심혈관 질환에 대한 대형 동물 모델에서 심장의 해부 기술 및 조직 학적 샘플링

요약

복잡한 해부학으로 인해 심장 샘플에 대한 일관되게 재현 가능한 해부 및 수확 프로토콜을 구현하기가 어려울 수 있습니다. 이 원고는 일부 표준 심장 해부 프로토콜의 핵심 요소를 제시하여 전체 검사 접근 방식과 조직 병리학 검사에 일반적으로 사용되는 샘플링 부위를 강조합니다.

초록

표준 총 검사 및 샘플링은 대형 동물에서 수행 된 심혈관 질환에 대한 실험적 연구의 재현성과 성공의 핵심 요소입니다. 심장의 복잡한 해부학, 종간 차이, 보상 및 병리학 적 반응의 유형을 고려할 때 일관된 프로토콜을 구현하기가 어렵습니다. 다중 해부 프로토콜의 활용은 일반적으로 프로 섹터의 경험에 맞게 조정되며 개인 선호도는 계속해서 실험 및 관찰자 간 변동성의 원천이됩니다. 여기에서 목표는 심혈관 질환의 모델로 일반적으로 사용되는 일부 종(개, 돼지, 반추동물 및 고양이 포함)에서 심장의 주요 해부학적 특징과 랜드마크, 해부 프로토콜 및 조직학적 샘플링 표준을 제시하는 것입니다.

여기에는 두 가지 표준 총 시험 프로토콜이 제시됩니다. 첫째, 심장과 큰 혈관을 통한 생리적 혈류 방향을 따르는 유입-유출 방법(개, 반추동물, 돼지에서 자주 사용됨), 둘째, 4챔버 해부 기술(고양이에서 예시됨)입니다. 두 기술 모두 특정 실험 상황에서 모든 종에 적용 할 수 있습니다. 샘플링 프로토콜에는 모든 관심 영역 (동방 결절, 심실, 심실 중격, 심방, 밸브 및 대동맥)이 포함되며 적절하게 수행되면 실험 연구의 재현성과 신뢰성을 모두 향상시킵니다.

서문

심장벽 두께 평가를 방해할 수 있는 복잡한 해부학과 초기 엄격함으로 인해 심장의 전체 검사는 까다롭고 여러 기술 관련 또는 해석 오류가 발생하기 쉽습니다. 이것은 종간 형태 학적 변이와 많은 임상 적 주요 심장 병리 (관상 동맥 심장 질환, 섬유증, 동맥염 및 아밀로이드증의 초기 사례 포함)가 본질적으로 조직 병리학 적 병리학 인 심한 변화와 관련이 없다는 사실에 의해 증폭됩니다. 표준화된 해부 및 조직학적 샘플 수집 프로토콜은 관찰자 간의 일관성을 가져오는 동시에 심혈관 질환에 대한 실험적 연구의 비교 가능성 및 재현성을 가져올 수 있습니다.

샘플은 두 마리의 개 (Canis lupus familiaris) (3 세, 수컷 프렌치 불독 및 8 세, 암컷 혼합 품종), 고양이 (Felis catus) (6 세, 수컷 유럽 쇼트 헤어), 국내 돼지 (Sus scrofa domesticus) (1 세, 수컷 큰 흰색) 및 소 (Bos taurus) (2 개월 된 암컷 홀스타인). 선택된 각 종은 다른 질병에 대한 심혈관 모델로 특히 사용됩니다. 예를 들어, 개는 부정맥 모델링에 선호되는 모델입니다. 고양이는 HCM의 유병률이 가장 높은 종이기 때문에 비대성 심근 병증 (HCM)에 선호됩니다. 돼지는 급성 심근 경색의 모델로 사용됩니다. 그리고 반추 동물은 초원¹¹에서 쉽게 발견 할 수있는 독소에 노출되어 중독의 모델로 사용됩니다.

이 원고에서는 실험적 심혈관 질환에서 심장의 총 및 조직 학적 검사를 개선하기 위해 고안된 심장의 하나의 부검 프로토콜과 두 개의 해부 프로토콜이 제시됩니다. 설명 된 프로토콜은 수의학 교과서 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 저널 문헌 3,13,14^, 공식 문서 15 및 웨비나 ¹⁶의 정보를 기반으로 개발되었습니다. ^,17. 이 연구에 사용 된 샘플은 일상적인 부검 진단을 위해 USAMV Cluj-Napoca의 병리학 부서에 제출 된 시체에서 수확되었습니다.

프로토콜

실험 프로토콜은 생명 윤리 협약 (2022 년부터 311 호)을 받았으며 국가 (2014 년 법률 제 43 호) 및 유럽 (2010 년 EU 지침 제 63 호) 법률을 준수하여 농업 과학 및 수의학 대학 클루 지나포카 (Cluj-Napoca) 대학의 생명 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료 및 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 부검 프로토콜

참고: ^{2,12를 수행할 때} 더 쉽게 접근할 수 있으므로 제시된 모든 종에 대해 동일한 부검 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 다음 단계는 중형견에서 수행된 부검을 나타냅니다. 다른 주제에 대해 부검을 수행 할 때 단계를 조정하십시오.

1. 피사체의 무게를 측정하고 왼쪽의 괴사 테이블에 놓습니다(그림 1A). 피험자의 외부 검사를 진행하십시오 (큐티스와 점막을 검사하고 촉진하여 색상, 일관성 및 부피의 모든 변화를 기록함으로써).
2. 칼 (또는 메스)을 사용하여 오른쪽 겨드랑이에 7cm의 절개를하십시오 (그림 1A).
3. 대퇴 접합부를 찾습니다(그림 1A,B). 칼로 캡슐을여십시오. 대퇴골 머리의 인대를 자릅니다 (그림 1B).
4. 칼을 사용하여 겨드랑이 두개골의 피부 절개를 하악 결합체로, 꼬리를 회음부까지 확장합니다(그림 1B).
5. 메스로 피부를 제거하고 흉부와 복벽을 복부 정중선에서 척추 횡단 과정의 수준까지 노출시킵니다 (그림 1B).
6. 메스와 집게로 복벽을 통해 플랩을 만들고 오른쪽 늑골 아치에 복실을 만듭니다. 가위로 복강을 열고 오른쪽 hypochondrium의 꼬리면을 따르십시오 (그림 1B).
7. 외부 장골 볏까지 오른쪽 paralumbar 영역을 따라 절개 꼬리를 확장합니다. 그 후, 선형 알바의 음모 삽입까지 절개를 연장하십시오.
8. 간단히 말해서, 복부 장기를 현장에서 검사하십시오 (장기의 색, 일관성, 부피 및 위치의 변화에 주목하여).
9. 메스와 집게로 가장 높은 지점에서 다이어프램을 뚫습니다 (그림 1B).
10. 뼈 절단 집게를 사용하여 두 개의 세로 섹션이있는 오른쪽 흉곽을 제거하여 흉강에 들어갑니다. 갈비뼈의 흉골 연골 부분을 절편화합니다. 다음으로, 늑골 관절에 근위에있는 갈비뼈의 등쪽 부분을 절편화합니다 (그림 1C).
11. 제자리에서 심장을 검사하십시오 (그림 1C). 크기, 위치, 색상, 인접한 조직과의 연결 및 촉진에 의해 일관성의 변화를 확인하십시오⁹.
    알림: 혈전증이나 선천성 심장 질환이있는 경우 심장을 현장에서 해부해야합니다 (이 방법을 사용하면 큰 혈관을 완전히 검사 할 수 있습니다).
12. 가위를 사용하여 심장의 기저부에서 정점까지 세로 부분으로 심낭을 검사하고 엽니 다. 심낭과 심 외막을 검사하십시오 (색, 일관성 및 부피의 변화에 유의하십시오)¹².
13. 가위로 심장을 풀어 대동맥, 폐동맥 및 대정맥의 횡단면을 생성합니다. 섹션 상부 대정맥 크리스타 터미널을 보존하기 위해 우심방 입구에서 최소 1cm 위에 ^11,13.
14. 장기의 외부 윤곽, 심 외막의 모양, 심 외막의 투명성에 의한 심근의 모양 및 큰 혈관의 외관을 검사합니다 (그림 2A).
    참고 : 일반적으로 심낭의 개방과 검사는 종간에 약간의 차이가 있습니다. 심낭 강의 검사는 전체 심낭 내용물 ^1,2의 심낭의 투명성을 통한 외부 검사 및 평가로 시작됩니다. 고양이 또는 개에서 심낭은 일반적으로 약 0.25mL/kg의 얇고 투명하며 반투명에서 담황색 액체⁹를 포함합니다. 병리학 적 삼출액이있는 경우 멸균 주사기 또는 vacutainer 튜브로 수집해야합니다.

2. 해부 프로토콜

알림: 심장에는 몇 가지 부검 기술이 사용되며 각각 몇 가지 장점이 있습니다. 이 프로토콜의 경우 가장 많이 사용되는 두 가지 기술이 선택되었습니다 : 1) 판막과 심내막을보다 잘 검사 할 수 있고 대부분의 종 2,11,12,16에 사용되는 프로토콜 인 "유입 유출 방법"및²) 고양이 또는 소형견에게 일반적으로 사용되는 "4 개의 챔버 해부"/ "심 초음파 평면"기술^{1, 17}.

1. 심장 해부를위한 "유입 유출 방법" 2,11,12,16
   1. 심방 면이 위를 향하도록 심장을 놓습니다(그림 2A).
   2. 가위와 이빨없는 집게를 사용하여 꼬리 대정맥에서 우심방으로 넓게 자릅니다 (그림 2B). 오른쪽 귀 부속기로 절단을 계속하여 크리스타 말단 / 동방 결절 (SA 노드)을 노출시킵니다. 등쪽에서 삼첨판 막을 검사하십시오.
   3. 우심방에서 우심실과 심실 중격 사이의 교차점까지 섹션을 자릅니다 (그림 2C). 오른쪽 방실 판막을 표시합니다.
   4. 심실 중격을 따라 우심실 자유 벽을 섹션화합니다. 폐동맥의 기원까지 섹션을 계속하십시오 (그림 2C, D).
   5. 척색건을 포함한 오른쪽 방실 판막과 유두근을 철저히 검사하십시오(그림 2D). 척색 건을 자르십시오.
   6. 폐동맥을 통해 집게를 놓고 몸통을 세로로 자릅니다 (그림 2E). 폐 유출관, 폐동맥 기원 및 반월 판막을 검사하십시오.
   7. 폐정맥에서 좌심방을 왼쪽 귀의 끝까지 자릅니다 (그림 2F). 등쪽에서 이첨판 (승모판)을 검사하십시오.
   8. 심실 중격이 아래를 향하도록 심장을 놓습니다(그림 2F). 심실 기저부에서 심장 정점까지 심실 자유 벽에 큰 절개를하십시오. 왼쪽 방실 판막을 완전히 표시하십시오.
   9. 왼쪽 방실 판막의 교두의 척막 건 을 자릅니다.
   10. 좌심실 유출로를 통해 집게를 놓고 대동맥을 여는 지침으로 사용하십시오 (그림 2G).
   11. 식염수를 사용하여 모든 혈전을 제거하십시오. 모든 혈전이 제거되면 심박수를 평가하고 체질량 또는 표준 심박수 표와 비교합니다(표 1)^11,13.
   12. 마음의 무게를 잰다.
   13. SA 노드 만 관심 지점 인 경우 좌심실 검사 후 심장 전체를 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)에 24 시간 동안 놓고 우심방을 다듬어 크리스타 터미널을 샘플링합니다.
       참고: 이 기술을 사용하면 좌심실과 우심실을 쉽게 감상할 수 있습니다. 왼쪽과 오른쪽 심실 벽 두께의 비율은 3 : 1이며 종과 품종에 따라 약간의 차이가 있습니다. 동물 태아 심장의 경우 비율은 1:1¹²입니다.

3. 조직학을 위한 샘플링 프로토콜¹⁶

1. 메스를 사용하여 우심방, 삼첨판 막 및 우심실 자유 벽을 포함하는 두 개의 세로 평행 절단 (약 5mm 간격)을 만듭니다 (그림 2I).
2. 좌심방, 승모판막, 등쪽 유두근 및 좌심실을 포함하는 두 개의 세로 평행 절단(약 5mm 간격)을 만듭니다(그림 2H).
3. 심장의 등쪽 상부 1/3 내에서 심실 중격, 우심방, 대동맥, 대동맥 판막 및 삼첨판 막을 포함하여 선을 따라 심장의 기저부를 횡 방향으로 절단합니다 (그림 2J).
4. 대동맥의 기저부와 심실 중격을 포함하는 두 개의 세로 평행 절단을하십시오 (그림 2J).
5. 크리스타 터미널 주변의 우심방을 다듬고 크리스타의 세로 축 (약 3-4mm 간격)에서 가로 방향으로 향하는 여러 평행 섹션을 제공하여 SA 노드의 6 개 조각을 얻습니다 (그림 3, 그림 4I 및 그림 5H).
6. 조직 학적 카세트에서 얻은 조직을 다듬습니다.
   참고: 권장 차단 프로토콜: 단계 3.1.-조직학적 블록 1(그림 6은 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다.), 단계 3.2.-조직학적 블록 2(그림 7은 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다), 단계 3.4.-조직학적 블록 3(그림 8은 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다), 단계 3.5.-조직학적 블록 4(그림 9는 이 블록의 결과 슬라이드를 보여줍니다).
7. 조직을 10 % NBF에 적어도 48 시간 동안 담그십시오.

4. 관상 동맥 샘플링 3,10,14

1. 집게와 메스를 사용하여 심장 원추 홈에서 관상 동맥을 해부합니다 (그림 4K). 관상 동맥을 10 % NBF로 밤새 고정하십시오.
2. 필요한 경우 8% 포름산과 염산의 1:1 혼합물로 적절하게 석회질을 제거합니다.
3. 3mm 간격으로 여러 번 가로 절단하십시오. 섹션을 카세트에 넣은 다음 카세트가 포함될 때까지 10% NBF에 넣습니다.
   참고 : 돼지는 특히 관상 동맥 심장 질환의 경우 인간의 심장 모델로 사용할 수 있습니다. 따라서 관상 동맥의 보충 샘플 및 조직 학적 섹션이 권장됩니다 3,10,14.

5. 심장의 "4 개의 방"/ "심 초음파 평면"해부 기술 ^1,17

참고 : 4 개의 챔버 해부 기술은 표준보기¹을 얻기 위해 심장의 기저부에서 정점까지 절단하는 것으로 구성됩니다. "4 챔버"기술은 고정 된 조직에 가장 잘 적용됩니다.

1. 심장 전체를 최소 10시간 동안 48% NBF에 넣습니다.
2. 심장을 최소 48 시간 동안 10 % NBF에 고정 한 후 (그림 10A), 두 개의 이가없는 직선 해부 집게를 두개골 카바-우심방-삼첨판 막-우심실을 통과하고 두 번째는 폐정맥-좌심방-승모판-좌심실을 통해 놓습니다 (그림 10B).
3. 집게 암 사이의 공간을 심장의 바닥에서 정점까지 절단 날의 지침으로 사용하십시오 (그림 10C). 5.2단계에서 설명한 섹션에서 약 5mm 떨어진 추가 세로 섹션을 제공합니다. 대동맥을 포함하는 심장 부분에.
4. 횡단 절개로 심장 기저부를 정점에서 완전히 분리하십시오. 각 조직 세그먼트를 조직 학적 카세트에 넣습니다.
   참고: 권장 차단 프로토콜: 심장 정점-조직학적 블록 5 (도 11A는 이 블록으로부터의 결과 슬라이드를 도시함), 심장 기저-조직학적 블록 6 (도 11B는 이 블록으로부터의 결과적인 슬라이드를 도시함).
5. 카세트를 임베딩될 때까지 10% NBF에 넣습니다. 모든 심장 샘플을 10 % NBF (조직 부피의 10 배 이상)로 고정하고, 파라핀 왁스로 일상적으로 처리하고, 4 μm 두께로 절단하고, 이전에 설명한 프로토콜¹⁰에 따라 헤마톡실린 및 에오신 염색 (H & E 염색)으로 염색합니다.
   참고: 심근염이 의심되는 경우 "미생물 및 바이러스 연구를 위해 멸균 수술 재료와 멸균 샘플 용기와 함께 멸균 조건에서 신선한 심장 조직 조각을 보관해야 합니다"¹³.

6. 사진 문서

참고: 사진 문서화는 부검 검사의 선택적 단계입니다. 그러나 사진 및 비디오 녹화는 "정상 및 비정상 해부학에 대한 정확한 문서화"3를 유지하는 데 ^{필수적입니다.}

1. 적절한 사진 문서화를 위해 "심장 조직의 점진적 해부"¹³를 수행하는 동안 디지털 이미지를 촬영하십시오. 사진 문서화 및 사진¹⁵ 일반 보기-전방 및 후방에 대한 지침을 참조하십시오. 심장의 한 조각; 및 의심되는 병변.

결과

이 프로토콜은 해부학 적 특징을 시각화하고 4 가지 종 (개, 고양이, 돼지 및 소)에서 심장의 조직 학적 검사를위한 샘플을 수집하는 데 사용되었습니다. 부검 프로토콜은 위에서 언급 한 각 종에서 반복되었지만 개에서만 설명되었습니다. 부검 프로토콜은 신체(그림 1A)(피부, 탐색 가능한 림프절 및 외부 점막 포함)에 대한 광범위한 외부 검사, 전체 체중 측정 및 동물의 일반...

토론

현재 프로토콜을 수행할 때 일관된 결과를 위해 몇 가지 중요한 단계를 신중하게 고려해야 합니다. 어린 동물에서 심장 측정은 성인의 심장 측정 (심실 벽 두께 포함)과 다르며 일반적으로 심장은 체중^11,12의 더 큰 비율을 나타냅니다. 심실 비대의 정도는 일반적인 체중 공식, 좌심실과 중격 사이의 비율을 자유 우심실 무게로 나눈 값, 정상적인 조건에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.