心血管疾病大型动物模型中心脏的解剖技术和组织学取样

摘要

由于解剖结构复杂，心脏样本的一致可重复解剖和收集方案的实施可能具有挑战性。本手稿介绍了一些标准心脏夹层方案的关键要素，重点介绍了大体检查方法和通常用于组织病理学检查的采样部位。

摘要

标准大体检查和抽样是在大型动物中进行的心血管疾病实验研究的可重复性和成功的关键因素。考虑到心脏的复杂解剖结构、种间差异以及代偿和病理反应的类型，一致的方案很难实施。多种解剖方案的使用通常适应Prosector的经验，个人偏好仍然是实验和观察者间差异的来源。在这里，目的是介绍一些常用物种（包括狗、猪、反刍动物和猫）心脏的主要解剖特征和标志、解剖方案和组织学采样标准，作为心血管疾病的模型。

这里介绍了两种标准的粗体检查方案。首先是流入-流出法，它遵循通过心脏和大血管的生理血流方向（通常用于狗、反刍动物和猪），其次是四腔解剖技术（例如在猫身上）。在某些实验环境中，这两种技术都可以适应任何物种。采样方案包括所有感兴趣的区域（窦房结、心室、室间隔、心房、瓣膜和主动脉），如果操作得当，可提高实验研究的可重复性和可靠性。

引言

由于复杂的解剖结构和早期的严谨性，可能会干扰评估心壁厚度，因此心脏的大体检查具有挑战性，并且容易出现一些与技术相关或解释错误。种间形态变异以及许多临床主要心脏病（包括冠心病、纤维化、动脉炎和淀粉样变性的早期病例）与任何重大变化无关，本质上是组织学病理学。标准化的解剖和组织学样本收集方案可以带来观察者之间的一致性，同时提高心血管疾病实验研究的可比性和可重复性。

样本收集自两只狗（Canis lupus familiaris）（一只3岁的雄性法国斗牛犬和一只8岁的雌性混血犬），一只猫（Felis catus）（一只6岁的雄性欧洲短毛猫），一只家猪（Sus scrofa homeus）（一只1岁，雄性大白猫）和一头牛（Bos taurus）（一只2个月大的雌性荷斯坦犬）。每个选定的物种都有特定的用途作为不同疾病的心血管模型;例如，狗是心律失常建模的首选模型;猫是肥厚型心肌病 （HCM） 的首选，因为它是 HCM 患病率最高的物种;猪被用作急性心肌梗死的模型;反刍动物被用作中毒的模型，因为它们暴露于在草地上很容易找到的毒素¹¹.

在本手稿中，介绍了一种心脏尸检方案和两种解剖方案，旨在改善实验性心血管疾病中心脏的大体和组织学检查。所描述的方案是根据兽医教科书¹、^2、4、⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、¹²、期刊文献³、¹³、^14、官方文件 15 和网络研讨会 ¹⁶ 中的信息开发的^，17.本研究中使用的样本是从提交给USAMV Cluj-Napoca病理部门进行常规尸检诊断的尸体中收获的。

研究方案

该实验方案获得了生物伦理协议（2022 年第 311 号），并获得了克卢日-纳波卡农业科学和兽医大学生物伦理委员会的批准，符合国家（2014 年第 43 号法律）和欧洲（2010 年第 63 号欧盟指令）立法。有关本协议中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 尸检方案

注意:建议对提出的所有物种使用相同的尸检方案，因为在执行时更容易获得^2，12。以下步骤代表在中型犬中进行的尸检。调整对不同受试者进行尸检时的步骤。

1. 称量受试者并将其放在左侧的尸检台上（图1A）。进行受试者的外部检查（通过检查和触诊皮肤和粘膜，注意颜色，稠度和体积的所有变化）。
2. 使用刀（或手术刀）并在右腋窝切开7厘米的切口（图1A）。
3. 找到蜥蜓股连接处（图1A，B）。用刀打开胶囊。切开股骨头的韧带（图1B）。
4. 使用刀将腋窝颅骨的皮肤切口延伸到下颌联合，尾部延伸到会阴（图1B）。
5. 用手术刀去除皮肤，将胸壁和腹壁从腹侧中线暴露到椎体横突的水平（图1B）。
6. 用手术刀和镊子，通过腹壁，腹尾到右肋弓形成皮瓣。用剪刀打开腹腔 - 沿着右侧肋骨的尾部（图1B）。
7. 沿右侧腰旁区域向尾部延伸切口，直到髂外嵴。之后，延长切口，直到耻骨插入白线。
8. 简而言之，原位检查腹部器官（通过注意器官的颜色、稠度、体积和位置的任何变化）。
9. 用手术刀和镊子在最高点刺穿隔膜（图1B）。
10. 通过使用骨切割钳去除具有两个纵向部分的右肋骨进入胸腔。剖断肋骨的胸骨旁软骨段。接下来，剖腹肌的背段，靠近肋关节（图1C）。
11. 原位检查心脏（图1C）。注意大小，位置，颜色，与相邻组织的连接，并通过触诊，一致性的任何^变化9。
    注意:如果存在血栓形成或先天性心脏病，则必须 原位 解剖心脏（这种方法可以对大血管进行全面检查）。
12. 用剪刀检查并打开心包腔，从心脏底部到顶点有纵向切片。检查心包腔和心外膜（注意颜色、稠度和体积的任何变化）¹²。
13. 用剪刀释放心脏，产生主动脉、肺干和双腔静脉的横截面。将上腔静脉切开至右心房入口上方至少 1 厘米处，以保留 终末吼吼^11，13。
14. 检查器官的外部轮廓，心外膜的外观，心外膜透明度的心肌外观以及大血管的外观（图2A）。
    注意:一般来说，心包的开放和检查在物种之间存在一些差异。心包腔的检查始于通过心包整体内容物的透明度进行外部检查和评估1^，2。在猫或狗中，心包通常含有约0.25mL / kg的薄，透明，半透明至浅黄色液体⁹。如果有任何病理性积液，应用无菌注射器或真空管收集。

2. 解剖方案

注意:心脏使用几种尸检技术，每种技术都有几个优点。对于该协议，选择了两种最常用的技术:1）"流入 - 流出法"，该方法可以更好地检查瓣膜和心内膜，并且是用于大多数物种^的方案2，¹¹，¹²，¹⁶和2）"四室解剖"/"超声心动图平面"技术，通常用于猫或小型犬^1，17.

1. 心脏夹层的"流入-流出法"²，¹¹，^12，16
   1. 将心脏放在心房朝上（图2A）。
   2. 使用剪刀和无齿镊子从尾腔静脉沿右心房广泛切开（图2B）。继续切开右耳附件，露出 终末嵴/窦房结（SA 结）。从背视图检查三尖瓣。
   3. 从右心房切一段到右心室和室间隔之间的交界处（图2C）。显示右房室瓣。
   4. 沿室间隔剖段右心室游离壁。继续切片，直到肺干的起源（图2C，D）。
   5. 彻底检查右房室瓣膜，包括 肌腱索和肌（图 2D）。剪断 脊索腱科。
   6. 将镊子穿过肺干并纵向切开躯干（图2E）。检查肺流出道、肺干起源和半月瓣。
   7. 将左心房从肺静脉切到左耳尖（图2F）。从背视图检查二叶瓣（二尖瓣）。
   8. 将心脏置于心室间隔朝下（图2F）。在心室游离壁上从心室底部到心尖做一个大切口。完全显示左房室瓣膜。
   9. 切开左房室瓣尖的腱索。
   10. 将镊子穿过左心室流出道，并将其用作打开主动脉的引导（图2G）。
   11. 使用盐水溶液去除所有血栓。去除所有血凝块后，评估心脏重量并将其与体重表或标准心脏重量表进行比较（表1）^11，13。
   12. 称量心脏。
   13. 如果只有SA淋巴结是兴趣点，则在左心室检查后，将整个心脏完全置于10%中性缓冲福尔马林（NBF）中24小时，并修剪右心房以对 终末嵴进行采样。
       注意:通过这种技术，可以轻松欣赏左心室和右心室。左心室壁和右心室壁厚度之比为3:1，因种属和品种而异;对于动物胎儿的心脏，比例为1:1¹²。

3. 组织学采样方案¹⁶

1. 用手术刀做两个纵向平行切口（相距约5毫米），涉及右心房、三尖瓣和右心室游离壁（图2I）
2. 进行两个纵向平行切口（相距约5 mm），涉及左心房，二尖瓣，背肌和左心室（图2H）。
3. 在心脏背侧上三分之一内，沿着一条线横向剖断心脏底部，包括室间隔、右心房、主动脉、主动脉瓣和三尖瓣（图 2J）。
4. 进行两个纵向平行切口，涉及主动脉底部和室间隔（图2J）。
5. 修剪末端嵴周围的右心房，并提供几个平行部分，横向定向于嵴的纵轴（相距约3-4毫米），以获得SA节点的六个部分（图3，图4I和图5H）。
6. 在组织学盒中修剪获得的组织。
   注意:推荐的阻断方案:步骤 3.1.-组织学模块 1（图 6 显示了此模块生成的载玻片），步骤 3.2.-组织学块 2（图 7 显示了由此块生成的载玻片），步骤 3.4.-组织学块 3（图 8 显示了此块的结果载玻片），步骤 3.5.-组织学块 4（图 9 显示了此块的结果载玻片）。
7. 将组织浸入10%NBF中至少48小时。

4. 冠状动脉取样³，^10，14

1. 使用镊子和手术刀从心旁凹槽中解剖冠状动脉（图4K）。在10%NBF中固定冠状动脉过夜。
2. 如果需要，在 8% 甲酸和盐酸的 1:1 混合物中充分脱钙。
3. 以 3 mm 的间隔进行多次横向切割。将切片放入盒中，然后将盒式磁带放入 10% NBF 中直至嵌入。
   注意:猪可以用作人类的心脏模型，尤其是在冠心病方面。因此，建议补充样本和冠状动脉组织学切片³，^10，14。

5.心脏的"四腔"/"超声心动图平面"解剖技术1^，17

注意:四腔解剖技术包括从心脏底部到顶点的切口，以获得标准视图¹。"四腔"技术最适合应用于固定组织。

1. 将整个心脏放入10%NBF中至少48小时。
2. 将心脏固定在10%NBF中至少48小时后（图10A），放置两个无齿直夹钳，一个通过颅腔 - 右心房 - 三尖瓣 - 右心室，第二个通过肺静脉 - 左心房 - 二尖瓣 - 左心室（图10B）。
3. 使用镊子臂之间的空间作为切割刀片从底部到心脏顶点的指导（图10C）。提供与步骤 5.2 中描述的截面相距约 5 mm 的附加纵向截面。在心脏段，包括主动脉。
4. 用横向切口，将心脏基底与心尖完全分开。将每个组织片段放入组织学盒中。
   注意:推荐的阻断方案:心脏心尖组织学阻滞5（图11A显示由此阻滞产生的载玻片），心脏基底组织学阻滞阻滞6（图11B显示由此阻滞产生的玻片）。
5. 将盒式磁带放入 10% NBF 中直至嵌入。将所有心脏样品固定在10%NBF（超过组织体积的10倍）中，常规在石蜡中处理它们，切片厚度为4μm，并按照先前描述的方案¹⁰用苏木精和伊红染色（H&E染色）染色。
   注意:如果怀疑心肌炎，"应在无菌条件下保留一块新鲜的心脏组织，并带有无菌手术材料和无菌样本容器，用于微生物和病毒研究"¹³。

6. 照片文件

注意:照片文件是尸检检查的可选步骤。然而，摄影和录像对于"准确记录正常和异常解剖结构"^{至关重要3。}

1. 为了获得正确的摄影记录，请在进行"心脏组织的渐进解剖"时拍摄数字图像¹³。请参阅照片记录指南和照片¹⁵ 一般视图 - 前视图和后视图;一片心;和任何可疑病变。

结果

该协议用于可视化解剖特征并收集样本以进行四种不同物种（狗，猫，猪和牛）的心脏组织学检查。在上述每个物种中重复尸检方案，但仅在狗中说明。尸检方案首先对身体进行广泛的外部检查（图1A）（包括皮肤、可探索的淋巴结和外部粘膜），测量整体重量，并对动物的一般状态进行评分。外部检查后，尸检继续进行，身体部分皮肤（旨在彻底检查皮下和浅表肌肉）和?...

讨论

在执行当前协议时，应仔细考虑几个关键步骤以获得一致的结果。在幼年动物中，心脏测量值与成人不同（包括心室壁厚度），通常，心脏占体重的比例更大^11，12。心室肥厚的程度可以通过应用一般体重公式来量化，左心室加隔隔之间的比率除以游离右心室重量，在正常情况下，成熟动物的重量应为2.8-4.0（表1）。如果该比率?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.