利用小鼠模型研究MYH7突变Gly823Glu在家族性肥厚型心肌病中的发病机制

摘要

基于我们临床工作中发现的家族性遗传性心肌病家族，我们通过CRISPR / Cas9介导的基因组工程在小鼠MYH7位点创建了一个具有点突变（G823E）的C57BL / 6N小鼠模型来验证该突变。

摘要

家族性肥厚型心肌病（HCM，OMIM:613690）是中国最常见的心肌病。然而，HCM的潜在遗传病因仍然难以捉摸。

我们之前在一个患有HCM的大型中国汉族家族中发现了肌球蛋白重链7（MYH7）基因杂合变体NM_000257.4:c.G2468A（p.G823E）。在该家族中，变异型 G823E 与常染色体显性遗传病共存。该变体位于MYH7蛋白颈部区域的杠杆臂结构域，并且在同源肌球蛋白和物种中高度保守。为了验证G823E变体的致病性，我们用CRISPR / Cas9介导的基因组工程制作了一个C57BL / 6N小鼠模型，该模型在小鼠MYH7位点具有点突变（G823E）。我们设计了gRNA靶向载体和供体寡核苷酸（靶向序列两侧有134 bp的同源性）。供体寡核苷酸中的p.G823E（GGG至GAG）位点通过同源定向修复引入MYH7的外显子23中。还插入了沉默的p.R819（AGG至CGA），以防止同源定向修复后gRNA结合和序列的重新切割。超声心动图显示 MYH7 G823E/- 小鼠在 2 个月龄时左心室后壁 （LVPW） 肥大伴收缩。这些结果同样通过组织学分析得到验证（图3）。

这些结果表明，G823E变异株在HCM的发病机制中起着重要作用。我们的研究结果丰富了与家族性HCM相关的MYH7变异谱，可为该中国家庭的遗传咨询和产前诊断提供指导。

引言

肥厚型心肌病（HCM，OMIM:613690）是中国最常见的心肌病，估计发病率为0.2%，影响15万人^1，2。

HCM 的病理解剖学特征是不对称性心室肥厚，通常累及心室流出道和/或室间隔³。临床表现为劳力性呼吸困难、乏力和胸痛。HCM 的个体表型具有从临床隐匿到严重心力衰竭的变异性。HCM 患者需要药物治疗、心脏移植、生命支持设备和多学科随访⁴.

在过去的一个世纪里，PCR技术改变了我们研究DNA^的方式5。Sanger及其同事发现了一种用于临床诊断的DNA测序方法⁶。桑格技术随后被应用于人类基因组计划，但这种方法既昂贵又耗时^7。全基因组测序（WGS）的出现将人类遗传疾病的见解带到了新的高度，但在成本方面仍然令人望而却步。全外显子组测序（WES）技术长期以来一直用于检测种系变异⁸ ，并已成功鉴定各种癌症外显子组中的体细胞驱动突变⁹。通过WES检测DNA外显子或编码区可用于揭示大多数孟德尔疾病的致病变异。如今，随着测序成本的降低，WGS有望成为基因组学研究的重要工具，并可广泛应用于基因组中致病变异的检测。

WES 技术也已用于遗传性心肌病，以识别致病变异，以进一步阐明病因。新出现的证据表明，编码肌节结构蛋白基因突变的基因，如MYH7 10、MYH6 11、MYBPC3 12、MYL2 13、MYL3 14、TNNT2¹⁵、TNNI3 16、TNNC1 17和^{TPM1 18}是HCM遗传病因的原因。对罕见致病基因（例如，暗摜葒素、细胞骨架钙调蛋白和Titin相互作用的RhoGEF（OBSCN，OMIM:608616）¹⁹、作用α2（ACTN2，OMIM:102573）²⁰以及半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白3（CSRP3，OMIM:600824）²¹））中致病变异的认识也与HCM有关。目前的遗传学研究已经在大约40%-60%的HCM患者中确定了肉瘤蛋白基因中多种不同的致病变异，HCM患者的基因检测显示，大多数致病变异发生在肌球蛋白重链（MYH7）和肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC3）中。然而，HCM的遗传基础仍然难以捉摸。探索人类HCM患者背后的这些变异的致病性仍然是一个主要挑战²²。

在这项研究中，我们报告了WES在中国汉族HCM家族中MYH7的致病变异。为了验证该变体的致病性，我们使用CRISPR / Cas9系统建立了C57BL / 6N-Myh7^{em1（G823E）} 敲入小鼠。我们还讨论了这种变体的合理机制。

研究方案

这些家庭的历史是通过与家庭成员面谈获得的。该研究获得广东省中医院伦理委员会（第2019074号）批准。已获得所有家庭成员的知情书面同意。所有动物均按照广东省中医院（中国广州）的道德准则进行治疗。

1. 研究对象

注:先证者III-3于2019年7月到广东省中医院心血管外科就医。

1. 获取先证者的详细家族病史。通知并呼叫先证者的所有家庭成员。所有家庭成员都经过了细致的体检。
   1. 对所有临床数据进行系统审查，包括病历、心电图、超声心动图和心导管检查报告。
   2. 在干预或手术期间再次确认所有患者的心脏表型。
2. 从本地数据库中总共选择 174 个基于人群的健康对照。从每位患者收集约 4.0 mL 外周静脉血。

2. 脱氧核糖核酸提取

注意:DNA是根据制造商的说明使用商业血液试剂盒提取的。

1. 按照制造商的方案，在DNA稳定剂存在下用阴离子洗涤剂裂解血细胞。
2. 向细胞裂解物中加入 10 μL RNase A 溶液，并通过倒置试管混合 25 次。在37°C孵育15分钟至1小时。
3. 通过盐沉淀去除蛋白质。使用蛋白质沉淀溶液（0.25 mg牛血清白蛋白溶解在25 mL蒸馏水中）和100%异丙醇沉淀蛋白质。然后，使用 200 μL 70% 乙醇并在 4 °C 下以 12，000 x g/min 离心 15 分钟以洗涤 DNA 沉淀。
4. 用 500 μL 70% 乙醇沉淀回收基因组 DNA。以 12，000 x g 离心 30 秒。吸出沉淀，然后将沉淀溶解在水合溶液中（1 mM EDTA，10 mM Tris·氯，酸7.5）。
5. 使用分光光度计（例如，NanoDrop 2000）测定纯度。纯化的 DNA 通常具有 1.7 和 1.9 之间的 A260/A280 比率，大小高达 200 kb。
6. 将DNA长期储存在2-8、-20或-80°C。

3. 全外显子组测序与变异分析

注意:为了系统地搜索致病基因突变，在受影响的个体（II-5，II-7，III-3，III-7，III-8，III-9和IV-3）和未受影响的个体（III-2，III-5，IV-4）中进行外显子组测序。

1. 根据制造商的说明使用外显子组探针进行外显子组捕获。
2. 将合格的文库应用于HiSeq X-ten平台上的2×150 bp配对末端测序。请参阅 补充文件 1。
3. 将 FASTQ 文件与人类参考基因组 （hg19/GRCh37） 与 BWA v0.7.1318，19 对齐。使用 samtools 对对齐的文件（sam/bam 格式文件）进行排序，然后使用 Picard 标记重复项。请参阅 补充文件 1。
4. 使用 GATK，在本地重新对齐读数并重新校准基本质量。请参阅 补充文件 1。
5. 生成映射统计信息，包括通过 BEDTools 和内部 perl/python 脚本重新校准的文件的覆盖范围和深度。
6. 来自使用 GATK 单倍型调用者工具的多样本处理模式重新校准的 BAM 文件中的基因型变异（SNV 和插入缺失）。
7. 使用 VQSR（变体质量分数重新校准）来减少变体调用的误报。
8. 使用ANNOVAR软件21针对多个数据库（包括外显子组聚集联盟（ExAC）（http://exac.broadinstitute.org），外显子组测序项目（ESP）（https://esp.gs.washington.edu）和1，000 G（http://www.1000genomes.org））对SNV和插入缺失进行注释。根据 ACMG 指南解释序列变异的致病性。

4. 桑格测序

1. 使用 ABI 3500 测序仪²³ 执行 Sanger 测序以确认潜在的致病变异并确定家族中的变异分离。
2. 设计MYH7基因变异的引物序列（NM_000257）如下:5'-TTCAAACAGAGACCTGCAGG-3'和5'-CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT-3'。
3. 确认变体，筛选所有可用的家族成员以确定家族内的变体分离²³.

5. C57BL/6N-MYH7^{em1（G823E）} 敲入小鼠的产生

1. 使用CRISPR / Cas9系统生成C57BL / 6N-Myh7^{em1（G823E）} 敲入小鼠。小鼠 Myh7 基因（基因库入藏号:NM_001361607.1;Ensembl:ENSMUSG00000053093）位于小鼠14号染色体上，有41个外显子。ATG起始密码子在外显子4和TAG停止密码子在外显子41，G823E位于外显子23。选择外显子 23 作为目标位点。
2. 设计gRNA靶向载体和供体寡核苷酸的序列（使用靶向序列，两侧由134 bp同源序列组合）。
   1. 登录NCBI网站，点击右侧的 BLAST在线引物设计 功能。
   2. 单击页面底部的 引物BLAST 功能以设计引物。
   3. 将 MYH7 NCBI 参考序列号 NM_000257.4 粘贴到 PCR 模板框中。
   4. 扩增靶片段（MYH7 cDNA 外显子 23 及其相邻外显子），因此在外显子 21 （2392-2528） 上设计上游引物，在外显子 25 （3205-3350） 上设计下游引物。在正确的范围框中输入上游和下游引物的外显子编号。
   5. 单击底部的 获取引物 按钮以自动生成多对引物。
3. 将MYH7基因输入ZFIN数据库，将供体寡核苷酸中的p.g823e（GGG至GAG）突变位点和沉默突变p.r819（AGG至CGA）引入外显子23。沉默突变阻止了同源定向修复后gRNA对序列的结合和重新切割。
   1. 根据一般序列设计gRNA，两端的序列是TAATACGACTCACTATA和-GTTTTAGAGCTA。序列的中间是上面提到的目标站点。
4. 将Cas9 mRNA，体 外 转录和供体寡核苷酸产生的gRNA共同注射到受精卵中，用于KI小鼠生产。
   1. 使用Cas9/gRNA靶标效率检测试剂盒将设计的gRNA靶标转录为体 外 gRNA，并根据制造商的方案检测转录本的活性（具体检测方法参见VK007试剂盒说明）。
   2. 解冻T7 ARCA mRNA试剂盒组分，混合并在微量离心机中脉冲旋转，以将溶液收集到管底部。在室温下按以下顺序组装反应:2x ARCA/NTP 混合物至 10 μL、1 μg 模板 DNA、2 μL T7 RNA 聚合酶混合物，以及无核酸酶水至 20 μL。
   3. 充分混合并在微量离心机中脉冲旋转。在37°C孵育30分钟。
   4. 通过加入 2 μL DNase I 去除模板 DNA，充分混合，并在 37 °C 下孵育 15 分钟以获得 mRNA。
   5. 在约4周龄时用0.5mL注射器将血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素腹膜内注射到预先制备的C57BL / 6雌性小鼠中，每只小鼠的剂量约为5U，两次注射之间的间隔为48小时。
   6. 给药后18小时，注射激素后颈脱位处死C57BL/6雌性小鼠和1只8-12周龄C57BL/6雄性小鼠。分别收集卵子和精子。
   7. 精子在获能液中被加能。将液体边缘的精子放入短寿命卵细胞中进行体 外 受精3-4小时。
   8. 用无RNase的水在 体外将 成功转录的gRNA和Cas9 mRNA稀释至25ng / μL和50 ng / μL。 通过显微注射引入小鼠受精卵的细胞质中。将状况良好的受精卵移植到雌性小鼠扩大的输卵管中。与结扎的雄性小鼠共笼。
5. 通过PCR对幼崽进行基因分型。使用以下PCR条件:94°C3分钟，35个循环，94°C30秒，60°C35秒，72°C35秒;72°C5分钟。然后进行序列分析。
   1. 用剪刀剪下4个月大的小鼠的尾巴，并将它们放入1.5mL EP管中。在微量离心管中，每片尾片（2-5 mm）加入 180 μL 缓冲液 GL、20 μL 蛋白酶 K 和 10 μL RNase A。注意不要剪掉太多的尾巴。
   2. 将试管在56°C孵育过夜。
   3. 在微量离心管中以1，000× g 旋转2分钟以除去杂质。
   4. 加入 200 μL 缓冲液 GB 和 200 μL 无水乙醇，充分混合。
   5. 将离心柱放入收集管中。将样品施加到旋转中并以1，000× g 离心2分钟。丢弃流出物。
   6. 向离心柱中加入 500 μL 缓冲液 WA，并以 1，000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
   7. 向离心柱中加入 700 μL 缓冲液 WB，并以 1，000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
      注意:确保缓冲液WB已与100%乙醇预混合。添加缓冲液WB时，添加到管壁以洗去残留的盐。
   8. 重复步骤 5.5.7。
   9. 将离心柱放入收集管中，并以1，000× g 离心2分钟。
   10. 将离心柱放入新的 1.5 mL 管中。在柱膜中心加入50-200μL灭菌水或洗脱缓冲液，让柱静置5分钟。
       注意:将灭菌水或洗脱缓冲液加热至65°C可提高洗脱率。
   11. 要洗脱DNA，请将色谱柱以1，000 x g 离心2分钟。为了提高DNA的产量，将流通和/或50-200μL灭菌水或洗脱缓冲液添加到离心柱膜的中心，让柱静置5分钟。以1，000 x g 离心2分钟。
   12. 通过电泳定量洗脱的基因组DNA。

6.心脏形态和功能的评估

注意:应用M型超声心动图评估C57BL / 6N-Myh7^{em1（G823E）} 敲入小鼠的心脏形态和功能。

1. 将敲入小鼠放入连接到麻醉机的封闭亚克力盒中，并调整三通接口，使异氟醚（浓度:3%）流入丙烯酸盒中。在敲入小鼠停止自主移动后，移除敲入小鼠。
2. 将敲入小鼠平放在小动物麻醉机的生命监测平台上，连续吸入麻醉混合氧气（流量:0.8L/min）和异氟烷（浓度:3%）。在麻醉小鼠上涂抹眼睛润滑剂以防止角膜干燥。
3. 将敲入鼠标水平固定在平台上。将平台尾部倾斜 30° 到敲入鼠标。使用脱毛膏去除敲击小鼠前胸壁上的毛发。
4. 垂直放置探头，凸起朝向动物的头部。然后，将探头逆时针旋转约 45°。
5. 在胸骨旁长轴视图中，顺时针旋转探头 90° 以观察胸骨旁短轴视图。将探头旋转 90° 后，调整 y 轴位移以获得正确的切片。
6. 观察心脏的长轴图像（图1C），然后选择M模式测量数据。
7. 从小鼠的胸骨旁长轴视图获取超声数据（图1）。测量心率 （HR）、左心室射血分数 （LVEF）、心输出量 （CO）、左心室舒张末期尺寸 （LVDd）、LVD 左心室收缩末期尺寸 （LVSd）、室间隔 （IVS） 和左心室后壁 （LVPW）。
8. 测量后，为小鼠提供氧气，并在它们恢复自主活动时将它们放回各自的笼子中。

结果

家庭的临床概况
获得了HCM的家族谱系，如图 2所示。所有记录在案的家庭成员在入组时均被诊断为HCM。

在家庭中（图2A），先证者是患者III-7，他在46岁时被诊断出患有HCM和左心室流出道梗阻（LVOTO），并接受了心脏手术。患者III-3患有不需要手术治疗的轻微HCM。患者IV-3也有轻微的HCM，这与他的父亲患者III-3相似。患者II-5患有HCM，...

讨论

在这项研究中，我们描述了一个患有HCM的中国汉族家庭。遗传学分析显示，杂合子MYH6突变p.G823E与常染色体显性遗传家族成员中的疾病共同分离。为了验证G823E突变的致病性并讨论其潜在机制，我们通过CRISPR / Cas9介导的基因组工程在小鼠Myh7位点上创建了具有G823E的C57BL / 6N小鼠模型。

采用超声心动图评价C57BL/6N-Myh7^{em1（G823E）} 敲入小鼠的表型特征。与对照组相比，在C57BL...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5×TBE	Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus)	Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose	Regu
Anesthesia machine for small animals	Reward Life Technology Co., Ltd.	R500
BEDTools		2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit	Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.	VK007
DNA Marker	Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer	Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.	DNAstable LD	prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome	Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.	HS-S7220-B
GATK		v3.5
Gentra Puregene blood kit	Santa Clara
Glass slide, coverslip	Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.	C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform	Illumina		perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin	Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin	Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane	Local suppliers		inhalation anesthesia
Microinjection microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000
Paraffin Embedding Machine	Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.	HS-B7126-B
Picard		(2.2.4) 20
Proteinase K	Merck KGaA
samtools		1.3
Sequencer	Applied Biosystems	ABI 3500
Stereomicroscope	Nikon	SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6	Agilent Technology Co., Ltd.		exome probe
T7 ARCA mRNA Kit	New England BioLabs, Inc.	NEB-E2065S
Temperature box	BINDER GmbH	KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution	Sigma, Merck KGaA	No. T2663
Veterinary ultrasound system	Royal Philips	CX50