一种无焰灭菌 秀丽隐杆线虫 镐、抹刀和手术刀的方法

摘要

本文介绍了一种使用微型焚烧炉代替明火对蠕虫镐、刮刀和手术刀进行灭菌的方法。

摘要

秀丽隐杆线虫（C. elegans） 是主要本科院校研究和教育的最佳模式生物。本科生可以快速学习维持 秀丽隐杆线虫 培养所需的无菌技术。传统上，将镐用于将蠕虫从一个板转移到另一个板的铂镐的灭菌是通过将镐保持在本生燃烧器或乙醇灯笼的火焰中来完成的。然而，本生燃烧器需要气源，这两种设备都存在与明火相关的意外火灾风险。这里演示的是一种使用红外细菌学回路微焚烧炉对蠕虫镐，刮刀和手术刀进行灭菌的技术。该设备只需要一个电源插座，并将潜在的火灾隐患降至最低。通过降低风险和气体要求，该技术非常适合本科环境中的研究和教学。

引言

模式生物 秀丽隐杆线虫 非常适合主要本科院校（PUIs）的研究和教育，因为成本低，易于维护和应用范围^{1，2，3，4}。为了处理蠕虫 - 例如，将蠕虫从一个板移动到另一个板，实验人员可以使用蠕虫镐。可以制作或购买各种镐头以用于 秀丽隐杆线虫。镐最常使用铂金或铂金/铱尖端制成，安装在玻璃，金属或木制手柄中。玻璃手柄可以通过将巴斯德移液器熔化在铂丝周围直到金属丝固定在内部制造。有关 秀丽隐杆线虫 饲养的其他信息，包括如何种植和维持蠕虫及其食物来源，可以在WormBook⁵ 和其他来源^6，7，8中找到。

当使用 秀丽隐杆线虫时，无菌技术通常用于防止微生物和真菌的污染。无菌技术的例子包括器械灭菌，试剂的高压灭菌以及在无菌领域进行工作。蠕虫镐通常使用明火⁹进行灭菌。此外，蠕虫镐的灭菌会焚烧蠕虫，从而防止在处理多种蠕虫菌株时意外混淆菌株。对蠕虫镐进行灭菌的典型方法包括从本生燃烧器、乙醇灯笼或标准打火机中明火（表1）。我们被激励去实验室中寻找更安全的替代品，当时一名本科生在装满乙醇灯笼时不知不觉地洒了乙醇，并在点燃灯笼时意外地引发了一场小火。不幸的是，据报道，许多使用乙醇灯笼^10，11，12的事故。幸运的是，替代灭菌方法已被验证用于微生物学，本文的目的是演示如何使用该设备对用于 秀丽隐杆线虫的器械进行灭菌。

在微生物实验室中，无菌技术也至关重要。由铂制成的血清学环和电线使用明火¹³或微型焚烧炉^14，15，16进行灭菌。微型焚烧炉的其他名称包括微杀菌器或细菌焚烧炉。与传统火焰方法相比，微型焚烧炉的优势包括减少火灾危险，消除焚烧材料的飞溅，以及在层流罩/生物安全柜^16，17，18中工作的能力。事实上，美国微生物学会和世界卫生组织都建议使用微型焚烧炉而不是使用明火^17，19，20。与本生燃烧器相比，微型焚烧炉也不需要气体管路，一些实验室可能没有，或者可能没有在每个工作台上供学生使用。受这些优势的启发，开发了一种方案，用微型焚烧炉代替火焰的使用，用于对秀丽隐杆线虫实验室中常用的器械（如镐，刮刀和手术刀）进行灭菌。这种方法可能适用于寻求在使用秀丽隐杆线虫时增强安全性和/或灵活性的教师和研究人员。

研究方案

1.准备微型焚烧炉

1. 将环形支架附件导轨夹在微型焚烧炉上，将其夹在外桶上。
2. 根据需要将微型焚烧炉插入标准 120 V 或 230 V 电源插座。
   注意:这可以在台式或层流罩中完成。
3. 将微型焚烧炉调至高设置，并使其预热10-20分钟，具体取决于制造商的说明，以达到800-825 ^°C的最佳温度。
   注意:如果将焚烧炉保持打开时间超过3小时，则可以将较低的温度设置（500 ^oC）用作备用设置。根据制造商的用户手册，这延长了设备的使用寿命。

2. 对镐子、刮刀或手术刀进行消毒

1. 将器械插入圆柱形灭菌区域，通过沿导轨²¹滑动而不接触侧面。
   注意:如果对手术刀进行消毒，请务必避免用刀片接触陶瓷墙。刮擦陶瓷墙可能会损害加热装置的完整性。
2. 将仪器在灭菌区域保持5-7秒。
3. 通过沿导轨向后滑动来移除仪器，而不接触侧面。
4. 对于镐头，在触摸蠕虫之前让仪器冷却3-5秒，以避免燃烧它。
   注意:不允许冷却的手术刀或刮刀会点燃琼脂。
5. 挑选蠕虫后，将镐重新插入腔室5-7秒，以焚烧镐上的任何蠕虫。

3. 比较方法 - 使用本生燃烧器对器械进行灭菌

1. 使用橡胶管将本生燃烧器连接到气体管路。确保将管道紧紧固定，并将燃烧器放置在远离头顶物体的位置。
2. 通过转动气体管路上的旋钮来打开气体。
3. 使用撞针或打火机点燃燃烧器。
4. 使用气体旋钮和进气口调节火焰，直到看到蓝色锥体。
5. 将镐头、刮刀或手术刀放在火焰中，直到它发出红色的光芒。
6. 对于镐头，在触摸蠕虫之前让仪器冷却3-5秒，以避免燃烧它。
   注意:不允许冷却的手术刀或刮刀会点燃琼脂。
7. 采摘蠕虫后，将镐重新插入火焰中以焚烧镐上的任何蠕虫。

4. 实验

1. 在37^°C摇摇杯中培养OP50大肠杆菌（大肠杆菌）^细菌22过夜。
2. 过夜培养后，以1:100的比例在无菌水中稀释培养物。
   注意:选择该稀释因子是为了确保接种后菌落的分离。
3. 使用本生燃烧器灭菌的蠕虫镐浸入细菌溶液中，用本生燃烧器重新灭菌，并在100 mL无菌水中旋转。
4. 将100μL水板在10cm LB琼脂^22，23 培养皿上，使用无菌细胞扩散器铺开水，并在室温下孵育24小时，盖上盖子。
5. 使用使用微型焚烧炉灭菌的蠕虫拾取器执行步骤4.3-4.4。
6. 作为阳性对照，在不重新灭菌的情况下执行步骤4.3-4.4。
7. 作为阴性对照，使用无菌水代替细菌溶液执行步骤4.3-4.4。
8. 在孵育期后手动计数菌落。

结果

设计了一个简单的实验（第4节）来证明使用微型焚烧炉与火焰的相对污染率（图1， 表2）。虽然这些结果代表了各种方法的污染率，但没有必要重复这种方法来使用微型焚烧炉技术。实验一式三份进行。阴性对照是无菌水，无细菌。阳性对照未使用任何灭菌技术:将蓄料浸入稀释的OP50培养物中，然后直接转移到无菌水中。所有重复和条件在同一天并行运行。在所有三个阴性对照板中，计数的菌落为零。当使用本生燃烧器对镐进行灭菌时，平均计数为4.7（±0.3 SEM）菌落。在微型焚烧炉条件下观察到平均3.3（±1.2 SEM）菌落计数。然而，在阳性对照条件下获得的平均计数为298.3（±17.9 SEM）菌落。假设本生燃烧器与微型焚烧炉的方差相等的双尾 t检验没有统计学上显着的差异， p = 0.35。因此，微型焚烧炉达到的无菌效果与本生燃烧器同样有效。

图1:不同灭菌方法的细菌计数。 将镐在1:100 OP50培养物中浸入无菌水中，然后使用本生燃烧器或微型焚烧炉灭菌。然后将镐浸入无菌水中，接种在LB琼脂^22，23上，并在室温下孵育24小时，并手动计数菌落。阳性对照没有杀菌，阴性对照使用无菌无菌水。n = 每个条件 3 次重复。注意:y 轴被打破，以允许在图形的相关部分分离数据点。 请点击此处查看此图的大图。

灭菌方法	成本	实验室要求	优势		弊
微型焚烧炉	$365–530	120 V 或 230 V 插座	• 便携式 • 无明火或外露加热元件 • 可用于层流罩和生物安全柜		• 预热时间 • 成本较高
本生灯	$24–169	气体管路	• 快速设置 • 低成本		• 明火 • 不建议在层流罩或生物安全柜中使用
乙醇灯	$11	没有	• 快速设置 • 低成本 • 可再填充		• 明火 • 加注时的安全隐患 • 不建议在层流罩或生物安全柜中使用 •某些机构不允许
打火机	$5–8	没有	• 低成本 • 无障碍 • 一次性用品 • 可再填充		• 明火 • 手动操作 • 不建议在层流罩或生物安全柜中使用

表1:灭菌器械方法比较。 根据优缺点、成本和实验室要求，比较了四种灭菌器械的方法。

复制	条件
	微型焚烧炉	本生灯	阴性对照	正向控制
1	1	5	0	278
2	4	4	0	334
3	5	5	0	283
意味 着	3.3	4.7	0.0	298.3
断续器	1.2	0.3	0.0	17.9

表2:不同灭菌方法的细菌计数的原始数据。 将镐在1:100 OP50培养物中浸入无菌水中，然后使用本生燃烧器或微型焚烧炉灭菌。然后将镐浸入无菌水中，接种在LB琼脂^22，23上，并在室温下孵育24小时，并手动计数菌落。阳性对照没有杀菌，阴性对照使用无菌无菌水。n = 每个条件 3 次重复。平均值和 SEM 报告低于单个计数。

讨论

秀丽隐杆线虫 是一种模型生物，非常适合在本科教学实验室进行锻炼。使用微型焚烧炉代替明火在研究实验室和教室实验室中都有好处。事实上，考虑到房间里新培训的科学家的数量，本科实验室课程可能会带来更高的意外火灾风险。此外，当乙醇用于对火焰源附近的器械进行灭菌时，由于乙醇蒸气是可燃的，因此火灾风险增加。便携性还为没有在每个工作台上安装燃气管路的教室带来了优势。该方法已用于我们机构的教学和研究实验室，自2016年成立以来，污染没有增加，实验室安全事故为零。

为了确保与微型焚烧炉的兼容性，测试了一系列具有不同安装，电线成分和线规的镐头。线材成分包括100%铂金和90%铂/10%铱，线材厚度为30-32 G，无论厚度和成分如何，加热方法都不会损害导线的完整性。安装件包括两种不同类型的市售擁柄和巴斯德移液器的自制玻璃支架。请注意，镐不会像在火焰中那样发出红热的光芒。但是，只要灭菌器达到适当的温度，仍然可以实现足够的灭菌。因此，允许微型焚烧炉预热10或20分钟至关重要，如制造商的说明所示。将仪器在腔室中保持至少5秒以实现灭菌也至关重要。将仪器留在腔室中超过7秒不会对仪器造成伤害，但没有必要。虽然这是一个相对简单的过程，步骤最少，并且不太可能需要故障排除，但可能需要一些练习才能学会在不接触侧面的情况下将仪器稳定在枪管中。

为了取代明火，灭菌方法必须涵盖实验室中使用的所有应用。除了灭菌仪器外， 秀丽隐杆线虫 实验室还可以使用本生燃烧器来创建一个无菌场来执行其他任务，例如浇注板或接种培养物¹³。然而，这是否会产生无菌场或吸入仍然可行的污染物仍然存在争议¹⁴。虽然不是所有机构的选择，但生物安全柜或层流罩可用于这些目的，使实验室能够在不使用明火的情况下运行。大多数微型焚烧炉的说明手册建议不要用于手术刀刀片的灭菌，因为内壁的刮擦会损坏灭菌器。但是，如果仔细使用导轨，则可以在不接触内壁的情况下对手术刀刀片或刮刀进行消毒。这扩展了该技术的使用，允许在不使用火焰的情况下进行分块，并允许 秀丽隐杆线虫 实验室在消毒不同物体之间切换技术的情况下运行。

如 表1所述，与基于火焰的方法相比，微型焚烧炉具有更高的安全性，增加了与层流罩的兼容性，并提高了便携性，但存在局限性。它们比其他方法更昂贵，并且在达到灭菌温度之前需要预热时间。总之，这种方法在许多微生物实验室中常规使用，可能适用于一些寻求在不影响无菌的情况下提高实验室安全性的 秀丽隐杆线虫 研究和教学实验室。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
90% platinum 10% iridium wire	Tritech	PT-9010	Other sources and wire compositions may be used.
Agarose	Sigma Aldrich	A6013	LB agar ingredient
Bunsen burner	Fisher Scientific	50-110-1225	Other Bunsen burners may be used
Ethanol Lamp	Carolina	706604	Included here as a reference to Table 1
Lighter	Carolina	706636	Included here as a reference to Table 1
Loop holder accessory	Fisher	22-630-002	Referred to in the manuscript as "guide"
Micro-incinerator	Thomas Scientific	1154J15	There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001),  Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702).
N2 worms	CGC	N2
NaCl	Sigma Aldrich	S5886	LB ingredient
OP50 E. coli	CGC	OP50
Petri dish	Fisher	08-772B
Pick handle	Tritech	TWPH1
Scalpel blade	Fisher	12-000-161
Scalpel handle	Fisher	12-000-164
Spatula	Fisher	14-374	Other spatulas will work
Sterile cell spreaders	VWR	76206-438	Other cell spreaders may be used as long as they are sterile
Tryptone	Sigma Aldrich	T7293	LB ingredient
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625	LB ingredient