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要約

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。

要約

オルガノイドと免疫細胞との複雑な共培養は、粘膜恒常性の微妙なバランスを支える双方向相互作用を調査するための汎用性の高いツールを提供します。これらの3D多細胞システムは、多因子疾患に対処し、組織常駐先天性リンパ球細胞(ILC)などの希少細胞型を研究する際に生じる技術的困難を解決するための還元主義モデルを提供します。この記事では、小腸オルガノイドと小腸粘膜固有層由来ヘルパー様1型ILC(ILC1s)を組み合わせたマウス系について説明し、他のILCまたは免疫集団に容易に拡張することができる。ILCは、粘膜に特に富む組織常駐集団であり、恒常性を促進し、損傷または感染に迅速に反応する。ILCとのオルガノイド共培養は、腸内の新しい上皮免疫シグナル伝達モジュールにすでに光を当て始めており、異なるILCサブセットが腸上皮バリアの完全性と再生にどのように影響するかを明らかにしています。このプロトコルは、粘膜恒常性と炎症のメカニズムに関する新しい洞察を提供する可能性を秘めた上皮細胞と免疫細胞との間の相互相互作用のさらなる研究を可能にする。

概要

腸上皮と腸常駐免疫系との間のコミュニケーションは、腸の恒常性の維持の中心である1。これらの相互作用の中断は、炎症性腸疾患(IBD)および胃腸癌を含む局所疾患および全身性疾患の両方と関連している2。ホメオスタシスの重要な調節因子の注目すべき例は、腸の免疫ランドスケープにおける主要なプレーヤーとして出現した先天性リンパ球細胞(ILC)の研究から来ている3。ILCは、腸の恒常性を調節し、主にサイトカイン媒介シグナル伝達を介して炎症を調節する異種自然免疫細胞のグループである4。

マウスILCは、転写因子、受容体、およびサイトカイン発現プロファイルに基づいてサブタイプに大別される5。細胞傷害性ナチュラルキラー(NK)細胞およびヘルパー様1型ILC(ILC1s)を含む1型ILCは、それぞれT細胞(T-bet)6で発現される転写因子(エオメソダーミン)EomesおよびT-boxタンパク質の発現によって定義され、Tヘルパー1型(TH1)免疫に関連するサイトカインを分泌する:インターフェロン-γ(IFNγ)および腫瘍壊死因子(TNF)は、インターロイキン(IL)-12に応答して、 IL-15およびIL-187.恒常性維持の間、組織常駐型ILC1はトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)を分泌し、上皮増殖およびマトリックスリモデリングを促進する8。2型ILC(ILC2s)は、主にTヘルパー2型(TH2)関連サイトカイン(IL-4、IL-5、およびIL-13)の分泌を介して蠕虫感染に応答し、レチノイン酸関連オーファン受容体(ROR)α(ROR-α)9およびGATA結合タンパク質3(GATA-3)の発現によって特徴付けられる10、11、12.マウスにおいて、腸管「炎症性」ILC2sは、キラー細胞レクチン様受容体(サブファミリーGメンバー1、KLRG)13の発現によってさらに特徴付けられ、そこでは上皮房細胞由来IL−25に応答する14、15。最後に、リンパ組織誘導細胞およびヘルパー様3型ILC(ILC3s)を含む3型ILCは、転写因子ROR-γt16に依存しており、局所IL-1βおよびIL-23シグナルに応答して顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、IL-17、またはIL-22のいずれかを分泌する群にクラスター化される17。リンパ組織誘導細胞はパイエル板に集積し、発生中のこれらの二次リンパ器官の発達に重要である18が、ILC3は成体マウス小腸粘膜固有層において最も豊富なILCサブタイプである。ILC3sを用いた最古のマウス腸管オルガノイド共培養系の1つは、再生ILC-上皮相互作用の強力な例であるGタンパク質共役受容体5(Lgr5)+腸幹細胞増殖19を含む転写3(STAT-3)のシグナルトランスデューサおよびアクチベーターに対するサイトカインIL-22の影響を引き離すために利用された。ILCは、器官20,21間にインプリント不均一性を示し、分極サイトカイン22に応答してサブセット間で可塑性を示す。これらの組織特異的な痕跡と可塑性の違いを駆動するもの、およびIBD23などの慢性疾患においてそれらが果たす役割は、オルガノイド共培養を使用して対処できるエキサイティングなトピックのままです。

腸管オルガノイドは、腸上皮を研究するための成功し、信頼できるモデルとして浮上している24、25。これらは、腸上皮Lgr5+幹細胞、またはWntファミリーメンバー3A(Wnt3a)の内因性供給源としてパネス細胞を含む単離された陰窩全体を培養することによって生成される。これらの3D構造は、合成ヒドロゲル26または基底粘膜固有層を模倣する生体材料、例えば熱架橋基礎細胞外マトリックス(TBEM)のいずれかで維持され、さらに周囲のニッチを模倣する成長因子、特に上皮成長因子(EGF)、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤ノギン、およびLgr5リガンドおよびWntアゴニストR-Spondin127で補充される。.これらの条件下では、オルガノイドは上皮アピコ基底極性を維持し、オルガノイドの中心で吸収性および分泌性細胞に最終的に分化する出芽幹細胞陰窩を用いて腸上皮の陰窩絨毛構造を反復し、次いでアノイキス28によって内部偽腔に放出される。腸オルガノイドだけでも、上皮の発達とダイナミクスの還元主義モデルとして非常に有利であったが29,30、これらの行動が免疫区画によってどのように調節され、影響を受け、あるいは破壊されるかを理解するための途方もない将来の可能性を秘めている。

以下のプロトコールでは、マウス小腸オルガノイドと固有層由来ILC1sとの間の共培養の方法が記載されており、これは最近、この集団が炎症の腸シグネチャを予期せず減少させ、代わりにこのシステムにおけるTGF−β を介 した上皮増殖の増加に寄与する方法を特定するために使用された8。

プロトコル

すべての実験は、動物の使用に関連するすべての規制および機関のガイドラインに従って完了する必要があります。以下の記事およびビデオに記載されている研究の倫理的承認は、動物使用に関連するすべての規制および機関のガイドラインに従って取得されました。

すべてのマウスは、訓練された個体によって実施された標準的な倫理的手順に従って、子宮頸部脱臼によって淘汰された。臓器および組織の採取前に、死亡の確認的評価として、大腿動脈のスライスまたは断頭を(手元のプロトコルに適宜)実施した。動物は、1986年英国動物(科学的手続き)法(英国内務省プロジェクトライセンス(PPL:70/7869〜2018年9月;P9720273E 2018年9月より)。

1. マウス小腸オルガノイドの確立

注:プロトコルのこのセクションは、マウス小腸からの腸オルガノイドの生成を説明する。陰窩は、最初に組織から単離され、TBEMに再懸濁され、次いで、EGF、ノギン、およびR−スポンジン(ENR)を含む培地と共にインキュベートされる。マウス小腸オルガノイドの樹立は、他の場所でも十分に記載されている24、25、27。

  1. TBEMを氷上に置き解凍(40 μL/ウェル)し、標準的な組織培養処理した24ウェルプレート(親水性で負に帯電した表面を有するプレートを指す)を37°Cのインキュベーターに入れて予備加温する。
    注:500μLのTBEMは約2〜4時間で解凍します。室温で放置しないでください。
  2. EGF、ノギン、およびR-スポンジンを基礎培地に添加してENR培地のウェルあたり約4 mLまたは550 mLを調製し(表1)、37°Cのインキュベーターに入れます。
  3. 生後6〜12週の動物をカリングし、鉗子と微小解剖ハサミを使用して小腸を解剖する。氷上の15mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。
  4. 胃とカエカムを配向点として使用して、小腸の所望の領域(十二指腸、空腸、または回腸)を単離する。このプロトコルでは、回腸は単離される。
  5. 氷の上の10cm2ペトリ皿のPBSに腸を浸します。鉗子を使用して、腸から脂肪を優しく、しかし完全に取り除きます。
  6. 微小解剖はさみを使用して組織を縦方向に切断する(好ましくは、ミシン目を避けるために丸みを帯びた先端を有する)。腸をPBSに沈めたままにし、振って糞便を除去し、粘液側を上に維持して組織の向きを追跡します。
  7. 氷の上のペトリ皿の乾燥した蓋に組織を移し、腸の粘液/絨毛を上に置きます。腸の一方の端を鉗子で持ち、きれいなスライドガラスの斜めの端を使って粘液を優しくこすり落とします。
  8. プレートを氷冷PBSで満たし、組織をすすいでください。
  9. 50 mL チューブを PBS2 (PBS + 2% FCS; 表 1 を参照) でプレコートして、プラスチックへの組織の付着を防ぎ、このチューブに 10 mL の氷冷 PBS を追加します。腸を小さな(〜2mm)セグメントに切断し、PBS2でプレコーティングした50mLチューブに移す。
  10. PBS2で予めコーティングされた25mLピペットを用いて、セグメントを上下5〜10回ピペットし、組織断片を洗浄した。
  11. セグメントを15〜30秒間落ち着かせ、PBS上清を除去して廃棄し、溶液が透明になるまでステップ1.10および1.11を繰り返します(約3〜4回)。
  12. セグメントが沈降し、PBS上清を廃棄するのを許します。30mLの氷冷陰窩分離緩衝液を加える(表1)。
  13. チューブを水平ローラーまたはロッカーに30~60rpm(または緩やか)で4°Cで30分間置きます。 より速い速度、より高い温度、またはより長い持続時間でインキュベートしないでください、それは陰窩が時期尚早に外れて生存率と収量の低い単一細胞になるからです。
    注:この段階以降、すべての手順は、滅菌材料および試薬を使用して無菌環境で実施する必要があります。
  14. 腸管が50mLチューブの基部に沈降するのを許す。沈降したセグメントを中断することなく陰窩分離バッファーを除去し、氷上の50mLチューブに移す。
    注: 暗号分離プロセスが厳しすぎると、この部分に暗号が見られることがあります。したがって、リザーブとして保持することはできますが、プロトコルの最後に最適に破棄されます。
  15. 20mLの氷冷PBSを腸管セグメントに加える。PBS2で予めコーティングされた25mLピペットを用いて、腸管セグメントを5〜8回上下にピペットする。
  16. セグメントを 30 秒間固定します。50 mL チューブと 25 mL ピペットを PBS2 でプレコートします。このピペットを使用して、上清(画分1)をプレコートされた50mLチューブに集め、チューブを氷上に置きます。
    注:この画分は、残りの陰窩分離バッファーを洗い流すのに役立ちます。ただし、追加の品質管理ステップとしても機能します。ピペッティングが強烈すぎると、このすすぎ画分に陰窩が豊富になり、穏やかすぎると、この画分に破片はほとんどありません。最適には、フラクション1はプロトコルの最後に廃棄されますが、以下で得られるフラクション2〜4で問題が発生した場合は、オルガノイドを作るために使用できます。
  17. 手順1.15と1.16を繰り返しますが、20mLではなく10mLの氷冷PBSを加え、上清をPBS2でプレコートした新鮮な50mLチューブに入れます(画分2)。
  18. ステップ1.17をさらに2回繰り返すが、得られた上清を画分2でプールし(ステップ1.17から同じ50mLチューブに入れて)、画分2〜4を得た。この単一の50mLチューブは、30mLの氷冷PBS中に取り除かれた陰窩を含むべきである。
  19. プールされた2〜4画分から50μLのアリコートを取り出し、カバースリップの上に置きます。倒立光学顕微鏡を用いて上皮陰窩の存在を評価する。
    メモ: クリプトが存在しない場合は、クリプトが解放されるまで、ピペッティング中にさらに力を加えて手順 1.17 と 1.18 を繰り返します。手順 1.14 の陰窩分離バッファーまたは手順 1.16 のフラクション 1 で、陰窩が途中で取り除かれていないことを確認します。
  20. 100 μm のストレーナーと 50 mL チューブを PBS2 でプレコートします。プールされた陰窩画分をこのストレーナーに通し、予めコーティングされた50mLチューブに通す。
  21. 歪んだ陰窩画分を300 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
  22. 上清を捨て、10 mLの氷冷アドバンストDMEM/F12に陰窩を再懸濁します。陰窩を15mLチューブに移す。
  23. 陰窩を210 x g で4°Cで5分間スピンダウンして、単一細胞およびリンパ球を除去した。
  24. 地下室を氷冷したアドバンストDMEM/F12 mLに再懸濁します。
  25. 10 μLのアリコートを取り出し、カバースリップの上に置きます。倒立光学顕微鏡を用いて、陰窩の数を数え、陰窩濃度を決定する。
  26. 〜400と〜1,500の暗号に必要なボリュームを計算します。p1000チップをPBS2でプレコートし、このチップを使用して必要な容量(約400および〜1,500クリプトを含む)を別々の1.5mLチューブにピペットします。
  27. 地下室を300 x g で4°Cで5分間スピンダウンします。
  28. できるだけ多くの上清を除去し、次いで、氷上に置かれた80μLのTBEMに陰窩を再懸濁する(12°Cで起こるマトリックスゲル化を防ぐために、4°Cでプレクールピペットチップ)。
  29. ステップ1.1で置いた24ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。40 μLの陰窩をゆっくりと円を描くように井戸の中心にそっとピペットで移し、平らだが3Dドーム構造を形成するか、または3つの別々の小さなドームに形成する。
    注:オルガノイドの生存率は、栄養素とガスの浸透効率が低いドームの中心で最も低い31。したがって、明確な3D構造を維持しながら、メディアにさらされる表面積を最大化することが重要です。
  30. ステップ 1.29 を繰り返して、ウェルあたり約 200 クリプトの密度を持つ合計 2 つのウェルと、ウェルあたり約 750 クリプトの密度を持つさらに 2 つのウェルを作成します。プレートをインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に15〜20分間直接置き、粘性はあるが液体マトリックスドームを乱さないように注意する。
  31. 1ウェルあたり550 μLの予備加温ENR培地を加え(ステップ1.2から)、37°Cおよび5%CO2で24 時間インキュベートする。この段階では、ENR培地に5μMのWntアゴニスト(CHIR 99021)および5μM Rhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を単離後の最初の24時間にわたって補充し、組織から新たに単離された陰窩のオルガノイド生成の収率および効率を改善することが示唆される。
    メモ:陰窩は24時間以内に丸みを帯びた構造を形成するように閉じ、陰窩の芽は2〜4日以内に現れるはずです(図1A)。
  32. ステップ1.31のインキュベーションの終了時に新鮮なENR培地と交換し、その後、〜2日ごと、または培養培地中のフェノールpH指示薬が淡いオレンジ色に変わるが黄色に変わる前に交換する。

2.マウス小腸オルガノイドの維持

注:プロトコルのこのセクションでは、マウス小腸オルガノイドの維持および継代について説明しています。オルガノイドは最初に収穫され、次に曲がったp1000チップを使用して機械的に破壊される。このプロセスは、多数の陰窩からなる大きなオルガノイドを複数の小さな断片に分解して膨張させ、偽管腔に蓄積した死細胞を放出する。マウス小腸オルガノイドの維持は、他の場所でも十分に記載されている24、25、27。すべての手順は、滅菌材料および試薬を使用して無菌環境で実施する必要があります。オルガノイドの破裂が起こる前に、オルガノイドの通過または拡張は、オルガノイド内腔内の破片の実質的な蓄積から生じる。オルガノイドは、オルガノイドの密度に応じて1:2〜1:3の比率で継代することができ、これはウェルあたり100〜200個のオルガノイドの間で最適である。

  1. ステップ1.1および1.2と同様に、TBEMを氷上で解凍し(40 μL/ウェル)、ENR培地(ウェルあたり550 μL)を調製する。培地および標準組織培養処理した24ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに入れる。
  2. オルガノイドを含むプレートをインキュベーターから取り出します。通過する井戸から媒体を捨てる。
  3. 500 μL の氷冷アドバンスト DMEM/F12 をウェルに加えます。p1000チップ(オルガノイドが先端内部に付着しないように培地で予めコーティングされたもの)を使用して、オルガノイドを15mLチューブに収穫する。
  4. ウェルの底を氷冷アドバンストDMEM/F12 250~300 μLですすぎ、ウェル内にオルガノイドが残らないようにし、ステップ2.3から採取したオルガノイドを含む15 mLチューブにプールします。複数のウェルを継代する場合は手順 2.3 と 2.4 を繰り返し、複数のウェルのオルガノイドを同じ 15 mL チューブにプールします。
  5. オルガノイドを300 x g で4°Cで3分間スピンダウンします。
  6. 遠心分離時に、健康なオルガノイドを含む基本画分、中央および透明なマトリックス画分、単一細胞および死細胞を含むマトリックス画分、および単一細胞および死細胞を含む上清層の4つの可視画分があることを確認します。オルガノイドのペレットを破壊することなく、上清、破片画分、およびできるだけ多くの透明なマトリックス断片を除去する。
  7. p1000ピペットチップの先端を軽く曲げます(約2~5mm曲げます)。このチップをPBS2またはアドバンストDMEM/F12でプレコートします。このチップを用いて、オルガノイドを10〜20回上下にピペットでピペットし、オルガノイドおよび残りのマトリックスを機械的に破壊する。
  8. 210 x gで4°Cで3分間スピンダウンします。
  9. ステップ2.6と同様に、解離した陰窩のペレットを破壊することなく、上清、破片画分、およびできるだけ多くの透明なマトリックス断片を除去する。健康な陰窩または小さなオルガノイドが透明なペレットを形成していない場合は、300 x g で4°Cで3分間再度遠心分離します。
  10. TBEMの必要量を計算します(1:2または1:3の継代比を使用するかどうかに応じて、採取したオルガノイドのウェルあたり80〜120μL)。
  11. 計算された容量のTBEMにペレットを再懸濁し、予め加温した24ウェルプレートに1ウェルあたり40μLを塗布してドームを形成した。プレートをインキュベーター(37°C;5%CO2)に直接置き、15〜20分間置く。
  12. 1ウェルあたり550 μLのENR培地を添加し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。24時間後のオルガノイド形成について培養物を確認する。 継代後2〜3日ごとに新鮮なENR培地と交換してください。

3. 小腸粘膜固有層先天性リンパ球細胞の単離

注:プロトコルのこのセクションは、RORγtGFPレポーターマウスのマウス小腸粘膜固有層からのILC1の単離を説明する。これには、上皮細胞除去、組織消化、リンパ球の密度勾配分離、および蛍光活性化細胞選別(FACS)によるILC1単離が含まれる。図2のゲーティング戦略に続くFACS単離には、細胞外染色マスターミックス(表4)が必要であり、機械(表2)およびゲーティング(表3)について表2および表3に記載された追加の染色対照をセットアップする必要があります。RORγtGFPレポーターマウスは、生きた純粋なILC1を単離し、RORγtGFP+ ILC3をゲートアウトするために使用される。粘膜固有リンパ球の単離のための組織プロセシングもまた、他の場所32で十分に説明されている。

  1. 組織加工
    注:個々の生物学的動物複製からの組織は、このプロトコールにおいて別々に保たれる。これらのサンプルは適切にラベル付けし、可能な限り氷の上に保管する必要があります。消化酵素を除くすべての試薬は、迅速な組織消化を確実にするために室温に達するようにする必要があります。
    1. TBEMを氷の上に置き、解凍する(40 μL/ウェル)。標準組織培養処理した24ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内に予め保温しておく。
    2. 新鮮な上皮除去バッファーおよび消化バッファーを調製する( 表1参照)。等張性低粘度密度勾配培地(LVDGM)(90%LVDGMおよび10%10x PBS)、40%等張LVDGM、および80%等張LVDGMを中和バッファー中に調製する(表1)。
    3. 生後6~12週間の動物を屠殺し、鉗子と微小解剖ハサミを用いて小腸を解剖し、氷上の15mLのPBSに腸を入れた。
    4. 氷の上の10cm2のペトリ皿のPBSに腸を浸し、鉗子を使用して脂肪を優しく、しかし完全に腸から取り除きます。
    5. 微小解剖はさみを使用してパイエルのパッチ(〜5〜10;脂肪組織の線とは反対の線で走っている)を取り除き、リンパ組織誘導細胞およびB細胞を枯渇させる。
      注:パイエルの斑点は、ぼろぼろ/- や他の系統が枯渇した動物には存在しません。気泡とは異なり、パイエルのパッチはナッジしても所定の位置にとどまります。
    6. 微小解剖はさみを使用して組織を縦方向に切断する(好ましくは、ミシン目を避けるために丸みを帯びた先端を有する)。腸内をPBSに沈めたまま、振って糞便を除去します。
    7. 組織を2〜4cmの長さの断片に切断し、50mLのチューブに移す。
    8. 約20〜40mLの氷冷PBSを加え、粘液および破片を除去するために5〜15秒間激しく振る。
    9. チューブの内容物を新鮮なシャーレに捨て、鉗子を使用して腸の破片を同じ50mLチューブに交換します。
    10. 手順 3.1.8 と 3.1.9 を 3 ~ 4 回、または PBS がクリアされるまで繰り返します。
  2. 上皮除去
    1. 腸の破片を氷の上の新鮮なペトリ皿に入れます。鉗子を使用して、腸の部分を拾い、乾燥した表面をタップして余分な液体を取り除きます。
    2. 組織を約0.75〜1cm片に切断し、新鮮な50mLチューブに移す。5〜7mLの上皮除去緩衝液を加える(表1)。チューブを渦巻き、すべての腸管セグメントがバッファーに沈んでいることを確認します。
    3. サンプルを37°Cでロッキング(100〜150rpm)で12〜15分間インキュベートする。チューブを20〜30秒間渦巻きます。
    4. 手順3.2.1~3.2.3をもう一度繰り返し、白濁した上清(画分には上皮細胞と上皮内細胞を含む)を捨て、新鮮な上皮除去バッファーと交換します。
  3. 組織の消化
    1. 新鮮なペトリ皿に内容物を傾けます。鉗子を使用して、腸の部分を拾い上げ、余分な液体を捨てるために乾燥した表面をタップする。セグメントを氷の上の新鮮なペトリ皿に入れます。
    2. セグメントをペトリ皿の中心にクラスター化して、密集した塊にします。2つのメスまたは鋭いはさみのいずれかを使用して、p1000ピペットチップを通過できる粘性のある粘稠度に達するまで組織を細かく細断します。
    3. ピンセットを使用して、ミンチした組織を清潔な50mLチューブに入れます。1〜2mLの消化緩衝液(表1)でシャーレをすすぎ、残りの組織を収集し、細断した組織を含む50mLチューブにプールする。
    4. 細断した組織に5〜7mLの消化バッファーを加え、すべての組織がチューブの底に集められるようにします。
    5. サンプルを37°Cでインキュベートし、培地ロッキング(〜100〜150rpm)で15分間インキュベートします。消化を助けるために5分ごとに20〜30秒間チューブを渦巻きます。
    6. サンプルがインキュベートされている間、各サンプルの新鮮な 50 mL チューブの上に 40 μm のセルストレーナーを置きます。フィルターを1~2mLの中和バッファーでコーティングします(表1)。
    7. インキュベーションが終了した後、サンプルを20〜30秒間渦巻きます。
    8. 部分的に消化された組織をコーティングされた40μmフィルターを通して中和緩衝液を含む50mLチューブに濾過する。
    9. ピンセットを使用して40 μmフィルターから未消化組織を採取し、消化を行った50 mLチューブに戻して2回目の消化を行います。フィルターを取り外し、消化バッファーですすぎ、フィルターに付着している未消化の組織を取り除きます。
    10. できるだけ多くの未消化組織がフィルターから取り除かれたら、消化が行われた50 mLチューブに戻して、ろ過した上清を入れた50 mLチューブの上に1〜2 mL中和バッファーでフィルターをすすいでください。
    11. ろ過した上清に20~25mLの中和バッファーを加え、氷の上に置き、組織消化の第2ラウンド中に単離された細胞の生存率を維持します。
    12. 未消化の組織に別の5〜10mLの消化緩衝液を加え、ステップ3.3.5〜3.3.10を繰り返して、消化された組織をステップ3.3.8で使用したのと同じチューブに濾過する(同じフィルタも再利用することができる)。50 mL ラインに達するまで中和バッファーでフィルターをすすぎ、残りの未消化組織を捨てます。
  4. 密度勾配によるリンパ球単離
    1. 各生物学的複製について収集した上清を500 x g で10分間スピンする。
    2. ステップ3.4.1の間、各生物学的複製のために5mLの80%等張LVDGMを15mLチューブに加える。
    3. 遠心分離後、濾過し、消化した組織から上清を捨てる。ペレットを10mLの40%等張LVDGMに再懸濁し、ペレットがよく均質化され、大きなチャンクが残っていないことを確認する。
    4. ピペットエイドを最も遅い設定に設定し、80%等張LVDGMを含む15mLチューブを傾け、10mLの細胞懸濁液を40%等張LVDGMに非常に穏やかに重ね合わせ、細胞懸濁液が80%画分と混合しないようにします。
      注:画分が誤って混合する必要がある場合は、PBSで満たされた2つの50mLチューブの間に80%画分に達したリンパ球を迅速に分配し、500 x gで10分間遠心分離する。次に、上清を廃棄し、手順3.4.3~3.4.4を繰り返します。
    5. チューブを 900 x g および 20 °C で回転させ、加速と低加速を最低設定に設定して、フラクションが破壊されないようにします。20分間遠心分離機(休憩時間を除く)。
      注:このステップ以降のすべての手順は、滅菌材料および試薬を使用して無菌組織培養フード内で行う必要があります。
    6. 各サンプルの50 mLチューブをPBS2でプレコートし、45 mLの氷冷PBSを加えます。
    7. 遠心分離後、上部のデブリス層を15mLチューブから静かに除去する。p1000チップをPBS2でコーティングし、それを使用して、40%〜80%勾配の間のリンパ球を含む間相を、45mLの氷冷PBSを含む50mLチューブに集める。
    8. チューブを 300 x g で 4 °C で 5 分間回転させます。
    9. 上清を廃棄し、ペレットを500 μLのFACSバッファー(PBS、2% FCS、0.5 mM EDTA、および10 mM HEPES; 表1参照)に再懸濁する。40 μm フィルターを FACS バッファーでプレコートし、それを使用して細胞懸濁液をフローチューブにろ過します。50 mL チューブを追加の 500 μL の FACS バッファーですすぎ、同じフローチューブにフィルターを入れます。
    10. 得られた1mLの細胞懸濁液から10μLのアリコートを除去する。細胞カウンターまたは血球計数器を用いてリンパ球収量を計数し、各サンプルの細胞濃度を計算する。
  5. 選別のためのサンプル調製 - 細胞外染色
    注:細胞外染色マスターミックスで使用される抗体、ならびに固定可能な生存率色素およびFcブロック溶液を調製するための試薬は、最大5 x 10の濃度で使用されます。6 100 μLあたりの細胞容量はそれに応じて調整する必要があります。ILC1を選別するためのFACSマシン補正には、細胞外染色マスターミックス中の各蛍光色素に対する単色コントロールが必要です。抗体については、陽性抗体結合ビーズ集団および陰性抗体非結合性ビーズ集団を含む補償ビーズが使用できる。紫外線(UV)固定可能な生存率染料単色制御のために、アミン反応性(正シグナル用)および非反応性(ネガティブシグナル用)集団を含む補償ビーズを使用することができる。これは、からセルを使用することはお勧めしません RORγtGFPレポーターマウスは、UV固定可能な生存率色素単色制御のために、これらの細胞がGFPを含有するように、+ 信号。
    1. 各サンプルから約 10 μL の小さなアリコートを取り出し、250 μL の FACS バッファーを含む別のフローチューブにプールします。チューブを氷の上に置きます。これは、染色されていないコントロールに使用されます。
    2. サンプル管内の残りの容量に1mLのPBSを加える。300〜400 x g で3〜5分間遠心分離する。
    3. サンプルあたり200 μLのUV固定可能な生存率色素溶液を調製する。UV固定可能な生存率染料(製造業者の指示に従ってDMSOに再懸濁)をPBSで1:500(または製造業者の指示に従って)希釈する。
    4. 上清を捨て、サンプルを200 μLのUV固定可能な生存性色素溶液に再懸濁する。チューブを渦巻き、暗所で4°Cで10〜15分間インキュベートする。
    5. チューブに2 mLのFACSバッファーを加えて、UV固定可能な生存率色素をクエンチし、ボルテックスを10秒間、チューブを300〜400 x g で4°Cで3〜5分間遠心分離します。 遠心分離チューブから上清を捨てる。
    6. サンプルあたり200 μLのFcブロック溶液(FACSバッファー中のFcブロックの0.25 mg/mL)を調製する。
    7. ステップ3.5.5からの各サンプルに200 μLのFcブロック溶液を加え、10秒間ボルテックスし、暗所で4°Cで10分間インキュベートした。
    8. 500 μL の FACS バッファーをフレッシュフローチューブに加えます。各サンプルから 2 ~ 5 μL のアリコートを取り出し、蛍光マイナス 1 (FMO) コントロール用にチューブにプールします。
    9. FMOチューブを10秒間渦巻き、FMOコントロールのそれぞれにラベル付けされた新鮮なフローチューブに均等に分配(チューブあたり100μL)します(リネージュカクテルFMO、CD127 FMO、KLRG1 FMO、NKp46 FMO、およびNK1.1 FMO; 表3参照)。目的の抗体を除く全ての抗体を各チューブに加え( 表3に記載)、10秒間ボルテックスした。FMOコントロールを4°Cの暗闇の中で脇に置きます。
    10. サンプル(FMOコントロールではない)を300〜400 x g で4°Cで3〜5分間遠心分離します。
    11. 細胞外染色マスターミックス(サンプルあたり200 μL)を 、表4に記載した最終抗体希釈液で調製します。染色量を、ステップ3.4.10の細胞数に応じて適切な細胞濃度(100 μLあたり最大5 x106 細胞)に調整します。
    12. 細胞外染色マスターミックスをサンプルに加え、10秒間ボルテックスし、4°Cの暗闇の中でそれらを脇に置きます。
    13. ゲーティング戦略で使用する抗体ごとに新鮮な単色コントロールを調製する(図2)。ボルテックス抗体補償ビーズを20秒間、ビーズを1滴フローチューブに加え、0.5μLの抗体( 表2に示すように、または製造元の指示に従って)で染色し、ボルテックスを10秒間行う。
    14. アミン反応性補償ビーズキットを用いてUV固定可能な生存率染料単色コントロールを作製する。ボルテックスアミン反応性補償ビーズを20秒間、1μLのLive/Dead UV染料( 表2に示すように、または製造元の指示に従って)およびボルテックスを10秒間加えます。
    15. サンプル、FMO、および単色コントロールを暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
    16. この間、選別された細胞を収集するためのチューブを準備する。アドバンストDMEM/F12に400~500 μLの10%FBSを各サンプルの1.5 mLチューブに加えます。
    17. インキュベーション後、2mLのPBS2を各サンプル、FMOコントロール、および単色コントロールに加える。
    18. サンプル、FMO コントロール、および単色コントロールを 300 ~ 400 x g で 4 °C で 3 ~ 5 分間遠心分離します。
    19. すべての遠心チューブから上清を捨てる。サンプルおよびFMOコントロールを250μLのFACSバッファーおよびボルテックスに10秒間再懸濁する。
    20. 単色コントロールを250 μLのPBS2に再懸濁する。1滴のアミン非反応性ビーズをUV固定可能な生存率染料単色制御のみに加える。10秒間すべてのコントロールを渦巻きます。
    21. これで、セルを並べ替える準備ができました。サンプル、FMOコントロール、および単色コントロールを可能な限り暗闇の中で氷上に保管して、細胞の生存率を向上させ、フォトブリーチングによるシグナルの損失を防ぎます。

4. 小腸オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

注:このセクションでは、ソートされたマウス小腸ILC1(セクション3のプロトコルに従って単離された)とマウス小腸オルガノイド(セクション1および2に記載)との共培養について説明します。オルガノイドは、継代後1〜2日で最適に使用する必要があります。共培養は、オルガノイドを採取し、適切な数のILC1を添加し、オルガノイドとILC1を一緒にペレットに遠心分離し、TBEM中で再懸濁することを含む。ILC1 が単離されたら、できるだけ早くこのセクションを完了してください。すべての手順は、滅菌材料および試薬を使用して無菌環境で実施する必要があります。

  1. ステップ 3.1.1 の TBEM が解凍されていることを確認します。
  2. ステップ2.3および2.4で説明されているように、1〜2日齢のオルガノイドを収穫する。
  3. オルガノイドペレットを1mLの冷たい氷冷アドバンストDMEM/F12に再懸濁する。ここでの意図は、共培養のためにオルガノイド構造を維持することであるため、オルガノイドを継代するときのようにp1000先端を曲げないでください。必要に応じて、オルガノイドを別のPBS2コーティングされた1.5mLチューブに氷上で短時間置き、異なる共培養条件間で分配する。
    注:オルガノイドの調製は、ILCサンプルが共培養の準備が整った後にのみ開始してください。上皮細胞死を最小限に抑えるために、オルガノイドが収穫されるとすぐに氷上で迅速に作業します。
  4. 1本の1.5 mLチューブをILC複製サンプルあたりPBS2でプレコートする。約100~200個のオルガノイド(24ウェルプレートの約1ウェル)を各チューブに分配する。
  5. p1000チップをPBS2にプレコートし、それを使用してFACS精製後のILC1の体積(250〜300μL +選別容量)を評価します。ソートから記録された細胞数を使用してmLあたりのILC1の濃度を決定し、必要な体積を決定する。
  6. 同じPBS2コーティングp1000チップを使用して、オルガノイドを含むPBS2コーティングされた1.5mLチューブに500個以上のILC1を加える。ソートから得られたILC1の数が500未満の場合は、オルガノイドを元のソートを含むチューブに直接追加して、転写による細胞の損失を最小限に抑えます。
  7. ILC1とオルガノイドを300 x gで4°Cで5分間スピンダウンします。 可能であれば、小径の卓上遠心分離機は、チューブの先端にペレットを作成するのではなく、チューブ内部の端に沿って細胞をプールするため、避けてください。細胞数は非常に少ないため、これらのステップ中の細胞の損失を最小限に抑えることが不可欠です。
  8. ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清をゆっくりと穏やかに除去する(特にオルガノイドILCのみの対照では、目では見えないかもしれない)。サンプルを氷の上に置きます。
  9. 冷たいペレットをTBEMのウェルあたり30μLに再懸濁する。チューブを冷たい表面(例えば、組織培養フードに入れた氷の小さな箱)に保持しながら、オルガノイドとILCを少なくとも10〜15回混合して均一な分布を確保する。オルガノイドの損傷や気泡の形成を避けるために、頻繁にしかし穏やかに粉砕する。
  10. TBEM中のILCオルガノイドのウェルあたり30 μLを予め加温した24ウェルまたは48ウェルプレートに塗布し、単一のドームを形成する。プレートをインキュベーター(37°Cおよび5%CO2)に10〜20分間直接置きます。
    注: ILC のみのコントロールとオルガノイドのみのコントロールをダウンストリーム分析用にセットアップすることを強くお勧めします。ILC1はまれであるが、GFP− ILC2は、科学的に適切な場合、免疫蛍光またはFSC/SSCフローサイトメトリーコントロールに置換することができる。
  11. 550 μL(1ウェルあたり)の完全ILC1培地(ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-メルカプトエタノール; 表1参照)を任意の所望の実験用サイトカインまたはブロッキング抗体と共に加え、37°Cおよび5%CO2で24 時間インキュベートする。
  12. 24時間後、プレートをインキュベーターから静かに取り出し、プレートを組織培養フードに1分間座らせて、リンパ球が沈降していることを確認します。
  13. 200~250 μLの培地を取り出し、24 ウェルプレートの空のウェルに入れます。この上清を倒立顕微鏡で確認し、リンパ球が除去されていないことを確認します。
    1. 上清が透明な場合は、元のウェルの共培養に300 μLの新鮮なILC1培地を加えます。リンパ球が上清中に存在する場合は、300〜400 x g で4°Cで3〜5分間遠心分離し、300 μLの新鮮なILC1培地に再懸濁し、これを元のウェルの残りの200〜250 μLの培地に加える。1~2日ごとに、またはメディアが淡いオレンジ/黄色になったときに、必ずメディアを補充してください。
      メモ: マトリックスドームの先端がメディアの表面を壊すほどメディアが十分に蒸発しないようにしてください。マトリックスが完全に水没していることを常に確認してください。過剰な蒸発は、組織培養プレートの中央ウェルを使用し、周囲のウェルに約600μLのPBSを添加することによって回避することができる。成体ILCとの共培養は1〜4日間安定であり、その後、大きな混乱なしに播種されたオルガノイドは破裂し、新しい陰窩として再播種される。上皮を分析する場合、共培養を確立してから1〜4日以内に培養物を分析することが推奨される。
    2. 参照8に記載されているように、単一細胞またはバルクRNA-seqまたはRT-qPCRによる遺伝子発現分析のために、標的集団の溶解バッファーへの免疫蛍光、フローサイトメトリー、またはFACS精製を使用して下流分析を実行します。

結果

正常に完了すると、新しく分離された陰窩は2〜4日以内に出芽した陰窩構造を形成するはずです(図1A)。健康で堅牢なオルガノイド培養物は活発に成長している必要があり、プロトコルに詳述されているように継代および拡張することができます。

このプロトコールは、RORγtGFP マウストランスジェニックレポーターラインからの小腸ILC1の単?...

ディスカッション

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドを確立し、腸解離プロトコル中のリンパ球の損失を最小限に抑えることによって希少ILC1を単離し、これら2つのコンパートメント間の共培養を確立するための方法を記述している。このプロトコルには多くのステップがあり、ILC1に固有のものもありますが、このアプローチは他の腸管免疫細胞タイプにも適用でき、共培養セットアップは個々の研?...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

E.R.はウェルカム・トラスト(215027/Z/18/Z)の博士号取得を認めています。G.M.J.はウェルカム・トラスト(203757/Z/16/A)の博士課程フェローシップを認めています。ワシントンD.C.は、NIHR GSTBから博士号を取得していることを認めています。J.F.N.は、マリー・スクウォドフスカ・キュリー・フェローシップ、キングス・プライズ・フェローシップ、RCUK/UKRIラザフォード基金フェローシップ(MR/R024812/1)、ウェルカム・トラスト(204394/Z/16/Z)の科学におけるシード・アワードを受賞しました。また、ガイズ病院に拠点を置くBRCフローサイトメトリーコアチームにも感謝します。Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6レポーターマウスは、G. Eberl(パスツール研究所、パリ、フランス)からの寛大な贈り物でした。CD45.1 C57BL/6マウスは、T. Lawrence(キングス・カレッジ・ロンドン、ロンドン)とP. Barral(キングス・カレッジ・ロンドン、ロンドン)から親切に与えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
2-MercaptoethanolGibco21985023
Anti-mouse CD45 (BV510)BioLegend103137
Anti-mouse NK1.1 (PE)Thermo Fisher Scientific12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC)Thermo Fisher Scientific17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0031-82
CHIR99021Tocris4423/10
COLLAGENASE D, 500MGMerck11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T CellsCell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II)Merck4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)Gibco11320033
DNASE I, GRADE IIMerck10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)Gibco21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate AcidThermo Fisher ScientificBP2482-100
FC block2B ScientificBE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivatedGibco10500064
GlutaMAX (100X)Gibco3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X)Gibco14065056
HBSS (1X)Gibco12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc CellsCell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M)Gibco15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710)Thermo Fisher Scientific46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationThermo Fisher ScientificL23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231
N-2 Supplement (100X)Gibco17502048
N-acetylcysteine (500mM)MerckA9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7)Thermo Fisher25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pHThermo Fisher Scientific12549079
PBS (10X)Gibco70013032
PercollCytiva17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free ProteinR&D SystemsAFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CFR&D Systems247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free)BioLegend589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free)R&D Systems407-ML-005/CF
UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Bio-techne1254
Plastics
50 mL tubeFalcon10788561
1.5 mL tubeEppendorf30121023
10 mL pippetteStarLabE4860-0010
15 mL tubeFalcon11507411
25 mL pippetteStarLabE4860-0025
p10 pippette tipsStarLabS1121-3810-C
p1000 pippette tipsStarLabI1026-7810
p200 pippette tipsStarLabE1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plateFalcon353047
Equipment
CentrifugeEppendorf5810 R
CO2 and temperature controled incubatorEppendorfGalaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular SorterBD equipmentFACS Aria II
Heated shakerStuart EquipmentSI500
Ice box--
Inverted light microscopeThermo Fisher ScientificEVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippetteEppendorf3124000016
p1000 pippetteEppendorf3124000063
p200 pippetteEppendorf3124000032
Pippette gunEppendorf4430000018
Wet ice--

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