Técnicas de disección y muestreo histológico del corazón en grandes modelos animales para enfermedades cardiovasculares

Resumen

Debido a la compleja anatomía, un protocolo de disección y recolección consistentemente reproducible para muestras cardíacas puede ser difícil de implementar. Este manuscrito presenta los elementos clave de algunos protocolos estándar de disección cardíaca, destacando tanto los enfoques de examen macroscópico como los sitios de muestreo comúnmente utilizados para el examen histopatológico.

Resumen

El examen bruto estándar y el muestreo son elementos clave en la reproducibilidad y el éxito de los estudios experimentales de enfermedades cardiovasculares llevados a cabo en animales grandes. Teniendo en cuenta la compleja anatomía del corazón, las diferencias entre especies y los tipos de reacciones compensatorias y patológicas, los protocolos consistentes son difíciles de implementar. La utilización de múltiples protocolos de disección generalmente se adapta a la experiencia del prosector, y la preferencia personal sigue siendo una fuente de variabilidad experimental e interobservador. Aquí, el objetivo es presentar las principales características anatómicas y puntos de referencia, protocolos de disección y estándares de muestreo histológico del corazón en algunas especies de uso común (incluidos perros, cerdos, rumiantes y gatos) como modelos de enfermedades cardiovasculares.

Aquí se presentan dos protocolos estándar de examen bruto. Primero, el método de entrada-salida, que sigue la dirección fisiológica del flujo sanguíneo a través del corazón y los vasos grandes (utilizado con frecuencia en perros, rumiantes y cerdos), y segundo, la técnica de disección de cuatro cámaras (ejemplificada en gatos). Ambas técnicas pueden adaptarse a cualquier especie en determinadas circunstancias experimentales. Los protocolos de muestreo incluyen todas las áreas de interés (ganglio sinoauricular, ventrículos, tabique interventricular, aurículas, válvulas y aorta) y, si se llevan a cabo correctamente, mejoran tanto la reproducibilidad como la fiabilidad de los estudios experimentales.

Introducción

Debido a la compleja anatomía y el rigor temprano, que pueden interferir con la evaluación del grosor de la pared cardíaca, el examen macroscópico del corazón es desafiante y propenso a varios errores relacionados con la técnica o la interpretación. Esto se ve amplificado por las variaciones morfológicas interespecíficas y por el hecho de que muchas patologías cardíacas clínicas mayores (incluidos los casos tempranos de enfermedades coronarias, fibrosis, arteritis y amiloidosis) no están asociadas con ningún cambio macroscópico, siendo, en esencia, patologías histológicas. Un protocolo estandarizado de disección y recolección de muestras histológicas puede aportar consistencia entre los observadores y, al mismo tiempo, comparabilidad y reproducibilidad de los estudios experimentales de enfermedades cardiovasculares.

Las muestras se recolectaron de dos perros (Canis lupus familiaris) (un Bulldog Francés macho de 3 años y una hembra de raza mixta de 8 años), un gato (Felis catus) (un macho europeo de pelo corto macho de 6 años), un cerdo doméstico (Sus scrofa domesticus) (un macho de 1 año, Large White) y una vaca (Bos taurus) (una Holstein hembra de 2 meses). Cada una de las especies elegidas tiene un uso particular como modelo cardiovascular para una enfermedad diferente; Por ejemplo, los perros son un modelo preferido para el modelado de arritmias; los gatos son preferidos para la miocardiopatía hipertrófica (MCH), ya que es la especie con mayor prevalencia de MCH; los cerdos se utilizan como modelo para el infarto agudo de miocardio; y los rumiantes se utilizan como modelo para la intoxicación debido a su exposición a toxinas que se pueden encontrar fácilmente en los prados¹¹.

En este manuscrito, se presentan un protocolo de necropsia y dos protocolos de disección del corazón, diseñados para mejorar el examen macroscópico e histológico del corazón en enfermedades cardiovasculares experimentales. Los protocolos descritos fueron desarrollados con base en información de los libros de texto veterinarios 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, literatura de revistas 3,13,14^, documentos oficiales 15 y webinars ^{16 ,17}. Las muestras utilizadas en este estudio fueron recolectadas de cadáveres enviados al Departamento de Patología de la USAMV Cluj-Napoca para el diagnóstico de autopsia de rutina.

Protocolo

El protocolo experimental recibió un acuerdo bioético (No. 311 de 2022) y fue aprobado por el Comité de Bioética de la Universidad de Ciencias Agrícolas y Medicina Veterinaria de Cluj-Napoca, en cumplimiento de la legislación nacional (Ley No. 43 de 2014) y europea (Directiva de la UE No 63 de 2010). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Protocolo de necropsia

NOTA: Se recomienda que se utilice el mismo protocolo de necropsia para todas las especies presentadas debido a la facilidad de acceso que es cuando se realiza ^2,12. Los siguientes pasos representan la necropsia realizada en un perro de tamaño mediano. Adaptar los pasos a la hora de realizar necropsias en diferentes sujetos.

1. Pese el sujeto y colóquelo en la mesa de necropsia en su lado izquierdo (Figura 1A). Proceda al examen externo del sujeto (inspeccionando y palpando los cutis y las mucosas, observando todos los cambios en el color, la consistencia y el volumen).
2. Use un cuchillo (o un bisturí) y haga una incisión de 7 cm en la axila derecha (Figura 1A).
3. Localice la unión coxofemoral (Figura 1A,B). Abra la cápsula con un cuchillo. Cortar el ligamento de la cabeza del fémur (Figura 1B).
4. Use el cuchillo para extender la incisión cutánea en el cráneo de la axila hasta la sínfisis mandibular y caudalmente hasta el perineo (Figura 1B).
5. Retirar la piel con el bisturí y exponer la pared torácica y abdominal desde la línea media ventral hasta el nivel de las apófisis transversales vertebrales (Figura 1B).
6. Con el bisturí y los fórceps, crea un colgajo a través de la pared abdominal, ventrocaudal hasta el arco costal derecho. Abra la cavidad abdominal con tijeras: siga la cara caudal del hipocondrio derecho (Figura 1B).
7. Extienda la incisión caudalmente a lo largo de la zona paralumbar derecha hasta la cresta ilíaca externa. Después, extender la incisión hasta la inserción púbica de la línea alba.
8. Brevemente, examine los órganos abdominales in situ (observando cualquier cambio en el color, la consistencia, el volumen y la posición de los órganos).
9. Con el bisturí y las pinzas, perfore el diafragma en el punto más alto (Figura 1B).
10. Ingrese a la cavidad torácica retirando la caja torácica derecha con dos secciones longitudinales usando pinzas de corte óseo. Sección del segmento cartilaginoso paraesternal de las costillas. A continuación, se secciona el segmento dorsal de las costillas, proximal a las articulaciones costovertebrales (Figura 1C).
11. Examinar el corazón in situ (Figura 1C). Observe el tamaño, la posición, el color, las conexiones con los tejidos adyacentes y, por palpación, cualquier cambio en la consistencia⁹.
    NOTA: Si hay una trombosis o enfermedad cardíaca congénita, el corazón debe diseccionarse in situ (este enfoque permite un examen completo de los vasos grandes).
12. Use tijeras para examinar y abrir la cavidad pericárdica con una sección longitudinal desde la base hasta el ápice del corazón. Examinar la cavidad pericárdica y el epicardio (observando cualquier cambio en el color, la consistencia y el volumen)¹².
13. Libere el corazón con tijeras, produciendo secciones transversales de la aorta, el tronco pulmonar y ambas venas cavas. Seccionar la vena cava superior al menos 1 cm por encima de la entrada en la aurícula derecha para preservar la crista terminalis^11,13.
14. Examine el contorno externo del órgano, la apariencia del epicardio, la apariencia del miocardio por la transparencia del epicardio y la apariencia externa de los vasos grandes (Figura 2A).
    NOTA: En general, la apertura y el examen del pericardio presentan algunas diferencias entre las especies. El examen de la cavidad pericárdica comienza con una inspección externa y una evaluación a través de la transparencia del pericardio del contenido pericárdico general ^1,2. En un gato o un perro, el pericardio contiene típicamente alrededor de 0,25 ml/kg de líquido delgado, transparente, translúcido a amarillo claro⁹. Si hay derrames patológicos, deben recogerse con una jeringa estéril o un tubo de vacutainer.

2. Protocolo de disección

NOTA: Se utilizan varias técnicas de necropsia para el corazón, cada una con varias ventajas. Para este protocolo, se eligieron dos de las técnicas más utilizadas: 1) el "método de entrada-salida", que permite un mejor examen de las válvulas y el endocardio y es un protocolo utilizado para la mayoría de las especies 2,11,12,16, y²) la técnica de "disección de cuatro cámaras"/"plano ecocardiográfico", típicamente utilizada para gatos o perros de tamaño pequeño ^{1, 17}.

1. El "método de entrada-salida" para la disección cardíaca 2,11,12,16
   1. Coloque el corazón con la cara auricular hacia arriba (Figura 2A).
   2. Use tijeras y fórceps sin dientes para cortar ampliamente desde la vena cava caudal hasta la aurícula derecha (Figura 2B). Continúe el corte hasta el apéndice auricular derecho para exponer el nódulo terminal/sinoauricular (nódulo SA). Inspeccione la válvula tricúspide desde la vista dorsal.
   3. Corte una sección desde la aurícula derecha hasta la unión entre el ventrículo derecho y el tabique interventricular (Figura 2C). Muestre la válvula auriculoventricular derecha.
   4. Seccionar la pared libre del ventrículo derecho a lo largo del tabique interventricular. Continuar la sección hasta el origen del tronco pulmonar (Figura 2C,D).
   5. Examine minuciosamente las válvulas auriculoventriculares derechas, incluidas las cuerdas tendinosas y los músculos papilares (Figura 2D). Cortar las cuerdas tendinosas.
   6. Coloque fórceps a través del tronco pulmonar y corte el tronco longitudinalmente (Figura 2E). Examine el tracto de salida pulmonar, el origen del tronco pulmonar y las válvulas semilunares.
   7. Corte la aurícula izquierda desde las venas pulmonares hasta la punta de la aurícula izquierda (Figura 2F). Inspeccione la válvula bicúspide (mitral) desde la vista dorsal.
   8. Coloque el corazón con el tabique interventricular hacia abajo (Figura 2F). Haga una incisión grande en la pared libre del ventrículo desde la base del ventrículo hasta el ápice cardíaco. Muestre completamente la válvula auriculoventricular izquierda.
   9. Cortar las cuerdas tendinosas de la cúspide de la válvula auriculoventricular izquierda.
   10. Coloque fórceps a través del tracto de salida del ventrículo izquierdo y utilícelo como guía para abrir la aorta (Figura 2G).
   11. Use solución salina para eliminar todos los coágulos de sangre. Una vez eliminados todos los coágulos sanguíneos, evaluar y comparar el peso cardíaco con la masa corporal o las tablas estándar de peso cardíaco (Tabla 1)^11,13.
   12. Pesa el corazón.
   13. Si solo el nódulo SA es el punto de interés, después del examen del ventrículo izquierdo, coloque todo el corazón completamente en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% durante 24 h y recorte la aurícula derecha para tomar muestras de la crista terminal.
       NOTA: Mediante esta técnica, los ventrículos izquierdo y derecho se pueden apreciar fácilmente. La relación entre el grosor de la pared ventricular izquierda y derecha es de 3:1, con pequeñas diferencias por especie y raza; Para el corazón del feto animal, la proporción es 1: 1¹².

3. Protocolo de muestreo para histología¹⁶

1. Con un bisturí, haga dos cortes longitudinales paralelos (aproximadamente 5 mm de separación) que involucren la aurícula derecha, la válvula tricúspide y la pared libre del ventrículo derecho (Figura 2I)
2. Hacer dos cortes paralelos longitudinales (aproximadamente 5 mm de separación) que involucran la aurícula izquierda, la válvula mitral, el músculo papilar dorsal y el ventrículo izquierdo (Figura 2H).
3. Dentro del tercio superior dorsal del corazón, seccionar transversalmente la base del corazón siguiendo una línea, incluyendo el tabique interventricular, la aurícula derecha, la aorta, la válvula aórtica y la válvula tricúspide (Figura 2J).
4. Hacer dos cortes longitudinales paralelos que involucran la base de la aorta y el tabique interventricular (Figura 2J).
5. Recorte la aurícula derecha alrededor de la crista terminalis y proporcione varias secciones paralelas orientadas transversalmente en el eje longitudinal de la crista (aproximadamente 3-4 mm de distancia) para obtener seis piezas del nodo SA (Figura 3, Figura 4I y Figura 5H).
6. Recortar los tejidos obtenidos en casetes histológicos.
   NOTA: Protocolo de bloqueo recomendado: paso 3.1.-Bloque histológico 1 (Figura 6 muestra el portaobjetos resultante de este bloque), paso 3.2.-Bloque histológico 2 (Figura 7 muestra el portaobjetos resultante de este bloque), Paso 3.4.-Bloque histológico 3 (Figura 8 muestra el portaobjetos resultante de este bloque), Paso 3.5.-Bloque histológico 4 (La figura 9 muestra el portaobjetos resultante de este bloque).
7. Sumerja los tejidos en NBF al 10% durante al menos 48 h.

4. Muestreo de arterias coronarias ^3,10,14

1. Use fórceps y un bisturí para diseccionar las arterias coronarias del surco paraconal cardíaco (Figura 4K). Arregle la arteria coronaria durante la noche en NBF al 10%.
2. Si es necesario, descalcifique adecuadamente en una mezcla 1: 1 de ácido fórmico al 8% y ácido clorhídrico.
3. Realice múltiples cortes transversales a intervalos de 3 mm. Coloque las secciones en un casete y luego coloque el casete en 10% NBF hasta la incrustación.
   NOTA: Los cerdos se pueden usar como modelo cardíaco para humanos, especialmente cuando se trata de enfermedades coronarias. Así, se recomiendan muestras suplementarias y secciones histológicas de arterias coronarias 3,10,14.

5. La técnica de disección del corazón "cuatro cámaras"/"plano ecocardiográfico" ^1,17

NOTA: La técnica de disección de cuatro cámaras consiste en un corte desde la base hasta el ápice del corazón para obtener la vista estándar¹. La técnica de "cuatro cámaras" se aplica mejor a tejidos fijos.

1. Coloque todo el corazón en 10% de NBF durante al menos 48 h.
2. Después de fijar el corazón en NBF al 10% durante al menos 48 h (Figura 10A), coloque dos pinzas de disección recta sin dientes, una a través de la cava craneal-aurícula derecha-válvula tricúspide-ventrículo derecho, y la segunda a través de la vena pulmonar-aurícula izquierda-válvula mitral-ventrículo izquierdo (Figura 10B).
3. Utilice el espacio entre los brazos con fórceps como guía para la cuchilla cortante desde la base hasta el ápice del corazón (Figura 10C). Proporcione una sección longitudinal adicional de aproximadamente 5 mm aparte de la sección descrita en el paso 5.2. en el segmento cardíaco, que incluye la aorta.
4. Con una incisión transversal, separe completamente la base cardíaca del ápice. Coloque cada segmento de tejido en un casete histológico.
   NOTA: Protocolo de bloqueo recomendado: el bloque 5 cardio-histológico del ápice cardíaco (la figura 11A muestra el portaobjetos resultante de este bloqueo), el bloque histológico de base cardíaca 6 (la figura 11B muestra el portaobjetos resultante de este bloqueo).
5. Coloque los casetes en 10% NBF hasta que se incrusten. Fijar todas las muestras cardíacas en NBF al 10% (más de 10 veces el volumen de tejido), procesarlas rutinariamente en cera de parafina, sección a 4 μm de espesor, y teñir con hematoxilina y tinción de eosina (tinción H&E) siguiendo un protocolo descrito previamente¹⁰.
   NOTA: Si se sospecha miocarditis, "un pedazo de tejido cardíaco fresco debe ser retenido en condiciones estériles con material quirúrgico estéril y recipiente de muestra estéril para estudios microbiológicos y virales"¹³.

6. Documentación fotográfica

NOTA: La documentación fotográfica es un paso opcional en el examen de necropsia. Sin embargo, las grabaciones de fotografía y video son esenciales para tener una "documentación precisa de la anatomía normal y anormal"³.

1. Para una documentación fotográfica adecuada, tome imágenes digitales mientras realiza una "disección progresiva de los tejidos cardíacos"¹³. Consulte las directrices para la documentación fotográfica y la fotografía¹⁵ la vista general-anterior y posterior; una rebanada del corazón; y cualquier sospecha de lesiones.

Resultados

Este protocolo se utilizó para visualizar las características anatómicas y recolectar muestras para el examen histológico del corazón en cuatro especies diferentes (perro, gato, cerdo y vaca). El protocolo de necropsia se repitió en cada una de las especies mencionadas anteriormente, pero se ilustró solo en perros. El protocolo de necropsia comienza con un examen externo extenso del cuerpo (Figura 1A) (incluyendo la piel, los ganglios linfáticos explorables y la mucosa exterior), mid...

Discusión

Al realizar el protocolo actual, se deben considerar cuidadosamente varios pasos críticos para obtener resultados consistentes. En animales jóvenes, las medidas cardíacas son diferentes de las de los adultos (incluido el grosor de la pared ventricular) y, en general, el corazón representa una mayor proporción del peso corporal^11,12. El grado de hipertrofia ventricular se puede cuantificar aplicando una fórmula de peso general, la relación entre el ventríc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.