使用台式流变仪快速表征气道粘液的粘弹性

摘要

粘液的粘弹性在粘膜纤毛清除中起关键作用。然而，传统的粘液流变技术需要复杂且耗时的方法。本研究为台式流变仪的使用提供了详细的方案，该流变仪可以快速可靠地进行粘弹性测量。

摘要

在粘膜阻塞性肺疾病（例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化）和其他呼吸系统疾病（例如病毒/细菌感染）中，高脚杯细胞分泌过多、气道脱水、氧化应激和细胞外 DNA 的存在改变了粘液的生物物理性质。先前的研究表明，痰粘弹性与肺功能相关，影响痰流变学的治疗（例如，粘液溶解剂）可以产生显着的临床益处。通常，非牛顿流体的流变测量采用复杂、耗时的方法（例如，平行/锥板流变仪和/或微珠颗粒跟踪），需要大量的培训来执行测定和解释数据。该研究测试了Rheomuco的可靠性，再现性和灵敏度，Rheomuco是一种用户友好的台式设备，旨在使用剪切应变扫描的动态振荡进行快速测量，以在5分钟内为临床样品提供线性粘弹性模量（G'，G"，G^*和棕褐色δ）和凝胶点特性（γ_c和σ_c）。使用不同浓度的粘液模拟剂、8 MDa 聚环氧乙烷 （PEO） 和传统的本体流变测量来验证设备性能。然后以一式三份测量结果评估从插管哮喘持续状态（SA）患者身上采集的临床分离株，测量值之间的变异系数为<10%。在 SA 粘液上使用强效粘液还原剂 TCEP 的 离体 状态导致弹性模量降低 5 倍，并且总体上向更"液体样"的行为（例如，较高的棕褐色δ）转变。总之，这些结果表明，经过测试的台式流变仪可以在临床和研究环境中可靠地测量粘液粘弹性。总之，所描述的方案可用于在现场探索粘液活性药物（例如，rhDNase，N-乙酰半胱氨酸）的影响，以根据具体情况调整治疗，或在新化合物的临床前研究中。

引言

粘膜阻塞性气道疾病，包括哮喘、慢性阻塞性肺病 （COPD）、囊性纤维化 （CF） 和其他呼吸系统疾病，如病毒性和细菌性肺炎，是全世界普遍存在的健康问题。虽然每种疾病的病理生理学差异很大，但一个共同的关键特征是粘膜纤毛清除率异常。在健康的肺部，粘液排列在气道上皮上，以捕获吸入的颗粒并提供针对病原体的物理屏障。一旦分泌，由~97.5%的水，0.9%的盐，~1.1%的球状蛋白和~0.5%的粘蛋白组成的气道粘液通过纤毛^1，2的协调跳动逐渐向声门运输。粘蛋白是大的O-连接的糖蛋白， 它们通过 非共价和共价键相互作用，以提供粘液的独特粘弹性，这是有效运输所必需的³。由离子转运改变、粘蛋白展开、静电相互作用、交联或组成变化引起的粘蛋白网络超微结构变化可显著影响粘液粘弹性并损害粘膜纤毛清除率^4，5。因此，鉴定气道粘液的生物物理性质的变化对于了解疾病发病机制和测试新型粘液活性化合物⁶至关重要。

各种因素可导致肺部异常粘液的产生。在COPD中，由于杯状细胞化生，慢性吸入香烟烟雾会引发粘液分泌过多，以及 通过 囊性纤维化跨膜传导调节剂（CFTR）通道的下调而引发气道脱水，导致粘液过度浓缩和小气道阻塞^7，8。同样，CF是一种与CFTR基因突变相关的遗传性疾病，其特征在于产生粘稠的粘附粘液，不足以运输^8，9。简而言之，CFTR功能障碍诱导气道表面液体耗竭，聚合物粘蛋白缠结和生化相互作用增加，从而导致慢性炎症和细菌感染。此外，被困在静态粘液中的炎性细胞通过向凝胶基质中加入另一个大分子DNA，进一步加剧了粘液的粘弹性，使气道阻塞^恶化5.粘液流变学对肺部整体健康的重要性的最好例子之一是重组人DNFase（rhDNase）在囊性纤维化患者治疗中的例子。首先证明了rhDNase对糜痰的 离体 作用，其显示在几分钟内从粘稠的粘液过渡到流动的液体^10，11。在CF患者中的临床试验表明，rhDNase吸入降低气道粘液粘弹性可降低肺部恶化的发生率，并改善肺功能和整体患者健康状况^12，13，14。因此，旨在促进清除的rhDNase吸入成为CF患者二十多年来的护理标准。使用吸入高渗盐水治疗CF粘液水合观察到类似的临床益处，这与流变学性质的变化相关，并导致粘膜纤毛清除加速和肺功能改善^15，16。因此，在临床环境中测量粘液粘弹性的快速可靠的方案对于优化治疗方法非常重要。

本文测试的台式流变仪为对粘液/痰液样品进行全面的粘弹性测量提供了一种快速方便的替代方案。该仪器使用具有受控角位移的动态振荡， 通过 一对可调节的平行板（例如，粗糙或光滑的几何形状）提供变形，以测量扭矩和位移，分辨率为15 nN^。m 和 150 nm，分别^{为 17}。默认的标准化校准与适用于非流变学专家的用户指南相结合，可实现直接测量并降低操作员出错的风险。该器件产生一条应变扫描曲线，该曲线经过实时处理和分析（约5分钟内），并自动提供线性粘弹性（G'，G"，G^*和棕δ）和凝胶点（γ_c 和σ_c）特性（见 表1）。弹性或储能模量（G'）描述了样品如何响应应力（即恢复到其原始形状的能力），而粘性或损耗模量（G"）描述了正弦变形的每个周期消散的能量（即，由于分子摩擦而损失的能量）。复数或动态模量（G*）是应力与应变的比值，它描述了响应剪切位移的内力积聚量（即整体粘弹性）。阻尼因子（棕褐色δ）是粘性模量与弹性模量的比值，表示样品耗散能量的能力（即，低棕褐色δ表示弹性主导/固体样行为，而高棕褐色δ表示粘性主导/液体样行为）。对于凝胶点特叉应变（γ_c）是剪切应变的量度，通过偏转路径与剪切间隙高度的比值计算，此时样品从固体状行为转变为类似液体的行为，并且根据定义，在G' = G"或tan δ = 1的振荡应变下发生。交越屈服应力（σ_c）是弹性模量和粘性模量交叉的器件所施加的应力量的量度。在健康的痰液中，弹性主导着对应变的机械反应（G'>G"）。在粘膜阻塞性疾病中，G'和G"由于病理性粘液变化而增加^17，18，19。该设备的操作简单性便于现场测量，并避免了样品储存/运输/运送到异地设施进行分析的需要，从而避免了时间和冻融对这些生物样品特性的影响。

在这项研究中，使用8种不同浓度（1%-3%）的MDa聚环氧乙烷（PEO）溶液来验证商用台式流变仪（材料表）的测量范围，并将获得的浓度依赖曲线直接与使用传统体积流变仪获得的测量值进行比较（材料表).然后使用支气管镜下从患有哮喘持续状态（SA）的插管患者中采集的粘液来评估流变学测量的可重复性，这是一种极端形式的哮喘急性发作，其特征在于支气管痉挛，嗜酸性粒细胞炎症和粘液对环境或感染因子的过度产生^8，20.在这种情况下，SA患者因严重呼吸衰竭而插管，并且需要ECMO（体外膜肺氧合），因为尽管采用积极的标准哮喘治疗，但无法仅通过机械通气有效安全地支持患者。在临床指征的支气管镜检查肺叶塌陷期间，注意到厚实、透明、顽强的分泌物会阻塞支气管，并使用盐水冲洗液抽吸。收集后，立即从抽吸物中除去多余的盐水，并使用台式装置分析剩余SA样品的粘弹性。用还原剂三（2-羧乙基）盐酸膦（TCEP）处理其他样品等分试样，以确定该方案是否可用于表征 治疗化合物的离体疗效。

结果表明，该协议和台式设备可以在临床环境中有效使用。从PEO浓度依赖性曲线（图1A）确定的流变学特性在测试的台式设备和传统的平行板流变仪之间无法区分（图1B）。SA粘液的一式三份测量是可重复的，G*，G'和G"终点的变异系数为10%，并反映了在该患者病例中临床上明显的粘液粘弹性的实质性异常（图1D）。最后，用TCEP进行 体外 治疗导致G'和G"显着降低，棕褐色δ增加，通过改变粘蛋白网络来证明对治疗的反应（图2）。总之，使用台式流变仪的该方案提供了一种简单有效的方法来评估从诊所获得的粘液样品的粘弹性。这种能力可用于促进精准医疗护理方法，因为临床医生可以在现场测试批准的粘膜活性药物的疗效，这有助于确定替代治疗方案。此外，这种方法可用于临床试验，以检查研究药物的效果。

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研究方案

在本研究中，根据UNC机构审查委员会批准的方案获得知情同意后，在临床指征支气管镜检查期间收集样本。

1. 痰液/粘液的收集和储存

1. 通过吸痰或支气管镜抽吸收集气道粘液。
   1. 通过自发祛痰收集痰液，或通过吸入 3% 高渗盐水诱导痰液。或者，在支气管镜检查过程中直接从气道抽吸粘液。
   2. 将收集的气道痰/粘液储存在无菌标本杯中。在痰的情况下，在收集后立即从样品中除去多余的唾液。
   3. 将样品放在冰上运输。将运输时间限制在4小时以内。
2. 在收集时分析样品或储存在-80°C直至处理。
   1. 在储存之前，用正置换移液管或移液管轻轻上下移液三到五次，将粘液均匀化。
   2. 等分样品以≥500μL的体积储存，以确保足够的体积用于实验。
      注意:冷冻和解冻可能会影响样品的粘弹性。仅比较经历过类似冻融循环的样品。

2. 样品制备

1. 直接移液新鲜和冷冻的痰液/粘液，或使用容积式移液器在等分试样前轻轻上下移液三到五次，使标本均质化。
   注意:对于含有可能影响再现性的厚塞子的样品，均质化非常重要。
2. 将400-500μL样品等分到单独的微量离心管中。根据需要准备尽可能多的等分试样，以进行重复测量和/或用药理学试剂（例如，rhDNase，N-乙酰半胱氨酸）进行治疗。在测量前，将要在37°C下孵育要测试的等分试样至少5分钟。
3. 对于药理学药物（可选）的测试，请使用高浓度的储备溶液以防止样品稀释。
   1. 将所需试剂（例如TCEP）的0.4%至10%体积（以尽量减少样品稀释）直接添加到样品上。确保没有化合物滴在管的侧面。
   2. 将样品在37°C下孵育所需的时间长度，以允许化学反应（<1小时以防止粘液的蛋白水解降解）。
   3. 通过每2分钟轻拂微量离心管的底部来混合粘液样品和试剂，以使试剂逐渐渗透到粘液样品中，而不会影响粘蛋白网络（例如，模仿纤毛跳动和粘膜纤毛清除）。比较多种药物试剂时，请确保孵育时间相似。

3. 仪器初始化和校准

1. 打开机器（材料表）并初始化软件。
2. 选择 "新建度量"。在 "度量 ID" 下输入示例标识号，在"运算符"下输入 操作员 的名称以继续。在 "注释"下输入其他信息或注释。
3. 选择一个几何集（即粗糙或光滑的25 mm平行板），并仔细检查大板和小板，以确保板材干净且处于完美状态）。
   注意:原板设计用于大体积（350-500 μL），光滑板设计用于较小体积（250-350 μL）。使用低于或高于推荐值的样品量可能会导致测量不准确。
4. 将大板牢牢地插入底部讲坛上。
5. 将小板轻轻插入上讲坛上，然后稍微旋转以锁定板，直到听到"咔哒"声，这表明板已正确夹紧。请注意，上板的自由振荡是正常的。
6. 等到温度达到37°C目标值。然后，根据软件的提示启动自动校准。
   注:在此过程中，请勿干扰机器或台面。

4. 样品装载

1. 使用正置换式移液器，在大底板中心的250至500μL样品之间缓慢移液。一旦沉积在板上，粘性样品将采用圆顶形状，而高弹性样品可能需要物理切断（使用解剖剪刀）。
   注意:避免引入气泡。如果需要，用移液器吸头推开残留的气泡。
2. 通过软件降低承载小板的测量头并观察样品。如果正确加载到底板上，样品将接触并在两个板之间居中。
3. 为确保样品填充间隙（即，通过扩散到板的边缘），请使用 "减少间隙 "功能，直到样品不再呈双凹形或与板的边缘对齐。" 减小间隙" 功能以 0.1 mm 的增量降低测量头，并限制为 7 个增量。
   注意:仔细监测样品并逐步调整间隙以避免溢出。
   1. 如果在七个增量后仍有间隙，请单击" 重做安装 "以返回到初始位置并调整样品的位置和/或体积。
   2. 如果间隙极度减小（例如，双凸形），则通过沿上板边缘的圆周运动用刮刀除去多余的样品。确保轻轻修剪多余的样品，以避免剪切应力。
      注意:在此步骤结束时，样品的边缘应与上板的边缘对齐，如用户指南中所示。
4. 降低保护盖，以避免在振荡过程中意外投射受污染的流体。

5. 启动生物物理测量

1. 要启动测量，请单击" 开始分析"。一个完整的周期需要4-7分钟。
   1. 在整个周期内，避免大声说话并触摸设备或工作台。在最初的2分钟内，安静的环境尤为重要。
      注意:在循环过程中，仪器执行标准化的应变扫描测试，该测试由连续的振荡步骤组成。每个步骤都是在恒定幅度和频率（1 Hz）下进行一系列10次振荡，在此期间实时测量相应的扭矩。应变和扭矩信号允许计算复数 （G*）、弹性 （G'） 和粘性 （G"） 模量，以及每一步的阻尼比（tan δ）。振荡幅度逐渐增加，这加剧了施加在样品上的变形。

6. 样品去除

1. 循环完成后，单击" 下一步 "抬起测量头并生成样品分析报告。
   注意:对于报告，软件计算记录的数据并自动绘制两条曲线，显示粘性和弹性模量相对于施加到样品上的变形的演变，并显示线性粘弹性状态（即低变形时的平台）（如果存在）。如果未检测到线性状态，则在0.05菌株下提取G'，G"，G *和棕褐色δ的值。此外，在tan δ = 1下计算交叉应变和屈服应力（γ_c 和σ_c）。每个步骤的数据也以电子表格形式提供，以便进一步分析。
2. 一旦测量头完全缩回，抬起保护盖，丢弃样品并小心地取下板。使用温水和肥皂对盘子进行清洁和消毒。
   注意:在重复使用之前，请彻底干燥设置的几何形状。

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结果

图1 显示了使用粘弹性控制的浓度依赖性曲线（即聚环氧乙烷（PEO）溶液和哮喘状态（SA）粘液）进行流变测量的准确性和可重复性。在评估的台式流变仪和传统散装流变仪之间，直接比较了8种不同浓度（1%，1.5%，2.5%和3%）下8 MDa PEO的粘弹性特性的测量（材料表）。与SA粘液相比，PEO溶液在整个应变范围内以粘性为主（G"> G'），并且没有表现出交叉，因此呈现出?...

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讨论

粘液独特的粘弹性特性对于维持健康的气道至关重要。内部和外部因素可改变气道粘液的生物物理性质，引起粘膜阻塞性疾病的临床并发症。因此，在评估疾病状态和探索降低粘液粘弹性的疗法时，可以考虑监测粘液粘弹性的变化。20 世纪 80 年代的实证研究表明，使用磁珠流变仪^23，24 的粘液流变学与气道清除率之间存在很强的相关性。近年来，流变?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.