Técnicas de Dissecção e Amostragem Histológica do Coração em Modelos de Grandes Animais para Doenças Cardiovasculares

Resumo

Devido à anatomia complexa, um protocolo de dissecção e colheita consistentemente reprodutível para amostras cardíacas pode ser difícil de implementar. Este manuscrito apresenta os elementos-chave de alguns protocolos padrão de dissecção cardíaca, destacando tanto as abordagens de exame macroscópica quanto os locais de amostragem comumente utilizados para o exame histopatológico.

Resumo

O exame grosseiro padrão e a amostragem são elementos-chave na reprodutibilidade e sucesso de estudos experimentais de doenças cardiovasculares realizados em animais de grande porte. Considerando a complexa anatomia do coração, as diferenças entre espécies e os tipos de reações compensatórias e patológicas, protocolos consistentes são difíceis de implementar. A utilização de protocolos de dissecção múltipla é geralmente adaptada para se adequar à experiência do pró-setor, e a preferência pessoal continua a ser uma fonte de variabilidade experimental e interobservador. Aqui, o objetivo é apresentar as principais características anatômicas e marcos, protocolos de dissecção e padrões de amostragem histológica do coração em algumas espécies comumente utilizadas (incluindo cães, suínos, ruminantes e gatos) como modelos de doenças cardiovasculares.

Dois protocolos de exame grosseiro padrão são apresentados aqui. Primeiro, o método de entrada-saída, que segue a direção fisiológica do fluxo sanguíneo através do coração e grandes vasos (frequentemente usado em cães, ruminantes e porcos), e segundo, a técnica de dissecção de quatro câmaras (exemplificada em gatos). Ambas as técnicas podem ser adaptadas a qualquer espécie em determinadas circunstâncias experimentais. Os protocolos de amostragem incluem todas as áreas de interesse (linfonodo sinoatrial, ventrículos, septo interventricular, átrios, válvulas e aorta) e, se bem realizados, melhoram tanto a reprodutibilidade quanto a confiabilidade dos estudos experimentais.

Introdução

Devido à anatomia complexa e ao rigor precoce, que podem interferir na avaliação da espessura da parede cardíaca, o exame macroscópica do coração é desafiador e propenso a vários erros relacionados à técnica ou de interpretação. Isso é amplificado pelas variações morfológicas interespecíficas e pelo fato de que muitas patologias cardíacas clínicas importantes (incluindo casos precoces de doenças coronarianas, fibrose, arterite e amiloidose) não estão associadas a alterações macroscópicas, sendo, em essência, patologias histológicas. Um protocolo padronizado de dissecção e colheita histológica de amostras pode trazer consistência entre os observadores e, ao mesmo tempo, comparabilidade e reprodutibilidade de estudos experimentais de doenças cardiovasculares.

As amostras foram coletadas de dois cães (Canis lupus familiaris) (um buldogue francês macho de 3 anos de idade e uma mestiça fêmea de 8 anos), um gato (Felis catus) (um macho de 6 anos de idade, de pelo curto europeu macho), um porco doméstico (Sus scrofa domesticus) (um macho de 1 ano, macho Large White) e uma vaca (Bos taurus) (uma Holstein fêmea de 2 meses de idade). Cada uma das espécies escolhidas tem uso particular como modelo cardiovascular para uma doença diferente; por exemplo, os cães são um modelo preferido para a modelagem de arritmia; os gatos são preferidos para cardiomiopatia hipertrófica (CMH), por ser a espécie com maior prevalência de CMH; suínos são utilizados como modelo para infarto agudo do miocárdio; e os ruminantes são utilizados como modelo de intoxicação devido à sua exposição a toxinas que podem ser facilmente encontradas em prados¹¹.

Neste manuscrito, são apresentados um protocolo de necropsia e dois protocolos de dissecção do coração, destinados a melhorar o exame macroscópica e histológico do coração em doenças cardiovasculares experimentais. Os protocolos descritos foram desenvolvidos com base em informações de livros didáticos veterinários ^{1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12}, literatura de periódicos 3,13,14^, documentos oficiais 15 e webinars ^{16 ,17}. As amostras utilizadas neste estudo foram colhidas de cadáveres submetidos ao Departamento de Patologia da USAMV Cluj-Napoca para diagnóstico de autópsia de rotina.

Protocolo

O protocolo experimental recebeu acordo bioético (nº 311 de 2022) e foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária Cluj-Napoca, em conformidade com a legislação nacional (Lei nº 43 de 2014) e europeia (Diretiva da UE nº 63 de 2010). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo.

1. Protocolo de necropsia

NOTA: Recomenda-se que o mesmo protocolo de necropsia seja utilizado para todas as espécies apresentadas, devido à facilidade de acesso quando realizada ^2,12. Os passos a seguir representam a necropsia realizada em um cão de tamanho médio. Adapte os passos ao realizar necropsias em diferentes sujeitos.

1. Pese o sujeito e coloque-o sobre a mesa de necropsia do lado esquerdo (Figura 1A). Proceder ao exame externo do sujeito (inspecionando e palpação da cútis e mucosas, observando todas as alterações de cor, consistência e volume).
2. Use uma faca (ou bisturi) e faça uma incisão de 7 cm na axila direita (Figura 1A).
3. Localizar a junção coxofemoral (Figura 1A,B). Abra a cápsula com uma faca. Corte do ligamento da cabeça do fêmur (Figura 1B).
4. Use a faca para estender a incisão cutânea na axila craniana para a sínfise mandibular e caudalmente para o períneo (Figura 1B).
5. Retirar a pele com o bisturi e expor a parede torácica e abdominal da linha média ventral até o nível dos processos transversais vertebrais (Figura 1B).
6. Com o bisturi e a pinça, crie um retalho através da parede abdominal, ventrocaudal ao arco costal direito. Abra a cavidade abdominal com tesoura - siga a face caudal do hipocôndrio direito (Figura 1B).
7. Estender a incisão caudalmente ao longo da área paralombar direita até a crista ilíaca externa. Depois, estenda a incisão até a inserção púbica da linha alba.
8. Resumidamente, examine os órgãos abdominais in situ (observando quaisquer alterações nas mudanças de cor, consistência, volume e posição dos órgãos).
9. Com o bisturi e a pinça, puncione o diafragma no ponto mais alto (Figura 1B).
10. Entre na cavidade torácica removendo a caixa torácica direita com duas seções longitudinais usando pinça de corte ósseo. Seção do segmento cartilaginoso paraesternal das costelas. Em seguida, corte o segmento dorsal das costelas, proximal às articulações costovertebrais (Figura 1C).
11. Examine o coração in situ (Figura 1C). Observe o tamanho, a posição, a cor, as conexões com os tecidos adjacentes e, por palpação, quaisquer alterações na consistência⁹.
    NOTA: Se uma trombose ou doença cardíaca congênita estiver presente, o coração deve ser dissecado in situ (esta abordagem permite o exame completo dos grandes vasos).
12. Use uma tesoura para examinar e abrir a cavidade pericárdica com uma seção longitudinal da base até o ápice do coração. Examine a cavidade pericárdica e o epicárdio (observando quaisquer alterações na cor, consistência e volume)¹².
13. Solte o coração com uma tesoura, produzindo cortes transversais da aorta, tronco pulmonar e ambas as veias cavas. Seção da veia cava superior pelo menos 1 cm acima da entrada no átrio direito para preservar a crista terminalis^11,13.
14. Examine o contorno externo do órgão, a aparência do epicárdio, o aparecimento do miocárdio pela transparência do epicárdio e a aparência externa dos grandes vasos (Figura 2A).
    NOTA: Em geral, a abertura e o exame do pericárdio apresentam algumas diferenças entre as espécies. O exame da cavidade pericárdica inicia-se com uma inspeção externa e avaliação através da transparência do pericárdio do conteúdo pericárdico global ^1,2. Em um gato ou cão, o pericárdio normalmente contém cerca de 0,25 mL/kg de líquido fino, límpido, translúcido a amarelo claro⁹. Se houver derrames patológicos, eles devem ser coletados com uma seringa estéril ou tubo vacutainer.

2. Protocolo de dissecação

NOTA: Várias técnicas de necropsia são usadas para o coração, cada uma com várias vantagens. Para este protocolo, foram escolhidas duas das técnicas mais utilizadas: 1) o "método de entrada-saída", que permite um melhor exame das valvas e do endocárdio e é um protocolo utilizado para a maioria das espécies 2,11,12,16, e²) a técnica de "dissecção de quatro câmaras"/"plano ecocardiográfico", tipicamente utilizada para gatos ou cães de pequeno porte ^{1, 17}.

1. O "método de entrada-saída" para dissecção cardíaca 2,11,12,16
   1. Coloque o coração com a face atrial para cima (Figura 2A).
   2. Use tesouras e pinças desdentadas para cortar amplamente da veia cava caudal ao longo do átrio direito (Figura 2B). Continue o corte até o apêndice auricular direito para expor a crista terminalis/nó sinoatrial (nó SA). Inspecione a valva tricúspide a partir da vista dorsal.
   3. Corte de um corte do átrio direito até a junção entre o ventrículo direito e o septo interventricular (Figura 2C). Exibir a válvula atrioventricular direita.
   4. Seção da parede livre do ventrículo direito ao longo do septo interventricular. Continue a secção até a origem do tronco pulmonar (Figura 2C,D).
   5. Examinar minuciosamente as valvas atrioventriculares direitas, incluindo as cordas tendíneas, e os músculos papilares (Figura 2D). Corte os acordes tendineae.
   6. Colocar pinça através do tronco pulmonar e cortá-lo longitudinalmente (Figura 2E). Examine a via de saída pulmonar, a origem do tronco pulmonar e as válvulas semilunares.
   7. Corte o átrio esquerdo das veias pulmonares até a ponta da aurícula esquerda (Figura 2F). Inspecione a válvula bicúspide (mitral) a partir da vista dorsal.
   8. Colocar o coração com o septo interventricular voltado para baixo (Figura 2F). Faça uma grande incisão na parede livre ventricular da base do ventrículo até o ápice cardíaco. Exibir completamente a válvula atrioventricular esquerda.
   9. Corte as cordas tendíneas da cúspide da valva atrioventricular esquerda.
   10. Colocar a pinça através da via de saída do ventrículo esquerdo e utilizá-la como orientação para abrir a aorta (Figura 2G).
   11. Use solução salina para remover todos os coágulos sanguíneos. Uma vez removidos todos os coágulos sanguíneos, avalie-se e compare o peso cardíaco com a massa corporal ou tabelas de peso cardíaco padrão (Tabela 1)^11,13.
   12. Pese o coração.
   13. Se apenas o nó SA for o ponto de interesse, após o exame do ventrículo esquerdo, coloque todo o coração inteiramente em formalina tamponada neutra (NBF) a 10% por 24 h e corte o átrio direito para coletar amostras da crista terminal.
       NOTA: Por esta técnica, os ventrículos esquerdo e direito podem ser facilmente apreciados. A razão entre a espessura da parede ventricular esquerda e direita é de 3:1, com pequenas diferenças por espécie e raça; para o coração do feto animal, a proporção é de 1:1¹².

3. Protocolo de amostragem para histologia¹⁶

1. Com bisturi, fazer dois cortes longitudinais paralelos (aproximadamente 5 mm de distância) envolvendo o átrio direito, a valva tricúspide e a parede livre do ventrículo direito (Figura 2I)
2. Realizar dois cortes longitudinais paralelos (aproximadamente 5 mm de distância) envolvendo o átrio esquerdo, valva mitral, músculo papilar dorsal e ventrículo esquerdo (Figura 2H).
3. Dentro do terço superior dorsal do coração, seccionar transversalmente a base do coração seguindo uma linha, incluindo o septo interventricular, átrio direito, aorta, valva aórtica e valva tricúspide (Figura 2J).
4. Realizar dois cortes longitudinais paralelos envolvendo a base da aorta e o septo interventricular (Figura 2J).
5. Aparar o átrio direito ao redor da crista terminal e fornecer várias seções paralelas orientadas transversalmente no eixo longitudinal da crista (aproximadamente 3-4 mm de distância) para obter seis peças do nó SA (Figura 3, Figura 4I e Figura 5H).
6. Aparar os tecidos obtidos em histológicas.
   NOTA: Protocolo de bloqueio recomendado: etapa 3.1.-bloqueio histológico 1 (a Figura 6 mostra o slide resultante deste bloco.), passo 3.2.-bloco histológico 2 (a Figura 7 mostra o slide resultante deste bloco), passo 3.4.-bloco histológico 3 (a Figura 8 mostra o slide resultante deste bloco), passo 3.5.-bloco histológico 4 (a Figura 9 mostra o slide resultante deste bloco).
7. Mergulhe os tecidos em 10% de NBF por pelo menos 48 h.

4. Amostragem de artérias coronárias 3,10,14

1. Use fórceps e bisturi para dissecar as artérias coronárias do sulco paraconal cardíaco (Figura 4K). Fixe a artéria coronária durante a noite em 10% NBF.
2. Se necessário, descalcificar adequadamente em uma mistura 1:1 de ácido fórmico a 8% e ácido clorídrico.
3. Faça vários cortes transversais em intervalos de 3 mm. Coloque as seções em um e, em seguida, coloque o em 10% NBF até a incorporação.
   NOTA: Os porcos podem ser usados como um modelo cardíaco para os seres humanos, especialmente quando se trata de doença cardíaca coronária. Assim, amostras suplementares e cortes histológicos de artérias coronárias são recomendados 3,10,14.

5. A técnica de dissecção do coração "quatro câmaras"/"plano ecocardiográfico" ^1,17

NOTA: A técnica de dissecção de quatro câmaras consiste em um corte da base até o ápice do coração para obter a visão padrão¹. A técnica de "quatro câmaras" é melhor aplicada a tecidos fixos.

1. Coloque todo o coração em 10% NBF por pelo menos 48 h.
2. Após a fixação do coração em NBF a 10% por pelo menos 48 h (Figura 10A), coloque duas pinças de dissecção retas desdentadas, uma através do crânio-átrio direito-valva tricúspide-ventrículo direito e a segunda através da veia pulmonar-átrio esquerdo-valva mitral-ventrículo esquerdo (Figura 10B).
3. Use o espaço entre os braços da pinça como orientação para a lâmina de corte da base até o ápice do coração (Figura 10C). Fornecer uma secção longitudinal adicional com aproximadamente 5 mm, para além da secção descrita na etapa 5.2. no segmento cardíaco, que inclui a aorta.
4. Com uma incisão transversal, separe completamente a base cardíaca do ápice. Coloque cada segmento de tecido em um histológico.
   NOTA: Protocolo de bloqueio recomendado: o bloqueio histológico ápice-cardíaco 5 (a Figura 11A mostra a lâmina resultante deste bloqueio), o bloco histológico de base cardíaca 6 (a Figura 11B mostra a lâmina resultante deste bloqueio).
5. Coloque as em 10% NBF até incorporar. Fixar todas as amostras cardíacas em NBF a 10% (mais de 10 vezes o volume de tecido), processá-las rotineiramente em cera de parafina, corte a 4 μm de espessura e coloração com hematoxilina e eosina (coloração H&E) seguindo um protocolo descrito anteriormente¹⁰.
   NOTA: Se houver suspeita de miocardite, "um pedaço de tecido cardíaco fresco deve ser retido em condições estéreis com material cirúrgico estéril e recipiente de amostra estéril para estudos microbiológicos e virais"¹³.

6. Documentação fotográfica

NOTA: A documentação fotográfica é uma etapa opcional no exame de necropsia. No entanto, fotografias e gravações de vídeo são essenciais para se ter uma "documentação precisa da anatomia normal e anormal"³.

1. Para documentação fotográfica adequada, tire imagens digitais durante a realização de "dissecção progressiva de tecidos cardíacos"¹³. Consulte as orientações para documentação fotográfica e fotografia¹⁵ a vista geral-anterior e posterior; uma fatia do coração; e quaisquer lesões suspeitas.

Resultados

Este protocolo foi utilizado para visualizar características anatômicas e coletar amostras para exame histológico do coração em quatro espécies diferentes (cão, gato, porco e vaca). O protocolo de necropsia foi repetido em cada uma das espécies acima mencionadas, mas ilustrado apenas em cães. O protocolo de necropsia inicia-se com um extenso exame externo do corpo (Figura 1A) (incluindo a pele, linfonodos exploráveis e mucosa externa), medindo o peso total e pontuando o estado gera...

Discussão

Ao executar o protocolo atual, várias etapas críticas devem ser cuidadosamente consideradas para resultados consistentes. Em animais jovens, as medidas cardíacas são diferentes daquelas em adultos (incluindo a espessura da parede ventricular) e, geralmente, o coração representa maior proporção do peso corporal^11,12. O grau de hipertrofia ventricular pode ser quantificado pela aplicação de uma fórmula de peso geral, a razão entre o ventrículo esquerdo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.