真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

要約

生体内蛍光顕微鏡は、白血球 - 内皮相互作用および毛細血管灌流をリアルタイムで研究するために利用することができる。このプロトコルは、真空安定化肺画像化システムを使用して肺微小循環におけるこれらのパラメータを画像化および定量化する方法を記載する。

要約

白血球-内皮相互作用の生体内イメージングは、生きた動物における免疫媒介性疾患に関する貴重な洞察を提供する。急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および他の呼吸器病変の インビボでの 研究は、肺のアクセスが限られており、固有の運動アーチファクトのために困難である。しかし、これらの課題を克服するために、様々なアプローチが開発されてきた。このプロトコールは、ALIの実験モデルにおいて肺微小循環におけるリアルタイムの白血球 - 内皮相互作用を研究するための生体内蛍光顕微鏡法の方法を記載している。 in vivo 肺イメージングシステムと3Dプリントされた生体内顕微鏡プラットフォームを使用して、麻酔をかけられたマウスを固定し、肺の交絡損傷を最小限に抑えながら肺を安定させます。調製後、広視野蛍光顕微鏡を用いて、白血球接着、白血球圧延、毛細血管機能を研究する。ここで提示されるプロトコルは、炎症性肺疾患の急性モデルにおける画像化に焦点を当てているが、肺における他の病理学的および生理学的プロセスを研究するためにも適合され得る。

概要

インバイタル顕微鏡(IVM)は、生体内のさまざまな生物物理学的プロセスを視覚化および研究するための有用なイメージングツールです。肺は、その囲まれた位置、その組織の脆弱な性質、および呼吸および心拍によって誘発される運動アーチファクトのために、インビボで画像化することは非常に困難である^1,2。これらの課題を克服するために、肺微小循環における白血球-内皮相互作用のリアルタイムイメージングのために、さまざまな生体内顕微鏡(IVM)セットアップが開発されています。このようなアプローチは、画像化のために肺を外科的に露出させ、安定化させることに基づいている。

動物は、典型的には、外科的処置によって肺IVMのために調製される。まず、動物を挿管して換気し、胸部窓の外科的切除とその後の介入を可能にして、画像化のために肺を安定させる。1つの技法は、実質をガラスカバースリップ³に接着することを含み、これは、画像化された組織に重大な物理的外傷のリスクを冒す手順である。より高度なのは、ガラス窓⁴の下で肺を安定させるための真空システムの利用である。このセットアップは、広い局所領域に広がる可逆的真空を介して肺表面のカバースリップへの緩やかな接着を容易にし、x、y....

プロトコル

ここで説明するすべての手順は、ダルハウジー大学実験動物委員会(UCLA)の事前承認を得て実施されました。

1. 準備

1. 肺イメージングシステム:窓を準備するには、真空チャンネルの汚染を避けながら、外輪の上部に真空グリースの薄い層を投与します。清潔な8 mmガラスのカバースリップを窓の上に置き、静かに押し下げてシールを作成します。
2. 広視野蛍光顕微鏡:20x/0.40の長い作動距離対物レンズと25FPSの白黒電荷結合素子(CCD)カメラを備えた従来の広視野蛍光顕微鏡でイメージングを行います。530-550 nmのバンドパス励起フィルタを適用してRhodamine-6Gを励起し、460-490 nmのバンドパスフィルタを適用してフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を励起します。
3. 真空システム: 補足図1に示すように、50-60mmHgの一定の吸引を提供できるデジタル圧力計を備えた真空ポンプにイメージングウィンドウを接続します。要するに、1.0 mm の内径ポリエチレンチューブ、1.0 cm の内径ポリエチレンチューブ、真空フラスコ、およびインライン 0.2 μm フィルターを介してイメージングウィンドウをポンプに接続します。
4. 人工呼吸器:マウスの体重に基づいて計算された速度と体積で圧力制御換気を提供するために、小さなげっ歯類人工呼....

結果

このプロトコールを通じて達成可能な結果を例示するために、急性肺損傷(ALI)は、鼻腔内細菌性リポ多糖(LPS)点眼のモデルを用いた画像化の6時間前に誘導された。簡単に言えば、マウス(n = 3)をイソフルランで麻酔し、滅菌生理食塩水(10mg / mL)中の 緑膿菌 からのLPSの小さな液滴を5mg / kgの用量で左ナリスにピペットで移した。これをナイーブマウスと比較した(n=3;鼻腔内投与なし)。

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルでは、いくつかの重要なステップに練習と注意が必要です。まず、挿管や手術を開始する前にイメージングウィンドウを準備することが重要です。最小限の量の真空グリースを使用して、イメージングウィンドウの外輪をコーティングし、カバーガラスを塗布し、蒸留水1滴で吸引をテストします。これを事前に準備しておくと、そうでなければセットアップ中に露.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use	Becton, Dickinson and Company	309659	1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm	RWD Life Science Co.	F12002-12	Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate	Sigma-Aldrich	A9771-1G	FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v	Canadian Custom Packaging Company	80002455	Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter	Canopus	00631069602029	Digital video converter
B/W - CCD - Camera	Horn Imaging	BC-71	Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Cauterizer
C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories International	C57BL/6NCrl	C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC	Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip	Warner Instruments	64-0701	Glass coverslip
Digital Pressure Gauge	ITM Instruments Inc.	DG2551L0NAM02L0IM&V	Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope	Dr. Mom Otoscopes	1001	Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol	Commercial Alcohols	P016EA95	95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel	Fine Science Tools	14094-11	Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape	Fisher Scientific	1590110	Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump	Cole-Parmer Canada Company	ZA-07061-40	Vacuum pump
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13003-10	Hemostatic forceps
High Vacuum Grease	Dow Corning	DC976VF	Vacuum grease
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2	Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL	Teligent Canada	0121AD01	Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard	Luxidea, Inc.	IMCH-0001	Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil	Teva Canada	00485802	Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit	Kent Scientific Corporation	ETI-MSE	Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope	Leica Microsystems	10 450 022	Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective	Leica Microsystems	566035	20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2"	AMD-Ritmed	A2101-CH	Gauze
Optixcare Eye Lube Plus	Aventix	5914322	Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer	Prusa Research	PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI	3D printer
Oxygen, Compressed	Linde Canada Inc.		Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)	Becton, Dickinson and Company	305106	30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL	Cole-Parmer Canada Company	5340-2L	Vacuum flask
Rhodamine 6 G	Sigma-Aldrich	252433	Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"	Primed	PM5-630709	Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD	Dow Corning	602-205	1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-01, SS-04-module	Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth	World Precision Instruments	501216	Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)	3M	7000002795	Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.	Grainger Canada	USSZUSA-HT3314	1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm	Cole-Parmer Canada Company	6720-5002	Inline 0.2µm filter