Investigando a patogênese da mutação MYH7 Gly823Glu em cardiomiopatia hipertrófica familiar usando um modelo de camundongo

Resumo

Com base na família de cardiomiopatia hereditária familiar encontrada em nosso trabalho clínico, criamos um modelo de camundongo C57BL / 6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo através da engenharia genômica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar essa mutação.

Resumo

A cardiomiopatia hipertrófica familiar (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China. No entanto, a etiologia genética subjacente da CMH permanece indescritível.

Identificamos anteriormente uma variante heterozigótica do gene da cadeia pesada 7 da miosina (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), em uma grande família Han chinesa com CMH. Nesta família, a variante G823E cosegrega com um distúrbio autossômico dominante. Esta variante está localizada no domínio do braço de alavanca da região do pescoço da proteína MYH7 e é altamente conservada entre miosinas homólogas e espécies. Para verificar a patogenicidade da variante G823E, produzimos um modelo de camundongo C57BL/6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo com engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9. Projetamos vetores de gRNA direcionados e oligonucleotídeos doadores (com sequências de segmentação ladeadas por 134 pb de homologia). O sítio p.G823E (GGG a GAG) no oligonucleotídeo doador foi introduzido no éxon 23 do MYH7 por reparo direcionado por homologia. Um p.R819 silenciado (AGG para CGA) também foi inserido para evitar a ligação do gRNA e a reclivagem da sequência após o reparo direcionado por homologia. O ecocardiograma revelou hipertrofia da parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) com sístole em camundongos MYH7 G823E/- aos 2 meses de idade. Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3).

Estes resultados demonstram que a variante G823E desempenha um papel importante na patogênese da CMH. Nossos achados enriquecem o espectro de variantes do MYH7 ligadas à CMH familiar e podem fornecer orientação para aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal nesta família chinesa.

Introdução

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China, com incidência estimada em 0,2%, acometendo 150.000 pessoas ^1,2.

A característica anatômica patológica que caracteriza a CMH é a hipertrofia ventricular assimétrica, que frequentemente envolve a via de saída ventricular e/ou septo interventricular³. A manifestação clínica é dispneia ao esforço, fadiga e dor torácica. O fenótipo individual da CMH tem variabilidade que varia de clinicamente insidiosa a insuficiência cardíaca grave. Pacientes com CMH necessitam de tratamento médico, transplante cardíaco, equipamentos de suporte à vida e acompanhamento multidisciplinar⁴.

No século passado, a tecnologia de PCR mudou a maneira como estudamos o DNA⁵. Um método de sequenciamento de DNA para diagnóstico clínico foi descoberto por Sanger e colegas⁶. A técnica de Sanger foi posteriormente aplicada ao Projeto Genoma Humano, mas essa abordagem foi dispendiosa e demorada⁷. O advento do sequenciamento do genoma completo (WGS) trouxe insights sobre doenças genéticas humanas a novos patamares, mas permaneceu proibitivo em termos de custo. A tecnologia de sequenciamento de exoma completo (WES) tem sido usada há muito tempo para detectar variantes da linha germinativa⁸ e tem sido bem-sucedida na identificação de mutações de drivers somáticos no exoma de vários tipos de câncer⁹. A detecção de éxons de DNA ou regiões codificadoras por WES pode ser usada para revelar variantes patogênicas na maioria das doenças mendelianas. Hoje, com a diminuição do custo do sequenciamento, espera-se que o WGS se torne uma ferramenta importante na pesquisa genômica e possa ser amplamente utilizado na detecção de variantes patogênicas no genoma.

A tecnologia WES também tem sido usada na cardiomiopatia hereditária para identificar variantes patogênicas para elucidar ainda mais a etiologia. Evidências emergentes implicaram que genes que codificam mutações genéticas de proteínas estruturais do sarcômero, como MYH7 10, MYH6¹¹, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3¹⁴, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 e^{TPM1 18} são responsáveis pela etiologia genética da CMH. O conhecimento de variantes patogênicas em genes causadores de doenças raras (por exemplo, obscurina, calmodulina citoesquelética e RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)¹⁹, agindo alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)²⁰ e proteína rica em cisteína e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)²¹) também tem sido associada à CMH. Estudos genéticos atuais identificaram múltiplas variantes patogênicas distintas no gene da proteína sarcomérica em aproximadamente 40%-60% dos pacientes com CMH, e testes genéticos em pacientes com CMH revelaram que a maioria das variantes patogênicas ocorre na cadeia pesada da miosina (MYH7) e na proteína C de ligação à miosina (MYBPC3). No entanto, a base genética para a CMH permanece indescritível. Explorar a patogenicidade dessas variações subjacentes aos pacientes humanos com CMH continua sendo um grande desafio²².

Neste estudo, relatamos uma variante patogênica no MYH7 em uma família Han chinesa com CMH por WES. Para verificar a patogenicidade dessa variante, estabelecemos um camundongo knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E) utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Também discutimos mecanismos plausíveis dessa variante.

Protocolo

As histórias das famílias foram obtidas por meio de entrevistas com os familiares. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (No. 2019074). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os membros da família. Todos os animais são tratados de acordo com as diretrizes éticas do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (Guangzhou, China).

1. Sujeitos do estudo

NOTA: O probando III-3 procurou aconselhamento médico no Departamento de Cirurgia Cardiovascular do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong em julho de 2019.

1. Obtenha uma história médica familiar detalhada do probando. Notifique e ligue para todos os membros da família do probando. Todos os membros da família foram submetidos a exames físicos meticulosos.
   1. Realizar uma revisão sistemática de todos os dados clínicos, incluindo registros médicos, ECGs, ecocardiogramas e relatórios de cateterismo cardíaco.
   2. Reconfirmar fenótipos cardíacos em todos os pacientes durante a intervenção ou cirurgia.
2. Selecione um total de 174 controles saudáveis de base populacional do banco de dados local. Coletar aproximadamente 4,0 mL de sangue venoso periférico de cada paciente.

2. Extração de DNA

NOTA: O ADN é extraído com um kit de sangue comercial de acordo com as instruções do fabricante.

1. Lise as células sanguíneas com um detergente aniônico na presença de um estabilizador de DNA seguindo o protocolo do fabricante.
2. Adicionar 10 μL de solução de RNase A ao lisado celular e misturar invertendo o tubo 25 vezes. Incubar a 37 °C durante 15 min a 1 h.
3. Remova as proteínas por precipitação de sal. Use solução de precipitação proteica (0,25 mg de albumina sérica bovina dissolvida em 25 mL de água destilada) e isopropanol a 100% para precipitar proteínas. Em seguida, use 200 μL de etanol a 70% e realize a centrifugação a 12.000 x g/min a 4 °C por 15 min para lavar o pellet de DNA.
4. Recuperar o DNA genômico por precipitação com 500 μL de etanol a 70%. Centrífuga a 12.000 x g por 30 s. Aspirar e depois dissolver o pellet em solução de hidratação (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
5. Use um espectrofotômetro (por exemplo, NanoDrop 2000) para determinar a pureza. O DNA purificado normalmente tem uma relação A260/A280 entre 1,7 e 1,9 e tem até 200 kb de tamanho.
6. Armazene o DNA por um longo prazo a 2-8, -20 ou -80 °C.

3. Sequenciamento completo do exoma e análise de variantes

NOTA: Para procurar sistematicamente mutações genéticas causadoras de doenças, foi realizado o sequenciamento do exoma em indivíduos afetados (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 e IV-3) e indivíduos não afetados (III-2, III-5, IV-4).

1. Use a sonda de exoma de acordo com as instruções do fabricante para realizar a captura do exoma.
2. Aplique as bibliotecas qualificadas a 2 × sequenciamento de extremidade emparelhada de 150 pb na plataforma HiSeq X-ten. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
3. Alinhe os arquivos FASTQ ao genoma humano de referência (hg19/GRCh37) com BWA v0.7.1318,19. Classifique os arquivos alinhados (arquivos de formato sam/bam) com samtools e sinalize duplicatas usando Picard. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
4. Use o GATK, realinhe as leituras localmente e recalibre as qualidades básicas. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
5. Gere estatísticas de mapeamento que incluam cobertura e profundidade de arquivos recalibrados por BEDTools e scripts perl/python internos.
6. Variantes de genótipo (SNVs e indels) de arquivos BAM recalibrados usando o modo de processamento de várias amostras da ferramenta HaplotypeCaller do GATK.
7. Use VQSR (recalibração do índice de qualidade variante) para reduzir os falsos positivos da chamada variante.
8. Anote SNVs e indels usando o software ANNOVAR21 em vários bancos de dados, incluindo o Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), o Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) e 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretar a patogenicidade das variantes de sequência de acordo com as diretrizes do ACMG.

4. Sequenciamento de Sanger

1. Realizar o sequenciamento de Sanger para confirmar possíveis variantes causativas e determinar a segregação de variantes na família usando um sequenciador ABI 3500²³.
2. Projetar sequências de iniciadores para a variante no gene MYH7 (NM_000257) da seguinte forma: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' e 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
3. Confirme uma variante, filtre todos os membros da família disponíveis para determinar a segregação da variante dentro da família²³.

5. Geração de ratos knockin C57BL/6N-MYH7^{em1 (G823E)}

1. Use o sistema CRISPR/Cas9 para gerar camundongos knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E ). O gene Myh7 do rato (número de adesão do GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) está localizado no cromossomo 14 do rato e tem 41 éxons. O códon de início ATG no éxon 4 e o códon de parada TAG no éxon 41, e o G823E está localizado no éxon 23. Selecione o éxon 23 como o site de destino.
2. Projetar a sequência do vetor de direcionamento de gRNA e do oligo doador (com sequência de segmentação, ladeada por sequências homólogas de 134 pb combinadas em ambos os lados).
   1. Faça login no site do NCBI e clique na função de design de primer online BLAST à direita.
   2. Clique na função Primer-BLAST na parte inferior da página para criar iniciadores.
   3. Cole o número de sequência de referência NCBI MYH7 NM_000257.4 na caixa de modelo de PCR.
   4. Amplifice o fragmento alvo (MYH7 cDNA exon 23 e seus éxons adjacentes) de modo a projetar o primer a montante no éxon 21 (2392-2528) e o primer a jusante no éxon 25 (3205-3350). Insira o número do éxon dos primers a montante e a jusante na caixa de intervalo correta.
   5. Clique no botão Obter Primers na parte inferior para gerar automaticamente vários pares de primers.
3. Insira o gene MYH7 no banco de dados ZFIN, introduza o local de mutação p.g823e (GGG para GAG) no oligonucleotídeo do doador e a mutação silenciosa p.r819 (AGG para CGA) no éxon 23. A mutação silenciosa impede a ligação e o recorte da sequência pelo gRNA após o reparo direcionado por homologia.
   1. Projete o gRNA de acordo com a sequência geral, as sequências em ambas as extremidades são TAATACGACTCACTATA- e -GTTTTAGAGCTA. O meio da sequência é o site de destino mencionado acima.
4. Co-injetar mRNA Cas9, gRNA gerado por transcrição in vitro e oligo doador em óvulos fertilizados para produção de camundongos KI.
   1. Use o kit de detecção de eficiência de alvo Cas9/gRNA para transcrever o alvo de gRNA projetado em gRNA in vitro e detectar a atividade do transcrito (consulte as instruções do kit VK007 para métodos de detecção específicos) de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Descongele os componentes do kit de mRNA T7 ARCA, misture e gire o pulso em uma microfuga para coletar soluções para o fundo dos tubos. Monte a reação à temperatura ambiente na seguinte ordem: 2x mistura ARCA/NTP a 10 μL, 1 μg de DNA modelo, 2 μL de mistura de RNA polimerase T7 e água livre de nuclease a 20 μL.
   3. Misture bem e pulse-spin em um microfuge. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   4. Remova o DNA molde adicionando 2 μL de DNase I, misture bem e incube a 37 °C por 15 min para obter mRNA.
   5. Realizar injeção intraperitoneal de gonadotrofina sérica e gonadotrofina coriônica humana em camundongos fêmeas C57BL/6 pré-preparados com cerca de 4 semanas de idade com uma seringa de 0,5 mL na dose de aproximadamente 5 U por camundongo com um intervalo entre as duas injeções de 48 h.
   6. Dezoito horas após a administração, sacrificar camundongos fêmeas C57BL/6 e um camundongo macho C57BL/6 de 8-12 semanas de idade por luxação cervical após injeção hormonal. Colete os óvulos e espermatozoides separadamente.
   7. O esperma é capacitado no fluido de capacitação. Pegue e solte o espermatozoide na borda do fluido nos óvulos de curta duração para fertilização in vitro por 3-4 h.
   8. Diluir o gRNA e o mRNA Cas9 transcritos com sucesso in vitro com água livre de RNase para 25 ng/μL e 50 ng/μL. Introduzir no citoplasma de ovos fertilizados de camundongos por microinjeção. Transplante de ovos fertilizados em boas condições para o oviduto aumentado das fêmeas de camundongos. Co-gaiola com ratos machos ligados.
5. Genótipo dos filhotes por PCR. Utilizar as seguintes condições de PCR: 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 35 s e 72 °C durante 35 s; 72 °C durante 5 min. Siga com a análise de sequência.
   1. Corte as caudas de ratos de 4 meses de idade com uma tesoura e coloque-as em um tubo EP de 1,5 mL. Adicionar 180 μL de tampão GL, 20 μL de proteinase K e 10 μL de RNase A por peça de cauda (2-5 mm) em um tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não cortar muito rabo.
   2. Incubar o tubo a 56 °C durante a noite.
   3. Gire em um tubo de microcentrífuga a 1.000 x g por 2 min para remover as impurezas.
   4. Adicionar 200 μL de Buffer GB e 200 μL de álcool etílico absoluto com mistura suficiente.
   5. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta. Aplicar a amostra no spin e na centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos. Descarte o fluxo.
   6. Adicionar 500 μL de Buffer WA à coluna de rotação e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
   7. Adicionar 700 μL de Buffer WB à coluna de rotação e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
      NOTA: Certifique-se de que o buffer WB foi pré-misturado com etanol a 100%. Ao adicionar Buffer WB, adicione à parede do tubo para lavar o sal residual.
   8. Repita a etapa 5.5.7.
   9. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta e centrifugar a 1.000 x g por 2 min.
   10. Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 50-200 μL de água esterilizada ou tampão de eluição ao centro da membrana da coluna e deixe a coluna repousar por 5 min.
       NOTA: O aquecimento de água esterilizada ou tampão de eluição até 65 °C pode aumentar o rendimento da eluição.
   11. Para eluír o DNA, centrifugar a coluna a 1.000 x g por 2 min. Para aumentar o rendimento de DNA, adicione o fluxo através e / ou 50-200 μL de água esterilizada ou tampão de eluição ao centro da membrana da coluna de spin e deixe a coluna repousar por 5 min. Centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
   12. Quantificar o DNA genômico eluído por eletroforese.

6. Avaliação da morfologia e função cardíaca

NOTA: Aplicar ecocardiografia em modo M para avaliar a morfologia cardíaca e a função de camundongos knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E ).

1. Coloque os ratos knockin em uma caixa de acrílico fechada conectada à máquina de anestesia e ajuste a interface de três vias para permitir que o isoflurano (concentração: 3%) flua para a caixa de acrílico. Depois que os ratos knockin pararem de se mover de forma autônoma, remova os ratos knockin.
2. Coloque os camundongos knockin na plataforma de monitoramento da vida útil da máquina de anestesia de pequenos animais e a anestesia inalatória contínua misturada com oxigênio (fluxo: 0,8 L/min) e isoflurano (concentração: 3%). Aplique lubrificante ocular nos ratos anestesiados para evitar a secagem da córnea.
3. Fixe os mouses knockin horizontalmente na plataforma. Incline a plataforma 30° caudal para o rato knockin. Remova o cabelo na parede torácica anterior do rato que bate usando um creme depilatório.
4. Posicione a sonda verticalmente com a protuberância voltada para a cabeça do animal. Em seguida, gire a sonda no sentido anti-horário, aproximadamente 45°.
5. Na visão paraesternal de eixo longo, gire a sonda 90° no sentido horário para observar a visão paraesternal de eixo curto. Depois de girar a sonda 90°, ajuste o deslocamento do eixo y para obter a fatia correta.
6. Observe a imagem de eixo longo do coração (Figura 1C) e selecione os dados de medição do modo M.
7. Adquirir dados de ultrassonografia de vistas paraesternais de eixo longo de camundongos (Figura 1). A frequência cardíaca (FC), a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), o débito cardíaco (CO), a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DSVE), a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DSVE), o septo interventricular (IVS) e a parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) são medidos.
8. Após a medição, forneça oxigênio aos ratos e coloque-os de volta em suas respectivas gaiolas quando recuperarem a atividade autônoma.

Resultados

Perfil clínico das famílias
Os pedigrees familiares da CMH foram obtidos e são apresentados na Figura 2. Todos os membros da família documentados foram diagnosticados com CMH no momento da inscrição.

Na família (Figura 2A), o probando foi o paciente III-7, que foi diagnosticado com CMH e obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo (VOTO) aos 46 anos e submetido a cirurgia cardíaca. O paciente III-3 tinha CMH menor ...

Discussão

Neste estudo, descrevemos uma família Han chinesa com CMH. A análise genética revelou que uma mutação heterozigótica MYH6 p.G823E co-segrega com a doença em membros da família com herança autossômica dominante. Para validar a patogenicidade da mutação G823E e discutir os mecanismos subjacentes, criamos um modelo de camundongo C57BL/6N com G823E no locus Myh7 do camundongo por engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9.

As características fenotípicas de camundongos knockin C57BL...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5×TBE	Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus)	Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose	Regu
Anesthesia machine for small animals	Reward Life Technology Co., Ltd.	R500
BEDTools		2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit	Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.	VK007
DNA Marker	Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer	Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.	DNAstable LD	prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome	Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.	HS-S7220-B
GATK		v3.5
Gentra Puregene blood kit	Santa Clara
Glass slide, coverslip	Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.	C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform	Illumina		perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin	Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin	Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane	Local suppliers		inhalation anesthesia
Microinjection microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000
Paraffin Embedding Machine	Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.	HS-B7126-B
Picard		(2.2.4) 20
Proteinase K	Merck KGaA
samtools		1.3
Sequencer	Applied Biosystems	ABI 3500
Stereomicroscope	Nikon	SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6	Agilent Technology Co., Ltd.		exome probe
T7 ARCA mRNA Kit	New England BioLabs, Inc.	NEB-E2065S
Temperature box	BINDER GmbH	KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution	Sigma, Merck KGaA	No. T2663
Veterinary ultrasound system	Royal Philips	CX50