ベンチトップレオメーターを使用した気道粘液の迅速な粘弾性特性評価

要約

粘液の粘弾性特性は、粘液繊毛クリアランスにおいて重要な役割を果たしている。しかし、従来の粘液レオロジー技術は、複雑で時間のかかるアプローチを必要とする。この研究は、粘弾性測定を迅速かつ確実に行うことができるベンチトップレオメータを使用するための詳細なプロトコルを提供する。

要約

粘膜閉塞性肺疾患(例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症)および他の呼吸状態(例えば、ウイルス性/細菌感染)において、粘液の生物物理学的特性は、杯細胞過剰分泌、気道脱水、酸化ストレス、および細胞外DNAの存在によって変化する。以前の研究では、喀痰の粘弾性が肺機能と相関し、喀痰レオロジー(例えば、粘液溶解剤)に影響を及ぼす治療が顕著な臨床的利益をもたらし得ることが示されていた。一般に、非ニュートン流体のレオロジー測定は、アッセイを実行し、データを解釈するために広範なトレーニングを必要とする、精巧で時間のかかるアプローチ(例えば、平行/コーンプレートレオメータおよび/またはマイクロビーズ粒子追跡)を使用する。この研究では、臨床サンプルの線形粘弾性率(G'、G"、G^*、および黄褐色δ)およびゲルポイント特性(γ_cおよびσ_c)を提供するために、せん断ひずみスイープによる動的振動を使用して迅速な測定を実行するように設計されたユーザーフレンドリーなベンチトップデバイスであるRheomucoの信頼性、再現性、および感度を試験しました5分以内に。デバイスの性能は、異なる濃度の粘液模擬物質である8MDaポリエチレンオキシド(PEO)を使用し、従来のバルクレオロジー測定に対して検証しました。その後、喘息状態(SA)の挿管患者から採取した臨床単離物を3連測定で評価し、測定間の変動係数は<10%である。SA粘液に対する強力な粘液減少剤TCEPの エクスビボ 使用は、弾性率の5倍の減少および全体的なより「液体様」の挙動(例えば、より高い黄褐色δ)への変化をもたらした。これらの結果は、試験済みのベンチトップレオメーターが、臨床および研究の場面で粘液粘弾性の信頼性の高い測定を行うことができることを示しています。要約すると、記載されたプロトコールは、粘液活性薬物(例えば、rhDNase、N-アセチルシステイン)の効果をオンサイトで探索し、ケースバイケースで治療を適応させるため、または新規化合物の前臨床試験において使用することができる。

概要

喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、嚢胞性線維症(CF)、およびウイルス性肺炎および細菌性肺炎などの他の呼吸器状態を含む粘膜閉塞性気道疾患は、世界中で蔓延している健康上の懸念である。病態生理は各病態によって大きく異なるが、共通の重要な特徴は異常な粘液繊毛クリアランスである。健康な肺では、粘液が気道上皮に並び、吸入粒子を捕捉し、病原体に対する物理的障壁を提供する。一旦分泌されると、〜97.5%の水、0.9%の塩、〜1.1%の球状タンパク質、および〜0.5%のムチンからなる気道粘液は、繊毛^1,2の協調的な拍動によって声門に向かって徐々に輸送される。ムチンは、粘液の明確な粘弾性特性を提供するために、非共有結合および共有結合を介して相互作用する大きなO結合型糖タンパク質であり、これは効率的な輸送に必要とされる³。イオン輸送の変化、ムチンの展開、静電相互作用、架橋、または組成の変化によって引き起こされるムチンネットワークの超構造の変化は、粘液粘弾性に有意に影響を及ぼし、粘液繊毛クリアランスを損なう可能性がある^4、5。したがって、気道粘液の生物物理学的特性の変化を特定することは、疾患の病因を理解し、新規粘液活性化合物を試験するために不可欠です⁶。

様々な要因が肺に異常な粘液の産生をもたらし得る。COPDでは、タバコの煙の慢性吸入は、杯細胞の化生の結果として粘液過分泌を引き起こし、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)チャネルのダウンレギュレーションを介した気道脱水を引き起こし、粘液過集中および小さな気道閉塞を引き起こす^7,8。同様に、CFTR遺伝子の変異に関連する遺伝性疾患であるCFは、輸送には不十分である粘性のある付着性粘液の産生によって特徴付けられる^8、9。簡単に言えば、CFTR機能障害は、気道表面の液体枯渇、ポリマームチン絡み合い、および生化学的相互作用の増加を誘発し、慢性炎症および細菌感染をもたらす。さらに、静置粘液に閉じ込められた炎症細胞は、別の大きな分子であるDNAをゲルマトリックスに添加することによって粘液の粘弾性をさらに悪化させ、気道閉塞^{を悪化させる5}。肺の全体的な健康に対する粘液レオロジーの重要性の最良の例の1つは、嚢胞性線維症患者の治療における組換えヒトDNFase(rhDNase)の例によって提供される。rhDNaseの効果は、去痰性痰に対するエクスビボで最初に実証され、粘性粘液から流動液体への移行を数分以内に示した^10、11。CF患者を対象とした臨床試験では、rhDNase吸入による気道粘液粘弾性の低下が肺悪化の速度を低下させ、肺機能および患者全体の幸福を改善することが実証された^12,13,14。その結果、クリアランスを容易にすることを目的としたrhDNase吸入は、20年以上にわたってCF患者の標準的なケアとなった。同様の臨床的利益は、CFにおける粘液水和のための吸入高張生理食塩水の使用によって観察され、これはレオロジー特性の変化と相関し、粘膜繊毛クリアランス加速および肺機能の改善をもたらした^15,16。したがって、臨床現場で粘液粘弾性特性を測定するための迅速かつ信頼性の高いプロトコルは、治療アプローチを最適化するために重要です。

ここで試験されたベンチトップレオメーターは、粘液/喀痰サンプルの包括的な粘弾性測定を実行するための迅速かつ便利な代替手段を提供します。制御された角度変位を備えた動的振動を使用して、この装置は調整可能な平行プレート(例えば、粗いまたは滑らかな形状)のペアを介して変形を提供し、15nNの分解能でトルクと変位を測定します^。mおよび150nmは、それぞれ¹⁷である。デフォルトの標準化された校正と、レオロジー以外の専門家向けに調整されたユーザーガイドラインを組み合わせることで、簡単な測定が可能になり、オペレータのエラーのリスクが軽減されます。このデバイスは、リアルタイム(約5分以内)で処理および分析される歪みスイープ曲線を生成し、線形粘弾性(G '、G"、G^*、および黄褐色δ)とゲル化点(γ c_、およびσ_c)特性の両方を自動的に提供します(表1を参照)。弾性率または貯蔵弾性率(G ́)は、サンプルが応力にどのように応答するか(すなわち、元の形状に戻る能力)を表し、粘性弾性率または損失弾性率(G")は、正弦波変形のサイクルごとに散逸するエネルギー(すなわち、分子の摩擦によって失われるエネルギー)を記述する。複素弾性率または動的弾性率(G*)は、ひずみに対する応力の比であり、せん断変位に応答して蓄積する内部力の量(すなわち、全体的な粘弾性特性)を記述する。減衰係数(黄褐色δ)は、粘性弾性率と弾性率の比であり、サンプルがエネルギーを放散する能力を示す(すなわち、低い黄褐色δは弾性優勢/固体様挙動を示し、高い黄褐色δは粘性優勢/液体様挙動を示す)。ゲル化点特性の場合、クロスオーバーひずみ(γ_c)は、試料が固体状から液体状に遷移し、定義上、G'=G"または黄褐色δ=1の振動ひずみで生じるせん断ギャップ高さに対するたわみ経路の比によって計算される剪断ひずみの尺度である。クロスオーバー降伏応力(σ_c)は、弾性弾性率と粘弾性率が交差するデバイスによって加えられる応力量の尺度である。健康な喀痰では、弾力性がひずみに対する機械的反応を支配する(G'>G")。粘液閉塞性疾患では、病理学的粘液変化の結果としてG'およびG"の両方が増加する¹⁷、^18、19。この装置の操作上のシンプルさにより、オンサイト測定が容易になり、分析のためにオフサイト施設へのサンプルの保管/輸送/出荷の必要性を回避し、これらの生物学的サンプルの特性に対する時間と凍結融解の影響を回避します。

この研究では、異なる濃度(1%〜3%)の8つのMDaポリエチレンオキシド(PEO)溶液を使用して、市販のベンチトップレオメーター(材料表)の測定範囲を検証し、得られた濃度依存曲線を従来のバルクレオメーター(材料表)で取得した測定値と直接比較しました。).次に、レオロジー測定の再現性を、気管支痙攣、好酸球性炎症、および環境または感染性因子に応答した粘液過産生を特徴とする喘息悪化の極端な形態であるステータス喘息(SA)に罹患している挿管患者から気管支鏡的に採取された粘液を用いて評価^した8,20.この場合、SA患者は重度の呼吸不全のために挿管されており、積極的な標準的な喘息治療にもかかわらず、機械的換気だけで患者を効果的かつ安全にサポートすることができないため、ECMO(体外膜酸素化)を必要としていた。葉椎虚脱のための臨床的に示された気管支鏡検査の間、厚く、透明で粘り強い分泌物が葉細気管支を妨害していることが指摘され、生理食塩水洗浄を用いて吸引された。収集の直後に、吸引液から余分な生理食塩水を除去し、残りのSAサンプルの粘弾性特性をベンチトップ装置を用いて分析した。追加のサンプルアリコートを還元剤であるトリス(2−カルボキシルエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)で処理し、このプロトコールがエクスビボでの治療化合物有効性を特徴付けるために使用され得るかどうかを決定する。

その結果、このプロトコルとベンチトップ装置が臨床現場で効果的に使用できることが示されました。PEO濃度依存曲線(図1A)から決定されたレオロジー特性は、試験済みのベンチトップ装置と従来の平行平板レオメータ(図1B)とでは区別がつかなかった。SA粘液の3連測定は反復可能で、G*、G'、およびG"エンドポイントの変動係数は10%であり、この患者の症例で臨床的に明らかであった粘液粘弾性の実質的な異常を反映していました(図1D)。最後に、TCEPによる エキソビボ 治療は、G'およびG"の有意な減少、および黄褐色δの増加をもたらし、ムチンネットワークの変化による治療に対する応答性を実証した(図2)。結論として、ベンチトップレオメーターを使用するこのプロトコルは、診療所から得られた粘液サンプルの粘弾性特性を評価するための簡単で効果的なアプローチを提供します。この機能は、臨床医が承認された粘膜活性薬の有効性を現場でテストできるため、ケアへの精密医療アプローチを促進するために使用され、代替治療選択肢を特定するのに役立ちます。さらに、このアプローチは、治験薬の効果を調べるための臨床試験で使用することができる。

プロトコル

本研究では、UNC治験審査委員会によって承認されたプロトコールの下でインフォームドコンセントを得た後、臨床的に示された気管支鏡検査中にサンプルを採取した。

1. 喀痰・粘液の採取・保管

1. 喀痰収集または気管支鏡検査吸引 を介して 気道粘液を採取する。
   1. 自発的な去痰 を介して 痰を採取するか、3%の高張生理食塩水吸入によって喀痰を誘発する。あるいは、気管支鏡検査手順中に気道から粘液を直接吸引する。
   2. 採取した気道喀痰/粘液を滅菌標本カップに保管してください。喀痰の場合は、採取後すぐにサンプルから余分な唾液を除去してください。
   3. 輸送のためにサンプルを氷の上に置きます。輸送時間を 4 時間未満に制限します。
2. 採取時にサンプルを分析し、処理するまで-80°Cで保存する。
   1. 保管前に、容積ピペットまたはピペットで3~5回、微量遠心チューブに直接静かに上下にピペッティングして粘液を均質化します。
   2. 保存用のサンプルを≥500 μLの容量でアリコートし、実験に十分な容量を確保します。
      注:凍結および融解は、サンプルの粘弾性特性に影響を与える可能性があります。同様の凍結/解凍サイクルを受けたサンプルのみを比較してください。

2. サンプル調製

1. 新鮮で凍結したスプータ/粘液のピペットは、分注する前に3〜5回軽く上下にピペッティングすることにより、正の変位ピペットを使用して検体を直接または均質化します。
   メモ:均質化は、再現性に影響を与える可能性のある太いプラグを含むサンプルにとって重要です。
2. 400~500 μLのサンプルを別々の微量遠心チューブにアリコートする。薬理学的試薬(例えば、rhDNase、N-アセチルシステイン)による反復測定および/または治療のために、必要な数のアリコートを調製する。測定前に、試験するアリコートを37°Cで最低5分間インキュベートします。
3. 薬理学的薬剤(オプション)を試験するには、サンプルの希釈を防ぐために高濃度のストック溶液を使用してください。
   1. 0.4%〜10%の容量(試料希釈を最小限に抑えるため)の所望の試薬(例えば、TCEP)を試料に直接加える。コンパウンドの滴がチューブの側面にとどまらないようにしてください。
   2. 化学反応を可能にするために、試料を37°Cで所望の時間(粘液のタンパク質分解分解を防ぐために<1時間)インキュベートする。
   3. 粘液サンプルと試薬を混合するには、微量遠心チューブの底部を2分ごとにフリックして、ムチンネットワークを損なうことなく粘液サンプルへの試薬の漸進的な浸透を可能にします(例えば、毛様体拍動および粘液繊毛クリアランスを模倣する)。複数の薬剤試薬を比較する場合は、インキュベーション時間が類似していることを確認してください。

3. 機器の初期化とキャリブレーション

1. マシンの電源を入れ(材料表)、ソフトウェアを初期化します。
2. [新しい測定] を選択します。続行するには、[メジャー ID] にサンプル ID 番号を入力し、[測定者] に測定者の名前を入力します。[コメント] に追加情報またはコメントを入力します。
3. ジオメトリセット(粗い、または滑らかな25mm平行プレート)を選択し、プレートが清潔で完璧な状態であることを確認するために、大小のプレートを慎重に検査します。
   注: ラフプレートは大容量(350~500 μL)用に設計されており、滑らかなプレートは少量(250~350 μL)用に設計されています。推奨よりも低いサンプル量または高いサンプル量を使用すると、測定が不正確になる可能性があります。
4. 大きな版を下の説教壇にしっかりと差し込みます。
5. 上の説教壇に小皿をそっと差し込み,版がきちんと締め付けられていることを示す「カチッ」という音が聞こえるまでわずかに回転させて版をロックします。なお、上板の自由振動は正常である。
6. 温度が37°Cの目標値に達するまで待ちます。次に、ソフトウェアの指示に従って自動キャリブレーションを開始します。
   メモ:このプロセス中は、機械やベンチトップの表面を乱さないでください。

4. サンプルローディング

1. 正の変位ピペットを用いて、大きな底板の中央に250〜500μLのサンプルの間でゆっくりとピペットする。プレートに堆積すると、粘性のあるサンプルはドーム形状を採用しますが、弾性の高いサンプルは物理的な切断が必要な場合があります(解剖はさみを使用)。
   メモ: 気泡の導入は避けてください。必要に応じて、ピペットチップで押して残留気泡を取り除きます。
2. ソフトウェア を介して 小板を運ぶ測定ヘッドを下げ、サンプルを観察します。底板に適切に装填されると、サンプルは接触し、2つのプレート間の中央に配置されます。
3. サンプルがギャップを埋めるようにするには(つまり、プレートの端まで広げることによって)、サンプルが両凹形状でなくなるか、プレートの端に揃うまで 、ギャップを縮小 する機能を使用します。 ギャップ低減 機能は、測定ヘッドを0.1mm刻みで下げ、7段階に制限されています。
   メモ:サンプルを注意深く監視し、オーバースピルを避けるためにギャップを徐々に調整してください。
   1. 7 回刻んでもギャップが残っている場合は、[ インストールのやり直し ] をクリックして初期位置に戻り、サンプルの位置や体積を調整します。
   2. ギャップが非常に減少した場合(例えば、両凸形状)、上板の縁に沿った円運動によってヘラで余分なサンプルを除去する。せん断応力を避けるために、余分なサンプルを優しくトリミングしてください。
      注:このステップの最後に、サンプルの端は、ユーザーガイドラインに示すように、上部プレートの端に合わせる必要があります。
4. 振動中に汚染された液体が誤って投影されないように、保護カバーを下げてください。

5. 生物物理学的測定の開始

1. 測定を開始するには、[ 解析の開始]をクリックします。フルサイクルには4〜7分かかります。
   1. サイクルの全期間にわたって、大声で話したり、デバイスやベンチに触れたりしないでください。静かな環境は、最初の2分間は特に重要です。
      メモ:サイクル中、計測器は連続する振動ステップで構成される標準化されたひずみ掃引試験を実行します。各ステップは、一定の振幅と周波数(1Hz)で10回の振動のシリーズであり、その間に対応するトルクがリアルタイムで測定されます。ひずみ信号とトルク信号により、各ステップでの複素数(G*)、弾性(G')、粘性(G")モジュライ、および減衰比(タンδ)の計算が可能になります。振動は徐々に振幅が増加し、サンプルに課せられた変形が激しくなります。

6. サンプル除去

1. サイクルが完了したら、[ 次へ ]をクリックして測定ヘッドを上げ、サンプル分析レポートを生成します。
   注:レポートでは、ソフトウェアは記録されたデータを計算し、サンプルに加えられた変形に関連して粘性と弾性率の進化を示す2つの曲線を自動的にグラフ化し、線形粘弾性レジーム(すなわち、低変形時のプラトー)が存在する場合は表示します。線形レジームが検出されない場合、G'、G"、G*、および黄褐色のδの値は0.05ひずみで抽出されます。さらに、クロスオーバーひずみと降伏応力(γ_c、 σ_c)は、tan δ = 1 で計算されます。データは、さらなる分析のために各ステップのスプレッドシートでも提供されます。
2. 測定ヘッドが完全に引っ込められたら、保護カバーを持ち上げ、サンプルを捨ててプレートを慎重に取り外します。温水と石鹸を使ってプレートをきれいにし、消毒してください。
   メモ: 繰り返し使用する前に、ジオメトリセットを十分に乾かしてください。

結果

図1 は、粘弾性制御の濃度依存曲線、すなわちポリエチレンオキシド(PEO)溶液、および状態喘息(SA)粘液を用いたレオロジー測定の精度および再現性を示す。5つの異なる濃度(1%、1.5%、2%、2.5%、および3%)での8MDa PEOの粘弾性特性の測定を、評価されたベンチトップレオメーターと従来のバルクレオメーター(材料表)の間で直接比較した。SA粘液とは対照的に、PEO?...

ディスカッション

粘液のユニークな粘弾性特性は、健康な気道を維持するために不可欠です。内的および外的要因は、気道粘液の生物物理学的特性を変化させ、粘液閉塞性疾患に特徴的な臨床合併症を引き起こす可能性がある。したがって、粘液粘弾性の変化を監視することは、疾患状態の評価および粘液粘弾性を低下させる治療法の探索中に考慮され得る。1980年代からの実証研究は、磁気ビーズレオメータ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.