cubra os filtros com 1-2 mL de tampão neutralizante (Tabela 1).
    7. Vórtice as amostras para 20-30 s após o término da incubação.
    8. Filtre o tecido parcialmente digerido através do filtro revestido de 40 μm no tubo de 50 mL contendo tampão neutralizante.
    9. Use pinças para coletar tecido não digerido do filtro de 40 μm e colocá-lo de volta no tubo de 50 mL em que a digestão foi realizada, para a segunda rodada de digestão. Remova os filtros e enxágue-os com tampão de digestão para desalojar qualquer tecido não digerido aderindo ao filtro.
    10. Uma vez que o máximo de tecido não digerido possível tenha sido removido do filtro e colocado de volta no tubo de 50 mL em que a digestão foi realizada, enxágue o filtro com tampão neutralizante de 1-2 mL sobre o tubo de 50 mL contendo o supernatante filtrado.
    11. Adicione 20-25 mL de tampão neutralizante ao supernanato filtrado e coloque-o no gelo para manter a viabilidade de células isoladas durante a segunda rodada de digestão tecidual.
    12. Adicione mais 5-10 mL de tampão de digestão ao tecido não digerido e repita as etapas 3.3.5-3.3.10, garantindo filtrar o tecido digerido no mesmo tubo usado na etapa 3.3.8 (o mesmo filtro também pode ser reutilizado). Enxágüe o filtro com tampão neutralizante até que a linha de 50 mL seja atingida e, em seguida, descarte qualquer tecido não digerido restante.
  4. Isolamento de linfócitos por gradiente de densidade
    1. Gire os supernantes coletados para cada réplica biológica a 500 x g por 10 min.
    2. Durante a etapa 3.4.1, adicione 5 mL de 80% isotônico LVDGM a um tubo de 15 mL para cada réplica biológica.
    3. Após a centrifugação, descarte o sobrenante do tecido filtrado e digerido. Resuspenja a pelota em 10 mL de 40% isotônico LVDGM, garantindo que a pelota esteja bem homogeneizada, e não restem grandes pedaços.
    4. Ajuste o auxílio pipeta ao seu ajuste mais lento, incline o tubo de 15 mL contendo lvdgm isotônico de 80% e sobreponha suavemente os 10 mL de suspensão celular em 40% isotônico LVDGM garantindo que a suspensão da célula não se misture com a fração de 80%.
      NOTA: Se as frações se misturarem acidentalmente, distribua rapidamente linfócitos que atingiram a fração de 80% entre dois tubos de 50 mL preenchidos com PBS e centrífuga por 10 min a 500 x g. Em seguida, descarte o supernaspe e repita as etapas 3.4.3-3.4.4.
    5. Gire os tubos a 900 x g e 20 °C, com a aceleração e a desaceleração definidas para o ajuste mais baixo para garantir que as frações não sejam interrompidas. Centrífuga por 20 min (sem incluir o tempo de intervalo).
      NOTA: Todos os procedimentos a partir desta etapa devem ser realizados em uma capa de cultura de tecido asséptico utilizando materiais estéreis e reagentes.
    6. Pré-cubra um tubo de 50 mL para cada amostra com PBS2 e adicione 45 mL de PBS gelado.
    7. Após a centrifugação, remova suavemente a camada superior de detritos do tubo de 15 mL. Cubra uma ponta p1000 com PBS2 e use-a para coletar a interfase carregada de linfócitos entre os gradientes de 40%-80% no tubo de 50 mL contendo 45 mL de PBS gelado.
    8. Gire os tubos a 300 x g por 5 min a 4 °C.
    9. Descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em 500 μL de tampão FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA e 10 mM HEPES; ver Tabela 1). Pré-cubra um filtro de 40 μm com tampão FACS e use-o para filtrar a suspensão da célula em um tubo de fluxo. Enxágüe o tubo de 50 mL com um adicional de 500 μL de tampão FACS e filtre-se no mesmo tubo de fluxo.
    10. Remova uma alíquota de 10 μL da suspensão celular resultante de 1 mL. Conte o rendimento do linfócito usando um contador celular ou hemócito e calcule a concentração celular para cada amostra.
  5. Preparação da amostra para classificação - coloração extracelular
    NOTA: Os anticorpos utilizados no mastermix de coloração extracelular, bem como os reagentes para preparar o corante de viabilidade fixável e a solução de bloco Fc, são usados em concentrações suficientes para até 5 x 106 células por 100 μL. Os volumes devem ser ajustados em conformidade. Para a compensação da máquina FACS para classificar iLC1, são necessários controles de cor única para cada um dos fluoroforos no mastermix de coloração extracelular. Para os anticorpos, podem ser utilizadas contas de compensação que contenham uma população de contas de ligação de anticorpos positivos e uma população negativa de contas não vinculantes. Para o ultravioleta (UV) controle de cor única de coloração fixável (UV), podem ser utilizadas contas de compensação que contenham populações amina-reativas (para sinal positivo) e não reativas (para sinal negativo). Não é recomendado usar células do RORγtGFPratos repórteres para o UV fixável viabilidade corante controle de cor única, como essas células conterão um GFP+ sinal.
    1. Remova uma pequena alíquota de ~10 μL de cada amostra e lavoça-a em um tubo de fluxo separado contendo 250 μL de tampão FACS. Coloque o tubo no gelo. Isto será usado para o controle não manchado.
    2. Adicione 1 mL de PBS ao volume restante nos tubos de amostra. Centrífuga a 300-400 x g por 3-5 min.
    3. Prepare 200 μL de solução de corante de viabilidade fixável UV por amostra. Diluir o corante de viabilidade fixável UV (resuspensado no DMSO seguindo as instruções do fabricante) 1:500 em PBS (ou seguindo as instruções do fabricante).
    4. Descarte o supernatante e resuspenque as amostras em 200 μL de solução de corante de viabilidade fixável UV. Vórtice os tubos e incubar no escuro a 4 °C por 10-15 min.
    5. Adicione 2 mL de tampão FACS aos tubos para saciar o corante de viabilidade fixável UV, vórtice para 10 s e centrífugas nos tubos a 300-400 x g por 3-5 min a 4 °C. Descarte o supernatante dos tubos centrifugados.
    6. Prepare 200 μL de solução de bloco Fc por amostra (0,25 mg/mL de bloco Fc no buffer FACS).
    7. Adicione 200 μL de solução de bloco Fc a cada uma das amostras da etapa 3.5.5, vórtice para 10 s, e incubar no escuro a 4 °C por 10 minutos.
    8. Adicione 500 μL de tampão FACS a um tubo de fluxo fresco. Remova uma alíquota de 2-5 μL de cada amostra e lavoça-a no tubo para os controles de fluorescência menos um (FMO).
    9. Vórtice do tubo FMO para 10 s e distribua uniformemente (100 μL por tubo) em tubos de fluxo fresco rotulados para cada um dos controles FMO (coquetel de linhagem FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO e FMO NK1.1; ver Tabela 3). Adicione todos os anticorpos, exceto o anticorpo de interesse a cada tubo (como descrito na Tabela 3) e vórtice para 10 s. Coloque os controles FMO de lado no escuro a 4 °C.
    10. Centrifugar as amostras (não controles FMO) a 300-400 x g para 3-5 min a 4 °C.
    11. Prepare o mastermix de coloração extracelular (200 μL por amostra) com as diluições finais de anticorpos conforme descrito na Tabela 4. Ajuste o volume de coloração para a concentração celular apropriada (até 5 x 106 células por 100 μL) dependendo da contagem celular da etapa 3.4.10.
    12. Adicione o mastermix de coloração extracelular às amostras, vórtice para 10 s, e coloque-os de lado no escuro a 4 °C.
    13. Prepare um novo controle de cor único para cada anticorpo destinado a ser usado na estratégia de gating (Figura 2). Contas de compensação de anticorpos vórtices para 20 s, adicionar 1 gota de contas a um tubo de fluxo, mancha com 0,5 μL de anticorpo (como mostrado na Tabela 2, ou seguindo as instruções do fabricante) e vórtice para 10 s.
    14. Prepare um controle de cor de cor única de cor de coloração fixável UV usando um kit de contas de compensação amina-reativa. Contas de compensação amina-reativa vortex para 20 s, adicione 1 μL de corante UV Vivo/Morto (como mostrado na Tabela 2, ou seguindo as instruções do fabricante) e vórtice para 10 s.
    15. Incubar as amostras, FMOs e controles de cor única no escuro por 30 min a 4 °C.
    16. Durante este tempo, prepare tubos para coletar as células classificadas. Adicione 400-500 μL de 10% de FBS em tubos avançados de DMEM/F12 a 1,5 mL para cada amostra.
    17. Após a incubação, adicione 2 mL de PBS2 a cada uma das amostras, controles FMO e controles de cor única.
    18. Centrifugar as amostras, controles FMO e controles de cor única a 300-400 x g por 3-5 min a 4 °C.
    19. Descarte o supernatante de todos os tubos centrífugas. Resuspenda as amostras e controles FMO em 250 μL de tampão FACS e vórtice para 10 s.
    20. Resuspenda os controles de cor única em 250 μL de PBS2. Adicione apenas 1 gota de contas não reativas de amina ao controle de cor de cor única de cor fixável UV. Vórtice todos os controles para 10 s.
    21. As células estão prontas para serem classificadas. Mantenha amostras, controles de FMO e controles de cor única no gelo no escuro sempre que possível para melhorar a viabilidade celular e evitar a perda de sinal de fotobleaching.

4. Co-cultura de pequenos organoides intestinais com células linfoides inatas

NOTA: Esta seção descreve a co-cultura de murine pequena iLC1 (isolada seguindo o protocolo na seção 3) com organoides intestinais murinas (descritos nas seções 1 e 2). Os organoides devem ser usados de forma ideal 1-2 dias após a passagem. A cocultura envolve a colheita dos organoides, adicionando o número apropriado de ILC1, centrifugando para organoides de pelotização e ILC1 juntos, e resususcupação no TBEM. Complete esta seção o mais rápido possível, uma vez que o ILC1 tenha sido isolado. Todos os procedimentos devem ser realizados em ambiente asséptico utilizando materiais estéreis e reagentes.

  1. Certifique-se de que o TBEM da etapa 3.1.1 foi descongelado.
  2. Colher organoides de 1 a 2 dias de idade, conforme descrito nas etapas 2.3 e 2.4.
  3. Resuspend a pelota organoide em 1 mL de DMEM/F12 avançado frio frio. Não dobre a ponta p1000 como feito ao passar os organoides, pois a intenção aqui é manter a estrutura organoide para a cocultura. Se necessário, coloque os organoides em tubos separados pbs2 revestidos de 1,5 mL no gelo por um curto período a ser distribuído entre diferentes condições de co-cultura.
    NOTA: Só comece a preparação de organoides quando as amostras de ILC estiverem prontas para a cocultura; trabalhar no gelo e rapidamente assim que os organoides foram colhidos para minimizar a morte das células epiteliais.
  4. Pré-reveste um tubo de 1,5 mL com PBS2 por amostra de réplica ILC. Distribua ~100-200 organoides (aproximadamente 1 poço de uma placa de 24 poços) em cada tubo.
  5. Pré-cubra uma dica p1000 no PBS2 e use-a para avaliar o volume de ILC1s após a purificação facs (250-300 μL + volume ordenado). Determine a concentração de ILC1 por mL usando o número de células registradas do tipo e determine o volume necessário.
  6. Usando a mesma ponta p1000 revestida pbs2, adicione nada menos que 500 ILC1s ao tubo pbs2 revestido de 1,5 mL contendo os organoides. Se o número de ILC1s obtidos do tipo for inferior a 500, adicione o organoide diretamente ao tubo contendo o tipo original para minimizar a perda de células da transferência.
  7. Gire iLC1 e organoides a 300 x g por 5 min a 4 °C. Se possível, evite centrífugas de mesa de pequeno diâmetro, pois elas irão agrupar as células ao longo da borda do interior do tubo, em vez de criar uma pelota na ponta do tubo. Como os números de células são muito baixos, é imprescindível minimizar a perda de células durante essas etapas.
  8. Lentamente e suavemente remova o máximo possível do supernante sem perturbar a pelota (que pode não ser visível pelos olhos, especialmente em controles não organoides somente ILC). Coloque a amostra no gelo.
  9. Resuspenda a pelota fria em 30 μL por poço de TBEM. Enquanto segura o tubo em uma superfície fria (por exemplo, uma pequena caixa de gelo colocada na capa da cultura do tecido), misture os organoides e o ILC pelo menos 10-15 vezes para garantir uma distribuição uniforme. Triturar com frequência, mas suavemente, para evitar danificar os organoides e a formação de bolhas.
  10. Aplique 30 μL por poço de ILC-organóides em TBEM a uma placa pré-aquecida de 24 ou 48 poços para formar uma única cúpula. Coloque diretamente a placa na incubadora (37 °C e 5% DE CO2) por 10-20 min.
    NOTA: Recomenda-se fortemente que os controles somente ILC e organoides sejam configurados para análise a jusante. ILC1 são raros, mas o GFP-ILC2 pode ser substituído por controles de imunofluorescência ou citometria de fluxo FSC/SSC quando cientificamente apropriado.
  11. Adicione 550 μL (por bem) de meio ILC1 completo (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol; ver Tabela 1) com quaisquer citocinas experimentais desejadas ou anticorpos de bloqueio e incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
  12. Depois de 24 horas, retire suavemente a placa da incubadora e deixe que a placa fique em uma capa de cultura de tecido por 1 minuto para garantir que os linfócitos sejam assentados.
  13. Remova 200-250 μL de mídia e coloque-o em um poço vazio de uma placa de 24 poços. Verifique este supernatante com um microscópio invertido para garantir que nenhum linfócito foi removido.
    1. Se o supernante estiver claro, adicione 300 μL de meio ILC1 fresco à co-cultura no poço original. Se os linfócitos estiverem presentes no supernatante, centrífuga a 300-400 x g para 3-5 min a 4 °C e resuspend em 300 μL de meio ILC1 fresco e adicione isso aos 200-250 μL restantes de mídia no poço original. Certifique-se de repor a mídia a cada 1-2 dias ou quando a mídia se tornar laranja-pálida/amarela.
      NOTA: Não permita que a mídia evapore o suficiente para que a ponta da cúpula da matriz quebre a superfície da mídia. Certifique-se sempre de que a matriz está completamente submersa. O excesso de evaporação pode ser evitado usando poços centrais nas placas de cultura tecidual e adicionando ~600 μL de PBS aos poços circundantes. As co-culturas com ILC adulto são estáveis por 1-4 dias, após o qual os organoides que foram semeados sem grandes interrupções se romperão e se ressarem como novas criptas. Se analisar o epitélio, recomenda-se que as culturas sejam analisadas dentro de 1 a 4 dias após o estabelecimento de coculturas.
    2. Realize a análise a jusante utilizando imunofluorescência, citometria de fluxo ou purificação FACS de populações-alvo em tampão de lise para análise de expressão genética por célula única ou RNA-seq ou RT-qPCR, conforme descrito na referência8.

Resultados

Quando concluídas com sucesso, criptas recém-isoladas devem formar estruturas criptas brotantes dentro de 2-4 dias (Figura 1A). Culturas organoides saudáveis e robustas devem estar crescendo ativamente e podem ser passagemdas e expandidas conforme detalhado no protocolo.

Este protocolo descreve o isolamento do pequeno ILC1 intestinal da linha de repórter transgênico murina murina RORγtGFP , que permite o isolamento do ILC1 vivo pelo FACS (

Discussão

Este protocolo descreve os métodos para estabelecer organoides do intestino delgado murina, isolando iLC1 raro minimizando a perda de linfócitos durante o protocolo de dissociação intestinal, e estabelecendo co-culturas entre esses dois compartimentos. Existem muitos passos para este protocolo, e embora alguns sejam específicos para iLC1s, essa abordagem pode ser aplicada a outros tipos de células imunes intestinais, e as configurações de co-cultura podem ser adaptadas modularmente para se adequar a questões ind...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

E.R. reconhece uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconhece uma bolsa de doutorado da Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconhece um doutorado do NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconhece uma Bolsa Marie Skłodowska-Curie, uma bolsa do King's Prize, uma bolsa do Fundo RCUK/UKRI RutherfordRI (MR/R024812/1) e um Prêmio semente em Ciência do Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Agradecemos também à equipe do núcleo de citometria de fluxo brc sediada no Hospital Guy. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 repórteres ratos foram um presente generoso de G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, França). Os ratos CD45.1 C57BL/6 foram gentilmente dados por T. Lawrence (King's College London, Londres) e P. Barral (King's College London, Londres).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
2-MercaptoethanolGibco21985023
Anti-mouse CD45 (BV510)BioLegend103137
Anti-mouse NK1.1 (PE)Thermo Fisher Scientific12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC)Thermo Fisher Scientific17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0031-82
CHIR99021Tocris4423/10
COLLAGENASE D, 500MGMerck11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T CellsCell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)Merck4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)Gibco11320033
DNASE I, GRADE IIMerck10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)Gibco21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate AcidThermo Fisher ScientificBP2482-100
FC block2B ScientificBE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivatedGibco10500064
GlutaMAX (100X)Gibco3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X)Gibco14065056
HBSS (1X)Gibco12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc CellsCell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M)Gibco15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)Thermo Fisher Scientific46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationThermo Fisher ScientificL23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231
N-2 Supplement (100X)Gibco17502048
N-acetylcysteine (500mM)MerckA9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)Thermo Fisher25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pHThermo Fisher Scientific12549079
PBS (10X)Gibco70013032
PercollCytiva17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free ProteinR&D SystemsAFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CFR&D Systems247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free)BioLegend589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)R&D Systems407-ML-005/CF
UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Bio-techne1254
Plastics
50 mL tubeFalcon10788561
1.5 mL tubeEppendorf30121023
10 mL pippetteStarLabE4860-0010
15 mL tubeFalcon11507411
25 mL pippetteStarLabE4860-0025
p10 pippette tipsStarLabS1121-3810-C
p1000 pippette tipsStarLabI1026-7810
p200 pippette tipsStarLabE1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plateFalcon353047
Equipment
CentrifugeEppendorf5810 R
CO2 and temperature controled incubatorEppendorfGalaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular SorterBD equipmentFACS Aria II
Heated shakerStuart EquipmentSI500
Ice box--
Inverted light microscopeThermo Fisher ScientificEVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippetteEppendorf3124000016
p1000 pippetteEppendorf3124000063
p200 pippetteEppendorf3124000032
Pippette gunEppendorf4430000018
Wet ice--

Referências

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