Caracterização rápida da Viscoelástica do Muco das Vias Aéreas usando um Reômetro Benchtop

Resumo

As propriedades viscoelásticas do muco desempenham um papel crítico na liberação mucociliaria. No entanto, as técnicas reológicas muco tradicionais requerem abordagens complexas e demoradas. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o uso de um reômetro de bancada que pode realizar de forma rápida e confiável medições viscoelásticas.

Resumo

Em doenças pulmonares muco-obstrutivas (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose cística) e outras condições respiratórias (por exemplo, infecções virais/bacterianas), as propriedades biofísicas do muco são alteradas por hipersecreção de células de cálice, desidratação das vias aéreas, estresse oxidativo e presença de DNA extracelular. Estudos anteriores mostraram que a viscoelasticidade da escarro correlacionada com a função pulmonar e que tratamentos que afetam a reologia da escarro (por exemplo, mucolíticos) podem resultar em benefícios clínicos notáveis. Em geral, as medidas reológicas de fluidos não newtonianos empregam abordagens elaboradas e demoradas (por exemplo, reômetros de placas paralelas/cone e/ou rastreamento de partículas de microesferas) que requerem treinamento extensivo para realizar o ensaio e interpretar os dados. Este estudo testou a confiabilidade, a reprodutibilidade e a sensibilidade do Rheomuco, um dispositivo de bancada fácil de usar que foi projetado para realizar medições rápidas usando oscilação dinâmica com uma varredura de cepa de cisalhamento para fornecer moduli viscoelástico linear (G', G^{*, e} características de δ ponto de gel) e ponta de gel (γ_c e σ_c) para amostras clínicas dentro de 5 min. O desempenho do dispositivo foi validado utilizando diferentes concentrações de um simulador de muco, 8 óxido de polietileno MDa (PEO) e contra as tradicionais medições de reologia a granel. Um isolado clínico colhido de um paciente entubado com estado asmático (SA) foi então avaliado em medidas triplicadas e o coeficiente de variação entre as medidas é <10%. O uso ex vivo de um potente agente redutor de muco, o TCEP, no muco SA resultou em uma redução de cinco vezes no módulo elástico e uma mudança em direção a um comportamento mais "líquido" no geral (por exemplo, maior bronzeamento δ). Juntos, esses resultados demonstram que o reômetro de bancada testado pode fazer medidas confiáveis de viscoelasticidade do muco em ambientes clínicos e de pesquisa. Em resumo, o protocolo descrito poderia ser usado para explorar os efeitos de drogas mucoativas (por exemplo, rhDNase, N-acetil cysteine) no local para adaptar o tratamento caso a caso, ou em estudos pré-clínicos de novos compostos.

Introdução

Doenças muco-obstrutivas das vias aéreas, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística (CF) e outras condições respiratórias, como pneumonia viral e bacteriana, são preocupações de saúde prevalentes em todo o mundo. Embora a fisiopatologia varie muito entre cada condição, uma característica chave comum é o desembaraço mucociliar anormal. Em pulmões saudáveis, o muco alinha o epitélio das vias aéreas para capturar partículas inaladas e fornecer uma barreira física contra patógenos. Uma vez secretado, o muco das vias aéreas, composto por ~97,5% de água, 0,9% de sal, ~1,1% de proteínas globulares e ~0,5% de mucinas, é gradualmente transportado em direção ao glottis pela batida coordenada de cílio ^1,2. As mucinas são grandes glicoproteínas ligadas ao O que interagem através de ligações não covalentes e covalentes para fornecer as distintas propriedades viscoelásticas do muco, que é necessária para um transporte eficiente³. Alterações na ultraestrutura da rede de mucina causadas pelo transporte de íons alterados, desdobramentos da mucina, interações eletrostáticas, ligação cruzada ou alterações na composição podem afetar significativamente a viscoelasticidade da mucocus e prejudicar o despejo mucociliário ^4,5. Assim, identificar mudanças nas propriedades biofísicas do muco das vias aéreas é essencial para entender a patogênese da doença e testar novos compostos mucoativos⁶.

Vários fatores podem levar à produção de muco aberrante nos pulmões. Na DPOC, a inalação crônica de fumaça de cigarro desencadeia a hipersecreção do muco como resultado da metaplasia de células de cálice, bem como a desidratação das vias aéreas através da regulação da regulação da fibrose cística do canal cftr(CFTR), causando hiperconcentração do muco e obstrução das vias aéreas^{pequenas 7,8}. Da mesma forma, a CF, uma desordem genética associada a mutações no gene CFTR, caracteriza-se pela produção de muco viscoso e aderente que é inadequado para o transporte ^8,9. Em suma, a disfunção cftr induz o esgotamento líquido da superfície das vias aéreas, o emaranhamento de mucina polimérica e o aumento das interações bioquímicas, que resultam em inflamação crônica e infecções bacterianas. Além disso, as células inflamatórias presas no muco estático exacerbam ainda mais a viscoelasticidade do muco adicionando outra grande molécula, o DNA, na matriz de gel, piorando a obstrução das vias aéreas⁵. Um dos melhores exemplos da importância da reologia da muco na saúde geral dos pulmões é fornecido pelo exemplo de DNFase humano recombinante (rhDNase) no tratamento de pacientes com fibrose cística. Os efeitos do rhDNase foram demonstrados pela primeira vez ex vivo na escarro expectada, que mostrou uma transição do muco viscoso para um líquido fluindo em minutos^10,11. Ensaios clínicos em pacientes com CF demonstraram que a redução da viscoelasticidade do muco das vias aéreas com a inalação de rhDNase diminuiu a taxa de exacerbações pulmonares, e melhorou a função pulmonar e o bem-estar geral do paciente^em 12,13,14. Como resultado, a inalação de rhDNase teve como objetivo facilitar a liberação tornou-se o padrão de atendimento aos pacientes cf por mais de duas décadas. Benefícios clínicos semelhantes foram observados com o uso de soro fisiônico hipertônico inalado para hidratação muco em CF, que se correlacionava com alterações nas propriedades reológicas e resultou em aceleração do desembaraço mucociliário e melhora da função pulmonar^15,16. Por isso, um protocolo rápido e confiável para medir as propriedades viscoelásticas muco em ambientes clínicos é importante para otimizar abordagens terapêuticas.

O reômetro de bancada testado aqui oferece uma alternativa rápida e conveniente para realizar medições viscoelásticas abrangentes de amostras de muco/escarro. Utilizando oscilações dinâmicas com deslocamento angular controlado, o instrumento fornece deformação através de um par de placas paralelas ajustáveis (por exemplo, geometrias ásperas ou lisas) para medir o torque e o deslocamento com resoluções de 15 nN^. m e 150 nm, respectivamente¹⁷. Uma calibragem padronizada padrão combinada com as diretrizes do usuário adaptadas para especialistas em não reologia permite medições simples e reduz o risco de erros do operador. O dispositivo produz uma curva de varredura de tensão que é processada e analisada em tempo real (dentro de ~5 min) e fornece automaticamente características viscoelásticas lineares (G', G", G^*e tan δ) e de ponto de gel (γ_c, e σ_c) características (ver Tabela 1). O módulo elástico ou de armazenamento (G') descreve como uma amostra responde ao estresse (ou seja, a capacidade de retornar à sua forma original), enquanto o módulo viscoso ou de perda (G)descreve a energia dissipada por ciclo de deformação sinusoidal (ou seja, a energia perdida devido ao atrito das moléculas). O módulo complexo ou dinâmico (G*) é a razão do estresse com a tensão, que descreve a quantidade de acúmulo de força interna em resposta a um deslocamento de cisalhamento (ou seja, as propriedades viscoelásticas globais). O fator de amortecimento (δ) é a razão do módulo viscoso ao módulo elástico, que indica a capacidade de uma amostra de dissipar energia (ou seja, um baixo bronzeado δ indica um comportamento elástico-dominante/sólido, enquanto um alto bronzeado δ indica um comportamento viscoso-dominante/líquido-like). Para características de ponto de gel, a cepa de crossover (γ_c) é a medida da cepa de tesoura, calculada pela razão do caminho de deflexão para a altura da abertura do calha, na qual a amostra transita de um comportamento sólido para um líquido e ocorre, por definição, na tensão de oscilação onde G' = G" ou tan δ = 1. O estresse de rendimento cruzado (σ_c) é uma medida da quantidade de estresse aplicada pelo dispositivo em que o elástico e viscoso moduli cruzam. Em sputa saudável, a elasticidade domina a resposta mecânica à tensão (G' > G"). Nas doenças muco-obstrutivas, o aumento de G' e G" como resultado das alterações patológicas do muco 17,18,19. A simplicidade operacional do dispositivo facilita as medições no local e contorna a necessidade de armazenamento/transporte/envio de amostras para uma instalação offsite para análise, evitando assim os efeitos do tempo e do congelamento nas propriedades dessas amostras biológicas.

Neste estudo, foram utilizadas 8 soluções de óxido de polietileno MDa (PEO) de diferentes concentrações (1%-3%) para validar a faixa de medição de um reômetro de bancada comercial (Tabela de Materiais) e a curva dependente de concentração obtida foi diretamente comparada às medidas adquiridas com um reômetro a granel tradicional (Tabela de Materiais ). A repetibilidade das medidas reológicas foi então avaliada utilizando mucosoquiaticamente colhido de um paciente entubado que sofre de estado asmático (SA), uma forma extrema de exacerbação da asma caracterizada por broncoespasmo, inflamação eosinofílica e hiperprodução de muco em resposta a um agente ambiental ou infeccioso ^8,20 . Neste caso, o paciente sa tinha sido entubado para insuficiência respiratória grave e necessitado de ECMO (oxigenação de membrana extracorpórea) devido à incapacidade de apoiar o paciente de forma eficaz e segura com ventilação mecânica, apesar das terapias agressivas padrão de asma. Durante uma broncoscopia clinicamente indicada para o colapso do lobar, secreções grossas, claras e tenazes foram notadas como obstruindo brônquios de lobar e foram aspiradas usando lavagem salina. Imediatamente após a coleta, o excesso de soro fisiológico foi removido do aspirado e as propriedades viscoelásticas da amostra SA restante foram analisadas utilizando-se o dispositivo benchtop. Alíquotas adicionais de amostra foram tratadas com um agente redutor, tris (2 carboxillethyl) cloridrato de fosfina (TCEP), para determinar se este protocolo poderia ser usado para caracterizar a eficácia do composto terapêutico ex vivo.

Os resultados mostraram que este protocolo e o dispositivo benchtop podem ser usados efetivamente em um ambiente clínico. As propriedades reológicas determinadas a partir de curvas dependentes de concentração de PEO (Figura 1A) eram indistinguíveis entre o dispositivo de bancada testado e um reômetro tradicional de placa paralela (Figura 1B). As medidas triplicadas do muco SA foram repetidas, com coeficiente de variação de 10% para pontos finais de G*, G'e G e G e refletiram as anormalidades substanciais na viscoelasticidade muco que foram clinicamente aparentes no caso deste paciente (Figura 1D). Por fim, o tratamento ex vivo com TCEP resultou em uma redução significativa em G' e G", e aumento do bronzeado δ, demonstrando receptividade ao tratamento por alterações na rede de mucina (Figura 2). Em conclusão, este protocolo utilizando um reômetro benchtop fornece uma abordagem simples e eficaz para avaliar propriedades viscoelásticas de amostras de muco obtidas da clínica. Essa capacidade pode ser usada para facilitar abordagens de medicina de precisão para o cuidado, já que os médicos podem testar a eficácia de medicamentos mucoativos aprovados no local, o que pode ajudar a identificar opções alternativas de tratamento. Além disso, essa abordagem pode ser usada em ensaios clínicos para examinar os efeitos de medicamentos investigatórios.

Protocolo

No presente estudo, as amostras foram coletadas durante uma broncoscopia clinicamente indicada após a obtenção de consentimento informado sob protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UNC.

1. Coleta e armazenamento de escarro/muco

1. Coletar muco das vias aéreas através da coleta de escarro ou aspiração de broncoscopia.
   1. Coletar escarro por meio de expectativa espontânea ou induzir escarro por 3% de inalação salina hipertônica. Alternativamente, aspirar diretamente muco das vias aéreas durante um procedimento de broncoscopia.
   2. Armazenar escarro/muco coletado nas vias aéreas coletadas em copos de espécimes estéreis. No caso da escarro, remova o excesso de saliva da amostra imediatamente após a coleta.
   3. Coloque as amostras no gelo para transporte. Limite o tempo de transporte para menos de 4h.
2. Analise as amostras no momento da coleta ou armazene a -80 °C até que seja processada.
   1. Antes do armazenamento, homogeneize o muco ao escoar suavemente de três a cinco vezes com uma pipeta de deslocamento positiva ou pipeta diretamente nos tubos de microcentrifuuge.
   2. Alíquotar as amostras para armazenamento em volumes ≥500 μL para garantir volume suficiente para experimentos.
      NOTA: O congelamento e o descongelamento podem afetar as propriedades viscoelásticas da amostra. Compare apenas amostras que sofreram ciclos semelhantes de congelamento/degelo.

2. Preparação da amostra

1. Pipeta sputa/muco fresco e congelado diretamente ou homogeneiza amostras usando uma pipeta de deslocamento positiva, cochilando suavemente para cima e para baixo três a cinco vezes antes de aliquotar.
   NOTA: A homogeneização é importante para amostras que contenham tampões grossos que possam afetar a reprodutibilidade.
2. Alíquota 400-500 μL da amostra em tubos de microcentrifuus separados. Prepare quantas alíquotas necessários para medir e/ou tratamento com reagentes farmacológicos (por exemplo, rhDNase, cisteína N-acetil). Incubar as alíquotas a serem testadas a 37 °C por um mínimo de 5 minutos antes da medição.
3. Para testar agentes farmacológicos (opcional), utilize altas concentrações de soluções de estoque para evitar a diluição da amostra.
   1. Adicione entre 0,4% e 10% de volume (para minimizar a diluição da amostra) do reagente desejado (por exemplo, TCEP) diretamente na amostra. Certifique-se de que nenhuma gota do composto fique na lateral do tubo.
   2. Incubar as amostras a 37 °C pelo tempo desejado para permitir uma reação química (<1 h para evitar a degradação proteolítica do muco).
   3. Misture a amostra de muco e o reagente, mexendo o fundo do tubo de microcentrífuga a cada 2 minutos para permitir a penetração progressiva do reagente na amostra de muco sem comprometer a rede de mucina (por exemplo, imitando a batida ciliar e o despejo mucociliário). Ao comparar vários reagentes medicamentosos, certifique-se de que o tempo de incubação seja semelhante.

3. Inicialização e calibração do instrumento

1. Ligue a máquina (Tabela de Materiais) e inicialize o software.
2. Selecione Nova medição. Digite o número de identificação da amostra em Measure ID e o nome do operador em Operador para continuar. Insira informações adicionais ou comentários nos comentários.
3. Selecione um conjunto de geometria (ou seja, placas paralelas ásperas ou lisas de 25 mm) e inspecione placas grandes e pequenas cuidadosamente para garantir que as placas estejam limpas e em perfeitas condições).
   NOTA: As placas ásperas são projetadas para grandes volumes (350-500 μL) e placas lisas são projetadas para volumes menores (250-350 μL). O uso de um volume amostral menor ou maior do que o recomendado pode causar medidas imprecisas.
4. Insira a placa grande firmemente no púlpito inferior.
5. Insira a placa pequena suavemente no púlpito superior e bloqueie a placa girando ligeiramente até ouvir um "clique", o que indica que a placa está devidamente presa. Note que a oscilação livre da placa superior é normal.
6. Aguarde até que a temperatura atinja o valor-alvo de 37 °C. Em seguida, inicie a calibração automática conforme solicitado pelo software.
   NOTA: Não perturbe a superfície da máquina ou do banco durante este processo.

4. Carregamento de amostras

1. Utilizando uma pipeta de deslocamento positiva, pipeta lenta entre 250 e 500 μL da amostra no centro da grande placa inferior. Uma vez depositadas na placa, amostras viscosas adotarão uma forma de cúpula, enquanto amostras altamente elásticas podem exigir corte físico (use tesoura de dissecação).
   NOTA: Evite introduzir bolhas de ar. Se necessário, remova bolhas residuais afastando-se com uma ponta de pipeta.
2. Abaixe a cabeça de medição carregando a pequena placa através do software e observe a amostra. Se estiver devidamente carregada na placa inferior, a amostra fará contato e será centrada entre as duas placas.
3. Para garantir que a amostra preencha a lacuna (ou seja, espalhando-se para as bordas das placas), use a função Reduzir a Lacuna até que a amostra não esteja mais em forma biconcava ou esteja alinhada com a borda das placas. A função Reduce Gap reduz a cabeça de medição em incrementos de 0,1 mm e é limitada a sete incrementos.
   NOTA: Monitore a amostra cuidadosamente e ajuste a lacuna progressivamente para evitar o excesso de depils.
   1. Se uma lacuna permanecer após sete incrementos, clique em Redo Instalação para retornar à posição inicial e ajustar a posição e/ou volume da amostra.
   2. Se a lacuna for extremamente reduzida (por exemplo, forma biconvex), remova a amostra em excesso com uma espátula por um movimento circular ao longo da borda da placa superior. Certifique-se de aparar a amostra em excesso suavemente para evitar o estresse da tesoura.
      NOTA: No final desta etapa, a borda da amostra deve estar alinhada com a borda da placa superior, como mostrado nas diretrizes do usuário.
4. Abaixe a tampa protetora para evitar qualquer projeção acidental de fluidos contaminados durante a oscilação.

5. Iniciar a medição biofísica

1. Para iniciar a medição, clique em Iniciar Análise. Um ciclo completo levará de 4 a 7 minutos.
   1. Evite falar alto e toque no dispositivo ou no banco durante toda a duração do ciclo. Um ambiente tranquilo é particularmente importante para os primeiros 2 minutos.
      NOTA: Durante o ciclo, o instrumento realiza um teste padronizado de varredura de tensão, que consiste em sucessivas etapas oscilantes. Cada passo é uma série de 10 oscilações em constante amplitude e frequência (1 Hz), durante a qual o binário correspondente é medido em tempo real. Os sinais de tensão e torque permitem a computação do moduli complexo (G*), elástico (G') e viscoso (G), bem como a razão de amortecimento (δ bronzeada) em cada etapa. As oscilações aumentam gradualmente na amplitude, o que intensifica a deformação imposta à amostra.

6. Remoção de amostras

1. Uma vez que o ciclo esteja concluído, clique em Próximo para levantar a cabeça de medição e gerar o relatório de análise da amostra.
   NOTA: Para o relatório, o software computa os dados registrados egrafia automaticamente duas curvas mostrando a evolução do viscoso e do moduli elástico em relação à deformação exercida à amostra e exibe o regime viscoelástico linear (ou seja, um platô em baixa deformação) se presente. Se não for detectado regime linear, os valores de G', G", G*e tan δ são extraídos a 0,05. Além disso, a cepa de crossover e o estresse de rendimento (γ_c, e σ_c) são calculados em δ bronzeada = 1. Os dados também são fornecidos em planilhas para cada etapa para análise posterior.
2. Uma vez que a cabeça de medição esteja totalmente retraída, levante a tampa protetora, descarte a amostra e remova cuidadosamente as placas. Limpe e desinfete as placas usando água morna e sabão.
   NOTA: Seque bem o conjunto de geometria antes do uso repetido.

Resultados

A Figura 1 mostra a precisão e a repetibilidade das medidas reológicas utilizando curvas dependentes de concentração de controle viscoelástico, ou seja, solução de óxido de polietileno (PEO) e muco asmático de status (SA). As medições de características viscoelásticas de 8 MDa PEO em cinco concentrações diferentes (1%, 1,5%, 2%, 2%, 2,5% e 3%) foram diretamente comparadas entre o reômetro avaliado no bancada e um reômetro a granel tradicional (Tabela de Materiais

Discussão

As propriedades viscoelásticas únicas do muco são essenciais na manutenção de vias aéreas saudáveis. Fatores internos e externos podem alterar as propriedades biofísicas do muco das vias aéreas, causando complicações clínicas características de doenças muco-obstrutivas. Assim, o monitoramento de mudanças na viscoelasticidade do muco pode ser considerado durante avaliações do estado da doença e exploração de terapias que reduzem a viscoelasticidade do muco. Estudos empíricos da década de 1980 demonst...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capillary Pistons Tips	Gilson	CP1000
Discovery Hybrid Rheometer-3	TA Instruments		DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.
Graphing Software	GraphPad Prism		GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis
Microcentrifuge Tube	Costar	3621
Peltier plate	TA Instruments		Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE
Polyethylene oxide	Sigma	372838	8 MDa polymer used as mucus simulant
Positive Displacement Pipette	Gilson	M1000	Pipette used for handling viscous solutions
Rheomuco	Rheonova		Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.
Rough Lower Geometries	Rheonova	D-1811-007	25mm Diameter
Rough Upper Geometries	Rheonova	U-1811-007	25mm Diameter
Smooth Upper Parallel Plate	TA Instruments		20mm Diameter
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Sigma	646547-10X1ML	TCEP: Potent reducing agent.