使用真空稳定成像系统的实验性急性肺损伤中肺微循环的活体内宽视场荧光显微镜

摘要

活体荧光显微镜可用于实时研究白细胞 - 内皮相互作用和毛细血管灌注。该协议描述了使用真空稳定的肺成像系统在肺微循环中对这些参数进行成像和量化的方法。

摘要

白细胞-内皮相互作用的活体成像为活体动物免疫介导的疾病提供了有价值的见解。急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和其他体内 呼吸系统疾病 的研究由于肺部的可及性和固有的运动伪影有限而很困难。尽管如此，已经制定了各种方法来克服这些挑战。该协议描述了一种用于玻璃体内荧光显微镜的方法，用于在ALI的实验模型中研究肺微循环中的实时白细胞 - 内皮相互作用。使用 体内 肺成像系统和3D打印的活体内显微镜平台来保护麻醉小鼠并稳定肺部，同时最大限度地减少混杂的肺损伤。制备后，使用宽视场荧光显微镜研究白细胞粘附，白细胞滚动和毛细管功能。虽然这里介绍的方案侧重于炎症性肺病急性模型中的成像，但它也可能适用于研究肺部的其他病理和生理过程。

引言

活体显微镜（IVM）是一种有用的成像工具，用于可视化和研究 体内各种生物物理过程。肺 在体内 成像是非常具有挑战性的，因为它的封闭位置，其组织的脆弱性以及呼吸和心跳引起的运动伪影^1，2。已经开发了各种活体显微镜（IVM）装置，用于肺微循环中白细胞 - 内皮相互作用的实时成像，以克服这些挑战。这些方法基于手术暴露和稳定肺部以进行成像。

动物通常通过外科手术为肺病媒体移植做准备。首先，对动物进行插管和通气，这允许手术切除胸窗并随后进行干预以稳定肺部以进行成像。一种技术涉及将实质粘附在玻璃盖玻片³上，该过程可能会对成像组织造成重大的物理创伤。更先进的是利用真空系统在玻璃窗⁴下稳定肺部。这种设置有助于通过分布在大面积区域的可逆真空将肺表面松散地粘附到盖玻片上，并扩大肺，同时仍然限制x，y和z尺寸⁴的运动。真空通过围绕装置成像区域的通道均匀施加，并将组织拉入面向成像级盖玻片⁴的浅锥形区域。通过这个观察窗，可以使用各种光学成像方式研究肺微循环。

肺病媒体能对多种微循环参数进行定量成像。这些包括诸如白细胞轨迹速度和长度⁵，红细胞流速⁶和氧合⁷，肿瘤转移⁸，免疫细胞亚群^9，10，11的^区别，微粒的可视化¹²，肺泡动力学^13，14，血管通透性¹⁵和毛细血管功能¹⁶的测量.这里的重点是白细胞募集和毛细血管功能。肺微循环中白细胞募集的开始涉及白细胞和内皮细胞之间的瞬时滚动相互作用和牢固的粘附相互作用，两者在炎症条件下均增加^16，17。通常，滚动通过操作员定义的参考线的白细胞数量来量化，而粘附则通过内皮¹⁶上不动的白细胞数量来量化。毛细血管功能也可能在炎症状态下受到影响，通常导致灌注减少。这可以归因于几个因素，包括红细胞变形性的降低¹⁸和内皮细胞诱导的NO合酶的杂交表达导致病理性分流¹⁹。通常，测量每个区域灌注毛细血管的聚集长度，并将其报告为功能性毛细血管密度（FCD）。

实时研究肺部白细胞募集需要用荧光染料或荧光标记抗体标记生物靶标²⁰。或者，各种转基因小鼠菌株如溶菌酶M-green荧光蛋白（LysM-GFP）小鼠可用于对特异性免疫细胞亚群（如嗜中性粒细胞^21，22）进行成像。然后可以使用宽视场荧光显微镜，共聚焦显微镜或多光子显微镜观察荧光标记的白细胞。这些技术通过利用特定的激发波长和检测发射的荧光来实现对比度，同时阻断激发波长的检测，从而突出显示标记的物体。

关于小鼠肺白细胞滚动、粘附和功能毛细血管密度量化的现有研究主要依赖于手动视频分析。这是通过开源软件（如斐济^6，23）、专有软件（如CapImage¹²）或定制图像处理系统²⁴实现的。相反，各种专有软件平台（例如，NIS Element，Imaris，Volocity，MetaMorph）可以自动测量各种其他生理参数，包括前面提到的许多^5，6，⁷，^{8，9，10，11，12，13，15}。

关于使用肺病媒的急性肺损伤 （ALI） 和急性呼吸窘迫综合征 （ARDS） 的病理学，已经做出了重要的观察结果。ARDS的特征在于肺部的一系列病理生理过程，包括由内皮和上皮屏障²⁵功能障碍引起的肺水肿和肺泡损伤。使用小鼠模型，已经发现脓毒症诱导的ALI与肺环境中免疫细胞运输的显着有害变化有关²⁶。发现招募到脓毒症诱导的ALI小鼠毛细血管的嗜中性粒细胞阻碍微循环，从而增加ALI²⁶的缺氧。此外，IVM已被用于深入了解ARDS²⁷发作后的潜在修复机制。肺病媒综合防治也是了解各种阻塞性肺疾病病理生理学变化的宝贵工具。例如，囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病中粘液运输的可视化促进了对粘液清除的新型和现有治疗方法的研究²⁸。这些条件下的白细胞运输也进行了分析¹⁷.

该协议扩展了Lamm等人最初描述的方法，^以 使用常规荧光显微镜研究白细胞 - 内皮相互作用。所描述的程序采用 体内 肺成像系统，其中包括16.5 cm x 12.7cm金属底座，显微操作器和真空成像窗口（图1）。该系统安装在20 cm x 23.5 cm的3D打印平台（补充文件1）中，为通风机管和加热垫提供安全连接。该方法为小鼠肺微循环 在体内提供了可重复和可量化的成像。详细解释了手术准备的重要方面以及真空稳定肺成像系统的正确利用。最后，利用ALI实验模型对改变的白细胞滚动、白细胞粘连和与炎症相关的毛细血管灌注进行有代表性的成像和分析。使用该方案应有助于进一步重要研究急性疾病状态下肺部微循环的病理生理学变化。

研究方案

这里描述的所有程序都是在达尔豪斯大学实验动物委员会（UCLA）的事先批准下进行的。

1. 准备工作

1. 肺部成像系统:为了准备窗口，在外圈顶部施用一层薄薄的真空润滑脂，同时避免真空通道的污染。将干净的8毫米玻璃盖玻片放在窗户上，然后轻轻按下以形成密封。
2. 宽视场荧光显微镜:使用配备20x/0.40长工作距离物镜和帧速率为25 FPS的黑白电荷耦合器件（CCD）相机的传统宽视场荧光显微镜进行成像。应用530-550 nm带通激发滤光片以激发Rhodamine-6G，并使用460-490 nm带通滤光片以激发荧光素异硫氰酸酯（FITC）。
3. 真空系统:将成像窗口连接到装有数字压力表的真空泵，该压力表能够提供50-60 mmHg的恒定抽吸，如 补充图1所示。简而言之，通过内径为 1.0 mm 的聚乙烯管、内径为 1.0 cm 的聚乙烯管、真空瓶和在线 0.2 μm 过滤器将成像窗口连接到泵。
4. 呼吸机:设置一个小型啮齿动物呼吸机，以根据小鼠体重计算的速率和体积提供压力控制的通气。在实验期间，在5 cmH₂O下提供呼气末正压（PEEP），并将目标压力设置为20 cmH₂O。
5. 麻醉剂:使用低流量麻醉输送系统，用99.9%异氟醚启动5.0 mL注射器。使用废气清除系统，以最大限度地降低外科医生吸入的风险。

2. 麻醉

1. 将一只20-25g 12周龄的雄性C57Bl / 6小鼠置于麻醉诱导室中。在腔室牢固关闭的情况下，开始以3%浓度和500 mL / min的流速的异氟醚气体进行诱导。
2. 一旦小鼠被麻醉（通过减缓的呼吸速率可视化），将其转移到插管台，并将上门牙固定在悬挂的缝合线上。
3. 拧紧缝合线，将鼻子固定在鼻锥内。气体开始以2.5%的浓度流过鼻锥。
4. 在进入下一步之前，通过脚趾捏合确认足够的麻醉深度。

3. 插管

1. 旋转支架，使支架的背面和鼠标的背侧朝向外科医生。
2. 将20厘米长的光纤电缆的尖端穿过20 G气管插管，并将尖端浸入盐酸利多卡因（1%）中，以促进电缆通过喉部。
3. 使用钝镊子，抬起下颌并移位舌头，以提供进入呼吸道的清晰通道。
4. 插入修改后的耳镜（去除约60°的窥器周长），使上门牙适合窥器的间隙。调整镜面和舌头位置，直到会厌，声带清晰可见。
5. 将装有气管插管的光纤电缆穿过窥器中的间隙插入喉部。使用小的圆周运动，将电缆穿过声带并进入气管。
6. 沿着光纤电缆推动套管，在声带之间穿过并进入气管。

4. 通风

1. 从插管架上取回鼠标，并将其放在右侧侧卧位的加热垫上。
2. 将套管连接到呼吸机管，然后启动呼吸机。将麻醉浓度降低到1.5%，并通过测试踏板反射来监测深度。如果反射持续，则逐渐将浓度提高到高达2%。
3. 将泪水凝胶放在小鼠的眼睛中以防止干燥。
4. 使用医用胶带将插管固定在鼻子上。使用贴标胶带，将右前爪固定在加热垫上，大约在9点钟位置。将左后爪向尾部伸出，并固定在大约6点钟位置。
5. 使用布胶带，轻轻地将左前爪拉伸到12点钟位置，并将胶带的另一端固定在IVM平台的顶部，如图 2A所示（此处保持轻微的张力有助于随后的开胸术）。
6. 插入直肠温度探头，并通过将探头贴在加热垫上来固定探头。将脉搏血氧仪放在右后爪上，并固定在加热垫上，注意不要破坏血液循环。
7. 一旦温度稳定在37.0°C±0.1°C，继续进行开胸手术。

5. 开胸术

1. 用70%酒精擦拭消毒胸部和腹部。涂上一层薄薄的矿物油，以抑制小鼠左侧的头发 - 从胸骨到脊柱，从肩膀到肋骨底部。
2. 用钝镊子和直剪刀，在肋骨底部附近做一个小的纵向切口，以暴露下面的肌肉层。
3. 腹侧移动，使用钝性夹层将上皮和脂肪组织与肌肉层分开。烧灼任何暴露的血管。一旦失血风险得到缓解，将原始切口腹侧延伸至 xiphoid 过程。
4. 在背部重复此过程，直到脊柱外侧约5mm。
5. 颅骨移动，使用钝性夹层暴露肋骨。烧灼任何暴露的血管以保持血流动力学稳定性。
6. 一旦失血的风险得到缓解，将切口从剑突延伸到腋窝。
7. 在切口的背侧重复此过程，直到左耳下约1厘米。
8. 使用止血镊子，抓住解剖的上皮和脂肪组织，并远离手术区域（图2B）。
9. 注射罗丹明-6G溶液（0.5 mg / mL; 1.5 mL / kg）以可视化白细胞和牛FITC-白蛋白（50 mg / mL; 1 mL / kg），以通过尾静脉可视化毛细血管灌注。
10. 使用齿镊子，在末端吸气时抓住紧挨着肺根部位置的肋骨，并稍微缩回以将肋骨从肺部拉开。切开肋骨以诱发气胸。
11. 沿肋间肌向两个方向横向延伸切口，注意不要接触暴露的肺表面。
12. 使用钝镊子，抓住下一个最高的肋骨并稍微缩回，以使肺从胸壁上脱落。如果肺没有脱离，将胸壁轻轻压在肺上，使肺粘附在下面的胸膜上，从而更容易脱落。
13. 继续腹侧原始切口，直到胸骨和颅骨，直到肺顶暴露。使用棉花涂抹器和纱布来减轻任何出血。
14. 抬高胸腔，露出胸腔背侧的肋间血管。注意不要损伤肺部，烧灼靠近脊柱的最下肋间血管，然后切开肋骨。颅骨和腹侧移动，重复直至切除约1 cm x 1.5 cm的肋骨部分（图2C）。
15. 使用小条纱布通过毛细管作用去除胸腔中任何多余的液体积聚。
16. 在进行显微镜检查时，允许胸腔内液体消散约5分钟，以使肺和成像窗口之间的界面更安全。

6. 显微镜

1. 打开真空泵，将压力调节至 ~50–60 mmHg。
2. 将IVM平台转移到显微镜载物台。将金属柱和显微操作器放置在成像窗口的正上方，并且窗臂从大约3点钟位置接近肺。
3. 使用显微操作器，小心地降低成像窗口，直到它粘附并稳定肺表面（图3A）。
4. 使用20x物镜和460-490nm带通激发滤光片，根据血流的收敛模式识别肺静脉。将容器居中在视野中并录制30秒的视频。
   1. 切换到 530-550 nm 带通激励滤波器，并在同一视场内录制 30 秒的视频。
   2. 重复上一步，直到对五个肺小静脉进行成像。
5. 使用460-490 nm带通激发滤光片，根据血流的发散模式识别肺小动脉。将容器居中在视野中并录制30秒的视频。
   1. 切换到 530-550 nm 带通激励滤波器，并在同一视场内录制 30 秒的视频。
   2. 重复上一步，直到对五条肺小动脉进行成像。
6. 使用460-490 nm带通激励滤波器，定位与较大血管不相交的肺泡和毛细管区域，并记录30秒的视频。
   1. 切换到 530-550 nm 带通激励滤波器，并在同一视场内录制 30 秒的视频。
   2. 重复上一步，直到对五个毛细管区域进行成像。

7. 安乐死和清洁规程

1. 从显微镜载物台上取下IVM平台，并将异氟醚递送调整至5%5分钟以对小鼠实施安乐死。
2. 等待时，丢弃盖板玻璃，断开成像窗口与平台的连接。用小刷子清洁成像窗口，并使用插入通道的30 G注射器用蒸馏水冲洗几次。然后，使用真空泵用95%乙醇冲洗。
3. 5分钟后，停止呼吸机，并确保通过宫颈脱位完全安乐死。

结果

为了说明通过该方案可以获得的结果，在成像前6小时使用鼻内细菌脂多糖（LPS）滴注模型诱导急性肺损伤（ALI）。简而言之，用异氟醚麻醉小鼠（n = 3），并将来自铜 绿假单胞菌 在无菌盐水（10mg / mL）中的LPS小液滴以5mg / kg的剂量移液到左肾上腺素中。将其与幼稚小鼠（n = 3;无鼻内给药）进行比较。

在影像学检查后，成功的手术准备可以通过几个因素来识别。肺应相?...

讨论

这里介绍的协议需要练习并注意几个关键步骤。首先，在开始插管和手术之前准备成像窗口很重要。使用最少量的真空润滑脂涂覆成像窗口的外环，涂上盖玻片，并用一滴蒸馏水测试吸力。提前准备可以防止暴露的肺在设置过程中变干。虽然可以用温盐水冲洗，但这样做可能会损害脆弱的肺组织。

插管后，在将鼠标转移到IVM平台时，插管可能偶尔会移位。为了防止这种情况?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use	Becton, Dickinson and Company	309659	1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm	RWD Life Science Co.	F12002-12	Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate	Sigma-Aldrich	A9771-1G	FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v	Canadian Custom Packaging Company	80002455	Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter	Canopus	00631069602029	Digital video converter
B/W - CCD - Camera	Horn Imaging	BC-71	Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Cauterizer
C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories International	C57BL/6NCrl	C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC	Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip	Warner Instruments	64-0701	Glass coverslip
Digital Pressure Gauge	ITM Instruments Inc.	DG2551L0NAM02L0IM&V	Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope	Dr. Mom Otoscopes	1001	Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol	Commercial Alcohols	P016EA95	95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel	Fine Science Tools	14094-11	Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape	Fisher Scientific	1590110	Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump	Cole-Parmer Canada Company	ZA-07061-40	Vacuum pump
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13003-10	Hemostatic forceps
High Vacuum Grease	Dow Corning	DC976VF	Vacuum grease
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2	Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL	Teligent Canada	0121AD01	Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard	Luxidea, Inc.	IMCH-0001	Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil	Teva Canada	00485802	Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit	Kent Scientific Corporation	ETI-MSE	Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope	Leica Microsystems	10 450 022	Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective	Leica Microsystems	566035	20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2"	AMD-Ritmed	A2101-CH	Gauze
Optixcare Eye Lube Plus	Aventix	5914322	Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer	Prusa Research	PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI	3D printer
Oxygen, Compressed	Linde Canada Inc.		Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)	Becton, Dickinson and Company	305106	30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL	Cole-Parmer Canada Company	5340-2L	Vacuum flask
Rhodamine 6 G	Sigma-Aldrich	252433	Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"	Primed	PM5-630709	Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD	Dow Corning	602-205	1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-01, SS-04-module	Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth	World Precision Instruments	501216	Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)	3M	7000002795	Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.	Grainger Canada	USSZUSA-HT3314	1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm	Cole-Parmer Canada Company	6720-5002	Inline 0.2µm filter