真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

要約

生体内蛍光顕微鏡は、白血球 - 内皮相互作用および毛細血管灌流をリアルタイムで研究するために利用することができる。このプロトコルは、真空安定化肺画像化システムを使用して肺微小循環におけるこれらのパラメータを画像化および定量化する方法を記載する。

要約

白血球-内皮相互作用の生体内イメージングは、生きた動物における免疫媒介性疾患に関する貴重な洞察を提供する。急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および他の呼吸器病変の インビボでの 研究は、肺のアクセスが限られており、固有の運動アーチファクトのために困難である。しかし、これらの課題を克服するために、様々なアプローチが開発されてきた。このプロトコールは、ALIの実験モデルにおいて肺微小循環におけるリアルタイムの白血球 - 内皮相互作用を研究するための生体内蛍光顕微鏡法の方法を記載している。 in vivo 肺イメージングシステムと3Dプリントされた生体内顕微鏡プラットフォームを使用して、麻酔をかけられたマウスを固定し、肺の交絡損傷を最小限に抑えながら肺を安定させます。調製後、広視野蛍光顕微鏡を用いて、白血球接着、白血球圧延、毛細血管機能を研究する。ここで提示されるプロトコルは、炎症性肺疾患の急性モデルにおける画像化に焦点を当てているが、肺における他の病理学的および生理学的プロセスを研究するためにも適合され得る。

概要

インバイタル顕微鏡(IVM)は、生体内のさまざまな生物物理学的プロセスを視覚化および研究するための有用なイメージングツールです。肺は、その囲まれた位置、その組織の脆弱な性質、および呼吸および心拍によって誘発される運動アーチファクトのために、インビボで画像化することは非常に困難である^1,2。これらの課題を克服するために、肺微小循環における白血球-内皮相互作用のリアルタイムイメージングのために、さまざまな生体内顕微鏡(IVM)セットアップが開発されています。このようなアプローチは、画像化のために肺を外科的に露出させ、安定化させることに基づいている。

動物は、典型的には、外科的処置によって肺IVMのために調製される。まず、動物を挿管して換気し、胸部窓の外科的切除とその後の介入を可能にして、画像化のために肺を安定させる。1つの技法は、実質をガラスカバースリップ³に接着することを含み、これは、画像化された組織に重大な物理的外傷のリスクを冒す手順である。より高度なのは、ガラス窓⁴の下で肺を安定させるための真空システムの利用である。このセットアップは、広い局所領域に広がる可逆的真空を介して肺表面のカバースリップへの緩やかな接着を容易にし、x、y、およびz寸法⁴での動きを制限しながら肺を膨張させる。真空は、セットアップの撮像領域を囲むチャネルを介して均等に適用され、組織を撮像グレードのカバースリップ⁴に面した浅い円錐形領域に引き込む。この覗き窓を通して、肺微小循環は、様々な光学画像化モダリティを用いて研究することができる。

肺IVMは、多数の微小循環パラメータの定量的イメージングを可能にします。これらには、白血球トラック速度および長さ⁵、赤血球流速⁶および酸素化⁷、腫瘍転移⁸、免疫細胞亜集団⁹、^10、11の区別、微粒子12の可視化^、肺胞動態^13、14、血管透過性15^、および毛細血管機能¹⁶などの測定が含まれる。.ここでの焦点は、白血球の動員と毛細血管機能にあります。肺微小循環における白血球動員の開始は、白血球と内皮細胞との間の一過性の転がり相互作用および強固な接着相互作用を伴い、どちらも炎症条件下で増加する^16,17。典型的には、圧延は、オペレータ定義の基準線を通過する白血球の数によって定量化され、一方、接着は、内皮¹⁶上で不動である白血球の数によって定量化される。毛細血管機能はまた、炎症状態において影響を受ける可能性があり、しばしば灌流の減少をもたらす。これは、赤血球変形能^の低下18および病理学的シャント¹⁹をもたらす内皮細胞による誘導性NO合成酵素の多彩な発現を含むいくつかの要因に起因し得る。典型的には、面積当たりの灌流毛細血管の凝集体長が測定され、機能的毛細血管密度(FCD)として報告される。

肺における白血球動員をリアルタイムで研究するには、蛍光色素または蛍光標識抗体²⁰で生物学的標的を標識する必要がある。あるいは、リゾチームM−green蛍光タンパク質(LysM−GFP)マウスなどの様々なトランスジェニックマウス系統を利用して、好中球^21、22などの特異的免疫細胞サブセットを画像化することができる。蛍光標識された白血球は、次いで、広視野蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または多光子顕微鏡を用いて可視化することができる。これらの技術は、特定の励起波長を利用し、放出された蛍光を検出すると同時に、励起波長の検出を遮断することによってコントラストを達成し、標識された物体を強調する。

マウス肺における白血球の転がり、接着、および機能的毛細血管密度の定量化に関する既存の研究は、主に手動ビデオ分析に依存してきた。これは、Fiji ^6,23などのオープンソースソフトウェア、CapImage¹²などの独自のソフトウェア、またはカスタムメイドの画像処理システム²⁴によって可能になります。逆に、様々なプロプライエタリなソフトウェアプラットフォーム(例えば、NIS Element、Imaris、Volocity、MetaMorph)は、ここで以前に言及したものの多くを含む、広範囲の他の生理学的パラメータの自動測定を可能にする⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、^12、13、15。

肺IVMを用いた急性肺損傷(ALI)および急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の病理に関して重要な観察がなされている。ARDSは、肺水腫および肺胞障害を含む肺における多数の病態生理学的プロセスによって特徴付けられる、内皮および上皮障壁²⁵の機能不全によって引き起こされる。マウスモデルを用いて、敗血症誘発性ALIが肺環境における免疫細胞輸送における有意な有害な変化と関連していることが見出された²⁶。敗血症誘発性ALIを有するマウスの毛細血管に動員された好中球は、微小循環を妨害し、それによってALI²⁶における低酸素症を増加させることが見出された。さらに、IVMは、ARDS²⁷の発症後の修復の根底にあるメカニズムについての洞察を得るために使用されている。肺IVMはまた、様々な閉塞性肺疾患における病態生理学的変化を理解する上で貴重なツールとなっている。例えば、嚢胞性線維症(CF)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの疾患における粘液輸送の可視化は、粘液クリアランスに対する新規および既存の治療法の研究を促進している²⁸。これらの条件下での白血球の密売も分析されている¹⁷.

このプロトコールは、Lammら²⁹ によって最初に記載されたアプローチを拡張し、従来の蛍光顕微鏡を用いて白血球-内皮相互作用を研究する。説明されている手順は、16.5 cm x 12.7 cmの金属ベース、マイクロマニピュレータ、および真空イメージングウィンドウを含む in vivo 肺イメージングシステムを採用しています(図1)。このシステムは、20 cm x 23.5 cm の3Dプリントプラットフォーム(補足ファイル1)に取り付けられ、換気チューブと加熱パッドにしっかりと取り付けることができます。この方法は、 インビボでのマウス肺微小循環の再現性および定量化可能なイメージングを提供する。外科的準備の重要な側面、ならびに真空安定化肺画像化システムの適切な利用について詳細に説明される。最後に、ALIの実験モデルを用いて、炎症に関連する変化した白血球転がり、白血球接着、および毛細血管灌流の代表的な画像化および分析を提供する。このプロトコールの使用は、急性疾患状態における肺微小循環の病態生理学的変化に関するさらなる重要な調査を容易にするはずである。

プロトコル

ここで説明するすべての手順は、ダルハウジー大学実験動物委員会(UCLA)の事前承認を得て実施されました。

1. 準備

1. 肺イメージングシステム:窓を準備するには、真空チャンネルの汚染を避けながら、外輪の上部に真空グリースの薄い層を投与します。清潔な8 mmガラスのカバースリップを窓の上に置き、静かに押し下げてシールを作成します。
2. 広視野蛍光顕微鏡:20x/0.40の長い作動距離対物レンズと25FPSの白黒電荷結合素子(CCD)カメラを備えた従来の広視野蛍光顕微鏡でイメージングを行います。530-550 nmのバンドパス励起フィルタを適用してRhodamine-6Gを励起し、460-490 nmのバンドパスフィルタを適用してフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を励起します。
3. 真空システム: 補足図1に示すように、50-60mmHgの一定の吸引を提供できるデジタル圧力計を備えた真空ポンプにイメージングウィンドウを接続します。要するに、1.0 mm の内径ポリエチレンチューブ、1.0 cm の内径ポリエチレンチューブ、真空フラスコ、およびインライン 0.2 μm フィルターを介してイメージングウィンドウをポンプに接続します。
4. 人工呼吸器:マウスの体重に基づいて計算された速度と体積で圧力制御換気を提供するために、小さなげっ歯類人工呼吸器を設定します。実験期間中、5 cmH₂O で正の呼気終末圧力 (PEEP) を提供し、目標圧力を 20 cmH₂O に設定します。
5. 麻酔薬:低流量麻酔送達システムを使用して、5.0mLシリンジに99.9%イソフルランを注油する。廃ガス捕捉システムを使用して、外科医による吸入のリスクを最小限に抑えます。

2.麻酔

1. 20〜25gの12週齢の雄性C57Bl/6マウスを麻酔誘導チャンバーに入れる。チャンバーをしっかりと閉じた状態で、3%の濃度および500mL/minの流量のイソフルランガスで誘導を開始します。
2. マウスを麻酔をかけたら(呼吸速度が遅くなったことで視覚化)、挿管スタンドに移し、上部切歯を吊り下げた縫合糸に固定します。
3. 縫合糸を締めて鼻錐の内側に鼻を固定します。2.5%の濃度でノーズコーンを通るガスの流れを開始します。
4. 次のステップに進む前に、つま先のピンチで麻酔の適切な深さを確認してください。

3. 挿管

1. スタンドの背面とマウスの背側が外科医の方を向くようにスタンドを回転させます。
2. 長さ20cmの光ファイバーケーブルの先端を20Gの気管内カニューレに通し、先端をリドカインHCl(1%)に沈めて、喉頭を通るケーブルの通過を容易にします。
3. 鈍い鉗子を使用して、下顎を持ち上げ、舌を置換して気道への明確な通過を提供します。
4. 上部切歯が鏡の隙間に収まるように修正された耳鏡(鏡面円周の〜60°が取り除かれた)を挿入します。喉頭蓋がはっきりと見えるまでスコープと舌の位置を調整します。
5. 気管内カニューレを装填した光ファイバーケーブルを鏡面の隙間から喉頭に挿入します。小さな円形の動きを使用して、ケーブルを声帯と気管に通します。
6. カニューレを光ファイバーケーブルに沿って押し、声帯の間を通って気管に入ります。

4. 換気

1. 挿管スタンドからマウスを取り出し、右側の横褥瘡位置にある加熱パッドに置きます。
2. カニューレを人工呼吸器チューブに接続し、人工呼吸器を起動します。麻酔薬濃度を1.5%に下げ、ペダル反射をテストして深さを監視します。反射が続く場合は、濃度を徐々に上げて2%まで高めます。
3. 乾燥を防ぐために、マウスの目に涙液を置きます。
4. 医療用テープを使用して、カニューレを鼻に固定します。ラベリングテープを使用して、右前足を加熱パッドに約9時の位置に固定します。左後足を尾側に伸ばし、およそ6時の位置で固定します。
5. 布テープを使用して、左前足を12時位置まで軽く伸ばし、テープのもう一方の端を 図2Aに示すようにIVMプラットフォームの上部に固定します(ここでわずかな張力を維持すると、その後の開胸術が容易になります)。
6. 直腸温度プローブを挿入し、加熱パッドにテーピングしてプローブを固定します。パルスオキシメーターを右後足に置き、循環を乱さないように注意しながら加熱パッドに固定します。
7. 温度が37.0°C±0.1°Cで安定したら、開胸術に進みます。

5.胸部切除術

1. 胸郭と腹部を70%アルコールワイプで滅菌します。ミネラルオイルの軽いコートを塗って、胸骨から椎骨柱まで、そして肩から胸郭の底まで、マウスの左側の髪を湿らせます。
2. 鈍い鉗子とまっすぐなはさみで、胸郭の底の近くに小さな縦方向の切開を行い、下にある筋肉層を露出させます。
3. 腹側を移動し、鈍い郭清を使用して上皮および脂肪組織を筋肉層から分離する。露出した血管を焼灼する。失血のリスクが軽減されたら、元の切開を剣状突起まで腹側に延長する。
4. このプロセスを、椎骨柱の横方向に約5mmまで背側で繰り返す。
5. 頭蓋を動かし、鈍い解剖を使用して胸郭を露出させます。血行動態安定性を維持するために、露出した血管を焼灼する。
6. 失血のリスクが軽減されたら、切開部を剣状突起から腋窩まで広げます。
7. 切り込みの背側で、左耳より約1cm下になるまでこのプロセスを繰り返します。
8. 止血鉗子を用いて、解剖した上皮および脂肪組織をつかみ、手術領域の透明な場所に置く(図2B)。
9. 白血球の可視化のためにローダミン-6G(0.5mg/mL; 1.5mL/kg)の溶液を注入し、尾静脈を介した毛細血管灌流の可視化のためにウシFITCアルブミン(50mg/mL;1mL/kg)を注入する。
10. 歯付き鉗子を使用して、エンドインスピレーションで肺の基部の位置のすぐ下の肋骨をつかみ、わずかに引っ込めて肋骨を肺から引き離します。肋骨を切って気胸を誘発する。
11. 切開部を肋間筋に沿って両方向に横方向に伸ばし、露出した肺表面に触れないように注意してください。
12. 鈍い鉗子を使用して、次に高い肋骨をつかみ、肺が胸壁から離れるようにわずかに引っ込めます。肺が外れない場合は、胸壁を肺に軽く押し付けて、肺が下の胸膜に付着し、より簡単に脱落させます。
13. 胸骨まで腹側および肺の頂点が露出するまで頭蓋に元の切開を続ける。綿のアプリケーターとガーゼを使用して、発生する出血を減衰させます。
14. 胸郭を上げて、胸腔の背側の側面に肋間血管を露出させる。肺を傷つけないように注意し、脊柱の近くにある最も劣った肋間血管を焼灼し、肋骨を切断する。頭蓋および腹側に移動し、胸郭の約1 cm x 1.5 cm部分が切除されるまで繰り返す(図2C)。
15. ガーゼの小さなストリップを使用して毛細血管作用を介して胸腔内の余分な流体蓄積を除去します。
16. 顕微鏡検査を進めている間、胸水が肺とイメージングウィンドウの間のより安全な界面のために散逸するまで約5分間待ちます。

6. 顕微鏡検査

1. 真空ポンプの電源を入れ、圧力を約50~60mmHgに調整します。
2. IVMプラットフォームを顕微鏡ステージに移します。金属製の支柱とマイクロマニピュレーターを、イメージングウィンドウが露出した肺の真上にあり、ウィンドウアームがおよそ3時の位置から肺に近づくように配置します。
3. マイクロマニピュレータを使用して、肺表面に接着して安定するまで、イメージングウィンドウを慎重に下げます(図3A)。
4. 20倍の対物レンズと460-490nmのバンドパス励起フィルターを使用して、血流の収束パターンに基づいて肺静脈を特定します。容器を視野の中央に配置し、30秒のビデオを録画します。
   1. 530-550nmのバンドパス励起フィルタに切り替えて、同じ視野に30秒のビデオを録画します。
   2. 5つの肺静脈が画像化されるまで、前の手順を繰り返します。
5. 460-490nmバンドパス励起フィルターを使用して、血流の発散パターンに基づいて肺細動脈を同定する。容器を視野の中央に配置し、30秒のビデオを録画します。
   1. 530-550nmのバンドパス励起フィルタに切り替えて、同じ視野に30秒のビデオを録画します。
   2. 5つの肺細動脈が画像化されるまで、前のステップを繰り返します。
6. 460~490nmのバンドパス励起フィルターを使用して、より大きな血管と交差していない肺胞と毛細血管の領域を特定し、30秒のビデオを記録します。
   1. 530-550nmのバンドパス励起フィルタに切り替えて、同じ視野に30秒のビデオを録画します。
   2. 5つの毛細血管領域が画像化されるまで、前の手順を繰り返します。

7. 安楽死と清掃プロトコル

1. 顕微鏡ステージからIVMプラットフォームを取り外し、イソフルラン送達を5分間5%に調整してマウスを安楽死させた。
2. 待機中は、カバーガラスを捨て、イメージングウィンドウをプラットフォームから外します。小さなブラシでイメージングウィンドウを清掃し、チャネルに挿入された30Gシリンジを使用して、蒸留水で数回フラッシュします。次いで、真空ポンプを用いて95%エタノールでフラッシュする。
3. 5分が経過したら、人工呼吸器を停止し、子宮頸部脱臼による完全な安楽死を確実にする。

結果

このプロトコールを通じて達成可能な結果を例示するために、急性肺損傷(ALI)は、鼻腔内細菌性リポ多糖(LPS)点眼のモデルを用いた画像化の6時間前に誘導された。簡単に言えば、マウス(n = 3)をイソフルランで麻酔し、滅菌生理食塩水(10mg / mL)中の 緑膿菌 からのLPSの小さな液滴を5mg / kgの用量で左ナリスにピペットで移した。これをナイーブマウスと比較した(n=3;鼻腔内投与なし)。

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルでは、いくつかの重要なステップに練習と注意が必要です。まず、挿管や手術を開始する前にイメージングウィンドウを準備することが重要です。最小限の量の真空グリースを使用して、イメージングウィンドウの外輪をコーティングし、カバーガラスを塗布し、蒸留水1滴で吸引をテストします。これを事前に準備しておくと、そうでなければセットアップ中に露...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use	Becton, Dickinson and Company	309659	1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm	RWD Life Science Co.	F12002-12	Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate	Sigma-Aldrich	A9771-1G	FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v	Canadian Custom Packaging Company	80002455	Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter	Canopus	00631069602029	Digital video converter
B/W - CCD - Camera	Horn Imaging	BC-71	Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Cauterizer
C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories International	C57BL/6NCrl	C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC	Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip	Warner Instruments	64-0701	Glass coverslip
Digital Pressure Gauge	ITM Instruments Inc.	DG2551L0NAM02L0IM&V	Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope	Dr. Mom Otoscopes	1001	Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol	Commercial Alcohols	P016EA95	95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel	Fine Science Tools	14094-11	Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape	Fisher Scientific	1590110	Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump	Cole-Parmer Canada Company	ZA-07061-40	Vacuum pump
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13003-10	Hemostatic forceps
High Vacuum Grease	Dow Corning	DC976VF	Vacuum grease
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2	Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL	Teligent Canada	0121AD01	Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard	Luxidea, Inc.	IMCH-0001	Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil	Teva Canada	00485802	Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit	Kent Scientific Corporation	ETI-MSE	Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope	Leica Microsystems	10 450 022	Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective	Leica Microsystems	566035	20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2"	AMD-Ritmed	A2101-CH	Gauze
Optixcare Eye Lube Plus	Aventix	5914322	Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer	Prusa Research	PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI	3D printer
Oxygen, Compressed	Linde Canada Inc.		Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)	Becton, Dickinson and Company	305106	30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL	Cole-Parmer Canada Company	5340-2L	Vacuum flask
Rhodamine 6 G	Sigma-Aldrich	252433	Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"	Primed	PM5-630709	Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD	Dow Corning	602-205	1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-01, SS-04-module	Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth	World Precision Instruments	501216	Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)	3M	7000002795	Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.	Grainger Canada	USSZUSA-HT3314	1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm	Cole-Parmer Canada Company	6720-5002	Inline 0.2µm filter