Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide

Résumé

La microscopie à fluorescence intravitale peut être utilisée pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales et la perfusion capillaire en temps réel. Ce protocole décrit des méthodes pour imager et quantifier ces paramètres dans la microcirculation pulmonaire à l’aide d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide.

Résumé

L’imagerie intravitale des interactions leucocytaires-endothéliales offre des informations précieuses sur les maladies à médiation immunitaire chez les animaux vivants. L’étude des lésions pulmonaires aiguës (AIP)/syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et d’autres pathologies respiratoires in vivo est difficile en raison de l’accessibilité limitée et des artefacts de mouvement inhérents aux poumons. Néanmoins, diverses approches ont été développées pour surmonter ces défis. Ce protocole décrit une méthode de microscopie à fluorescence intravitale pour étudier en temps réel les interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire dans un modèle expérimental d’ALI. Un système d’imagerie pulmonaire in vivo et une plate-forme de microscopie intravitale imprimée en 3D sont utilisés pour sécuriser la souris anesthésiée et stabiliser le poumon tout en minimisant les lésions pulmonaires confondantes. Après la préparation, la microscopie à fluorescence à grand champ est utilisée pour étudier l’adhésion des leucocytes, le roulement des leucocytes et la fonction capillaire. Bien que le protocole présenté ici se concentre sur l’imagerie dans un modèle aigu de maladie pulmonaire inflammatoire, il peut également être adapté pour étudier d’autres processus pathologiques et physiologiques dans le poumon.

Introduction

La microscopie intravitale (MIV) est un outil d’imagerie utile pour visualiser et étudier divers processus biophysiques in vivo. Le poumon est très difficile à imager in vivo en raison de son emplacement fermé, de la nature fragile de ses tissus et des artefacts de mouvement induits par la respiration et le rythme cardiaque ^1,2. Diverses configurations de microscopie intravitale (MIV) ont été développées pour l’imagerie en temps réel des interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire afin de surmonter ces défis. De telles approches sont basées sur l’exposition chirurgicale et la stabilisation du poumon pour l’imagerie.

Les animaux sont généralement préparés pour la MIV pulmonaire par des interventions chirurgicales. Tout d’abord, les animaux sont intubés et ventilés, ce qui permet l’excision chirurgicale d’une fenêtre thoracique et des interventions ultérieures pour stabiliser le poumon pour l’imagerie. Une technique consiste à coller le parenchyme sur un couvercle de verre³, une procédure qui risque de causer un traumatisme physique important au tissu imagé. Plus avancée est l’utilisation d’un système de vide pour stabiliser le poumon sous une fenêtre en verre⁴. Cette configuration facilite l’adhérence lâche de la surface du poumon au couvercle via un vide réversible réparti sur une grande zone locale et dilate le poumon tout en limitant le mouvement dans les dimensions x, y et z⁴. Le vide est appliqué uniformément à travers un canal entourant la zone d’imagerie de la configuration et tire le tissu dans une région conique peu profonde faisant face au couvercle⁴ de qualité d’imagerie. Grâce à cette fenêtre de visualisation, la microcirculation pulmonaire peut être étudiée à l’aide de diverses modalités d’imagerie optique.

La MIV pulmonaire permet l’imagerie quantitative d’une multitude de paramètres microcirculatoires. Il s’agit notamment de mesures telles que la vitesse et la longueur de la piste des leucocytes⁵, la vitesse^{d’écoulement} des globules rouges 6 et l’oxygénation⁷, les métastases tumorales⁸, la distinction des sous-populations de cellules immunitaires ^9,10,11, la visualisation des microparticules¹², la dynamique alvéolaire ^13,14, la perméabilité vasculaire¹⁵ et la fonction capillaire¹⁶ . L’accent est mis ici sur le recrutement des leucocytes et la fonction capillaire. L’initiation du recrutement des leucocytes dans la microcirculation pulmonaire implique des interactions de roulement transitoires et des interactions adhésives fermes entre les leucocytes et les cellules endothéliales, qui sont toutes deux augmentées dans des conditions inflammatoires^16,17. Typiquement, le laminage est quantifié par le nombre de leucocytes qui passent une ligne de référence définie par l’opérateur, tandis que l’adhérence est quantifiée par le nombre de leucocytes immobiles sur l’endothélium¹⁶. La fonction capillaire peut également être affectée dans les états inflammatoires, entraînant souvent une diminution de la perfusion. Cela peut être attribué à plusieurs facteurs, notamment une réduction de la déformabilité des globules rouges¹⁸ et l’expression panachée de la NO synthase inductible par les cellules endothéliales entraînant une dérivation pathologique¹⁹. En règle générale, la longueur agrégée des capillaires perfusés par zone est mesurée et rapportée en densité capillaire fonctionnelle (FCD).

L’étude du recrutement des leucocytes dans les poumons en temps réel nécessite de marquer des cibles biologiques avec des colorants fluorescents ou des anticorps marqués par fluorescence²⁰. Alternativement, diverses souches de souris transgéniques telles que les souris lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) peuvent être utilisées pour imager des sous-ensembles de cellules immunitaires spécifiques tels que les neutrophiles^21,22. Les leucocytes marqués par fluorescence peuvent ensuite être visualisés à l’aide de la microscopie à fluorescence à grand champ, de la microscopie confocale ou de la microscopie multiphotonique. Ces techniques permettent d’obtenir un contraste en utilisant des longueurs d’onde d’excitation spécifiques et en détectant la fluorescence émise tout en bloquant simultanément la détection de la longueur d’onde d’excitation, mettant ainsi en évidence l’objet étiqueté.

Les recherches existantes concernant la quantification du roulement des leucocytes, de l’adhérence et de la densité capillaire fonctionnelle dans le poumon murin reposent principalement sur l’analyse vidéo manuelle. Ceci est rendu possible grâce à des logiciels open source tels que Fiji ^6,23, des logiciels propriétaires tels que CapImage¹² ou des systèmes de traitement d’image sur mesure²⁴. Inversement, diverses plates-formes logicielles propriétaires (par exemple, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permettent la mesure automatisée d’un large éventail d’autres paramètres physiologiques, y compris beaucoup de ceux mentionnés précédemment ici ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,15}.

Des observations importantes ont été faites concernant la pathologie des lésions pulmonaires aiguës (AIP) et du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) à l’aide de la MIV pulmonaire. Le SDRA est caractérisé par une foule de processus physiopathologiques dans les poumons, y compris l’œdème pulmonaire et les dommages alvéolaires causés par un dysfonctionnement de l’endothélium et de la barrière épithéliale²⁵. En utilisant un modèle murin, il a été constaté que la SA induite par la septicémie est associée à des changements préjudiciables importants dans le trafic de cellules immunitaires dans l’environnement pulmonaire²⁶. Les neutrophiles recrutés dans les capillaires de souris atteintes d’ALI induite par la septicémie ont empêché la microcirculation, augmentant ainsi l’hypoxie dans l’ALI²⁶. En outre, la MIV a été utilisée pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de réparation après l’apparition du SDRA²⁷. La MIV pulmonaire a également été un outil précieux pour comprendre les changements physiopathologiques dans diverses maladies pulmonaires obstructives. Par exemple, la visualisation du transport du mucus dans des maladies telles que la fibrose kystique (FK) et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) a facilité l’étude de traitements nouveaux et existants pour la clairance muqueuse²⁸. Le trafic de leucocytes dans ces conditions a également été analysé¹⁷.

Ce protocole élargit l’approche initialement décrite par Lamm et ^al.29 pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Les procédures décrites utilisent un système d’imagerie pulmonaire in vivo , qui comprend une base métallique de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulateur et une fenêtre d’imagerie sous vide (Figure 1). Le système est monté sur une plate-forme imprimée en 3D de 20 cm x 23,5 cm (fichier supplémentaire 1) afin de fournir une fixation sécurisée pour le tube de ventilateur et le coussin chauffant. Cette méthode offre une imagerie reproductible et quantifiable de la microcirculation pulmonaire murine in vivo. Les aspects importants de la préparation chirurgicale ainsi que l’utilisation correcte d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide sont expliqués en détail. Enfin, un modèle expérimental d’ALI est utilisé pour fournir une imagerie et une analyse représentatives du roulage altéré des leucocytes, de l’adhésion des leucocytes et de la perfusion capillaire associée à l’inflammation. L’utilisation de ce protocole devrait faciliter d’autres recherches importantes sur les changements physiopathologiques de la microcirculation pulmonaire au cours des états pathologiques aigus.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été effectuées avec l’approbation préalable du Comité des animaux de laboratoire de l’Université Dalhousie (UCLA).

1. Préparation

1. Système d’imagerie pulmonaire: Pour préparer la fenêtre, administrer une fine couche de graisse sous vide au sommet de l’anneau extérieur tout en évitant la contamination du canal de vide. Placez un couvercle en verre propre de 8 mm sur la fenêtre et appuyez doucement vers le bas pour créer un joint.
2. Microscope à fluorescence à grand champ : Effectuez des images avec un microscope à fluorescence à grand champ conventionnel équipé d’un objectif à longue distance de travail 20x/0,40 et d’une caméra CCD (Charge-Coupled Device) noir et blanc avec une fréquence d’images de 25 FPS. Appliquez un filtre d’excitation passe-bande de 530-550 nm pour exciter la Rhodamine-6G et un filtre passe-bande de 460-490 nm pour exciter l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
3. Système de vide : Connectez la fenêtre d’imagerie à une pompe à vide équipée d’un manomètre numérique capable de fournir une aspiration constante de 50 à 60 mmHg, comme illustré à la figure supplémentaire 1. En bref, connectez la fenêtre d’imagerie à la pompe à travers un tube en polyéthylène de 1,0 mm d’identification, un tube en polyéthylène de 1,0 cm d’identification, un flacon à vide et un filtre en ligne de 0,2 μm.
4. Ventilateur : Réglez un petit ventilateur pour rongeurs afin de fournir une ventilation à pression contrôlée à un taux et un volume calculés en fonction du poids de la souris. Fournir une pression expiratoire positive (PEEP) à 5 cmH₂O pendant toute la durée de l’expérience et régler la pression cible à 20 cmH₂O.
5. Anesthésique : À l’aide d’un système d’administration d’anesthésie à faible débit, amorcer une seringue de 5,0 mL avec 99,9 % d’isoflurane. Utilisez un système d’épuration des gaz résiduaires pour minimiser le risque d’inhalation par le chirurgien.

2. Anesthésie

1. Placez une souris mâle C57Bl/6 de 20 à 25 g âgée de 12 semaines dans la chambre d’induction de l’anesthésie. Avec la chambre bien fermée, commencez l’induction avec du gaz isoflurane à une concentration de 3% et un débit de 500 mL / min.
2. Une fois la souris anesthésiée (visualisée par un ralentissement de la respiration), transférez-la sur le support d’intubation et fixez les incisives supérieures à la suture suspendue.
3. Serrez la suture pour fixer le museau à l’intérieur du cône du nez. Commencer l’écoulement du gaz à travers le cône de nez à une concentration de 2,5%.
4. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie par pincement des orteils avant de passer à l’étape suivante.

3. Intubation

1. Faites pivoter le support de telle sorte que l’arrière du support et la face dorsale de la souris soient tournés vers le chirurgien.
2. Passez l’extrémité d’un câble à fibre optique de 20 cm de long à travers une canule endotrachéale de 20 G et immergez la pointe dans la lidocaïne HCl (1%) pour faciliter le passage du câble à travers le larynx.
3. À l’aide d’une pince émoussée, soulevez la mâchoire inférieure et déplacez la langue pour assurer un passage clair dans les voies respiratoires.
4. Insérez un otoscope modifié (~60° de circonférence du spéculum enlevée) de sorte que les incisives supérieures s’insèrent dans l’espace du spéculum. Ajustez la portée et la position de la langue jusqu’à ce que l’épiglotte et les cordes vocales soient clairement visibles.
5. Insérez le câble à fibre optique chargé de la canule endotrachéale à travers l’espace dans le spéculum et dans le larynx. À l’aide de petits mouvements circulaires, passez le câble à travers les cordes vocales et dans la trachée.
6. Poussez la canule le long du câble à fibre optique, en passant entre les cordes vocales et dans la trachée.

4. Ventilation

1. Récupérez la souris du support d’intubation et placez-la sur un coussin chauffant en position de décubitus latéral droit.
2. Connectez la canule au tube du ventilateur et démarrez le ventilateur. Réduisez la concentration anesthésique à 1,5% et surveillez la profondeur en testant le réflexe de pédale. Si le réflexe persiste, augmentez progressivement la concentration jusqu’à 2%.
3. Placez le gel lacrymal dans les yeux de la souris pour éviter le dessèchement.
4. À l’aide de ruban adhésif médical, fixez la canule au museau. À l’aide d’un ruban d’étiquetage, fixez la patte avant droite au coussin chauffant à environ 9 heures. Étendez la patte postérieure gauche caudalement et fixez-la à la position de 6 heures environ.
5. À l’aide d’un ruban en tissu, étirez légèrement la patte avant gauche jusqu’à la position de 12 heures et fixez l’autre extrémité de la bande au sommet de la plate-forme IVM comme illustré à la figure 2A (le maintien d’une légère tension facilite ici la thoracotomie ultérieure).
6. Insérez une sonde de température rectale et fixez la sonde en la collant sur le coussin chauffant. Placez un oxymètre de pouls sur la patte arrière droite et fixez-le au coussin chauffant, en prenant soin de ne pas perturber la circulation.
7. Une fois que la température est stable à 37,0 °C ± 0,1 °C, procédez à la thoracotomie.

5. Thoracotomie

1. Stériliser le thorax et l’abdomen avec une lingette à 70% d’alcool. Appliquez une légère couche d’huile minérale pour humidifier les poils du côté gauche de la souris, du sternum à la colonne vertébrale et de l’épaule au bas de la cage thoracique.
2. Avec des pinces contondantes et des ciseaux droits, faites une petite incision longitudinale près du bas de la cage thoracique pour exposer la couche musculaire sous-jacente.
3. En vous déplaçant ventralement, utilisez une dissection émoussée pour séparer le tissu épithélial et adipeux de la couche musculaire. Cautériser tous les vaisseaux sanguins exposés. Une fois que le risque de perte de sang a été atténué, prolongez l’incision d’origine ventralement jusqu’au processus xiphoïde.
4. Répétez ce processus dorsalement jusqu’à ~5 mm latéral à la colonne vertébrale.
5. En vous déplaçant crâniennement, utilisez une dissection émoussée pour exposer la cage thoracique. Cautériser tous les vaisseaux sanguins exposés pour préserver la stabilité hémodynamique.
6. Une fois que le risque de perte de sang a été atténué, étendez l’incision du processus xiphoïde à l’aisselle.
7. Répétez ce processus sur la face dorsale de l’incision jusqu’à ~1 cm inférieur à l’oreille gauche.
8. À l’aide d’une pince hémostatique, saisissez le tissu épithélial et adipeux disséqué et placez-le à l’écart de la zone chirurgicale (figure 2B).
9. Injecter une solution de Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) pour la visualisation des leucocytes et de fitC-albumine bovine (50 mg/mL; 1 mL/kg) pour la visualisation de la perfusion capillaire via la veine caudale.
10. À l’aide d’une pince dentée, saisissez la côte immédiatement inférieure à la position de la base du poumon à l’inspiration finale et rétractez-vous légèrement pour éloigner la côte du poumon. Couper la côte pour induire un pneumothorax.
11. Étendez l’incision latéralement le long du muscle intercostal dans les deux sens, en prenant soin de ne pas toucher la surface pulmonaire exposée.
12. À l’aide d’une pince émoussée, saisissez la côte la plus haute suivante et rétractez-vous légèrement pour permettre au poumon de tomber loin de la paroi thoracique. Si le poumon ne se détache pas, appuyez légèrement sur la paroi thoracique contre le poumon pour que le poumon adhère à la plèvre sous-jacente et tombe ainsi plus facilement.
13. Continuez l’incision d’origine ventralement jusqu’au sternum et crâniennement jusqu’à ce que le sommet du poumon soit exposé. Utilisez des applicateurs de coton et de la gaze pour atténuer tout saignement qui survient.
14. Soulevez la cage thoracique pour exposer les vaisseaux sanguins intercostaux sur l’aspect dorsal de la cavité thoracique. En prenant soin de ne pas endommager le poumon, cautériser le vaisseau intercostal le plus inférieur près de la colonne vertébrale, puis couper la côte. En se déplaçant crâniennement et ventralement, répétez jusqu’à ce qu’une partie d’environ 1 cm x 1,5 cm de la cage thoracique soit excisée (figure 2C).
15. Éliminer tout excès d’accumulation de liquide dans la cavité thoracique par action capillaire à l’aide de petites bandes de gaze.
16. Lors de la microscopie, prévoyez environ 5 minutes pour que le liquide intrapleural se dissipe pour une interface plus sûre entre le poumon et la fenêtre d’imagerie.

6. Microscopie

1. Allumez la pompe à vide et réglez la pression à ~50–60 mmHg.
2. Transférez la plate-forme IVM à l’étape du microscope. Positionnez le poteau métallique et le micromanipulateur de manière à ce que la fenêtre d’imagerie soit directement au-dessus du poumon exposé et que le bras de la fenêtre s’approche du poumon à partir de la position de 3 heures environ.
3. À l’aide du micromanipulateur, abaissez soigneusement la fenêtre d’imagerie jusqu’à ce qu’elle adhère à la surface pulmonaire et la stabilise (figure 3A).
4. À l’aide de l’objectif 20x et du filtre d’excitation passe-bande 460-490 nm, identifiez une veinule pulmonaire en fonction du schéma convergent du flux sanguin. Centrez le navire dans le champ de vision et enregistrez 30 s de vidéo.
   1. Passez au filtre d’excitation passe-bande 530-550 nm et enregistrez 30 s de vidéo dans le même champ de vision.
   2. Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que cinq veinules pulmonaires aient été imagées.
5. À l’aide du filtre d’excitation passe-bande de 460-490 nm, identifiez une artériole pulmonaire en fonction du schéma divergent du flux sanguin. Centrez le navire dans le champ de vision et enregistrez 30 s de vidéo.
   1. Passez au filtre d’excitation passe-bande 530-550 nm et enregistrez 30 s de vidéo dans le même champ de vision.
   2. Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que cinq artérioles pulmonaires aient été imagées.
6. À l’aide du filtre d’excitation passe-bande de 460 à 490 nm, localisez une région d’alvéoles et de capillaires non recoupée par de plus grands vaisseaux et enregistrez 30 s de vidéo.
   1. Passez au filtre d’excitation passe-bande 530-550 nm et enregistrez 30 s de vidéo dans le même champ de vision.
   2. Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que cinq régions capillaires aient été imagées.

7. Protocole d’euthanasie et de nettoyage

1. Retirez la plate-forme IVM de l’étage du microscope et ajustez l’administration d’isoflurane à 5% pendant 5 minutes pour euthanasier la souris.
2. Pendant que vous attendez, jetez la vitre de couverture et déconnectez la fenêtre d’imagerie de la plate-forme. Nettoyez la fenêtre d’imagerie avec une petite brosse et utilisez une seringue de 30 G insérée dans le canal pour la rincer plusieurs fois avec de l’eau distillée. Ensuite, rincez avec de l’éthanol à 95% à l’aide de la pompe à vide.
3. Après 5 minutes, arrêtez le ventilateur et assurez-vous d’une euthanasie complète par luxation cervicale.

Résultats

Pour illustrer les résultats réalisables grâce à ce protocole, une lésion pulmonaire aiguë (AIP) a été induite 6 heures avant l’imagerie à l’aide d’un modèle d’instillation intranasale de lipopolysaccharides bactériens (LPS). Brièvement, les souris (n = 3) ont été anesthésiées avec de l’isoflurane, et de petites gouttelettes de LPS de Pseudomonas aeruginosa dans une solution saline stérile (10 mg / mL) ont été pipetées dans le naris gauche à une dose de 5 mg / kg. Cela a été comp...

Discussion

Le protocole présenté ici nécessite de la pratique et de l’attention à quelques étapes critiques. Tout d’abord, il est important de préparer la fenêtre d’imagerie avant d’initier l’intubation et la chirurgie. Utilisez une quantité minimale de graisse sous vide pour recouvrir l’anneau extérieur de la fenêtre d’imagerie, appliquez le verre de couverture et testez l’aspiration avec une goutte d’eau distillée. Préparer cela à l’avance empêchera le poumon exposé de se dessécher pendant la c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use	Becton, Dickinson and Company	309659	1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm	RWD Life Science Co.	F12002-12	Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate	Sigma-Aldrich	A9771-1G	FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v	Canadian Custom Packaging Company	80002455	Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter	Canopus	00631069602029	Digital video converter
B/W - CCD - Camera	Horn Imaging	BC-71	Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit	Fine Science Tools	18010-00	Cauterizer
C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories International	C57BL/6NCrl	C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators	Puritan	806-WC	Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip	Warner Instruments	64-0701	Glass coverslip
Digital Pressure Gauge	ITM Instruments Inc.	DG2551L0NAM02L0IM&V	Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope	Dr. Mom Otoscopes	1001	Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol	Commercial Alcohols	P016EA95	95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel	Fine Science Tools	14094-11	Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape	Fisher Scientific	1590110	Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump	Cole-Parmer Canada Company	ZA-07061-40	Vacuum pump
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13003-10	Hemostatic forceps
High Vacuum Grease	Dow Corning	DC976VF	Vacuum grease
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2	Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL	Teligent Canada	0121AD01	Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard	Luxidea, Inc.	IMCH-0001	Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil	Teva Canada	00485802	Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit	Kent Scientific Corporation	ETI-MSE	Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope	Leica Microsystems	10 450 022	Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective	Leica Microsystems	566035	20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2"	AMD-Ritmed	A2101-CH	Gauze
Optixcare Eye Lube Plus	Aventix	5914322	Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer	Prusa Research	PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI	3D printer
Oxygen, Compressed	Linde Canada Inc.		Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)	Becton, Dickinson and Company	305106	30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL	Cole-Parmer Canada Company	5340-2L	Vacuum flask
Rhodamine 6 G	Sigma-Aldrich	252433	Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"	Primed	PM5-630709	Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD	Dow Corning	602-205	1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SS-01, SS-04-module	Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth	World Precision Instruments	501216	Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)	3M	7000002795	Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.	Grainger Canada	USSZUSA-HT3314	1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm	Cole-Parmer Canada Company	6720-5002	Inline 0.2µm filter