JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בהתבסס על משפחת הקרדיומיופתיה התורשתית המשפחתית שנמצאה בעבודה הקלינית שלנו, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר באמצעות הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לאמת מוטציה זו.

Abstract

קרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית (HCM, OMIM: 613690) היא הקרדיומיופתיה הנפוצה ביותר בסין. עם זאת, האטיולוגיה הגנטית הבסיסית של HCM נותרה חמקמקה.

בעבר זיהינו גרסה הטרוזיגוטית של גן מיוזין כבד שרשרת 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), במשפחת האן סינית גדולה עם HCM. במשפחה זו, גרסה G823E cosegregates עם הפרעה אוטוזומלית דומיננטית. גרסה זו ממוקמת בתחום זרוע המנוף של אזור הצוואר של חלבון MYH7 ונשמרת מאוד בקרב מיוסינים ומינים הומולוגיים. כדי לאמת את הפתוגניות של גרסת G823E, ייצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם מוטציה נקודתית (G823E) בלוקוס MYH7 של העכבר עם הנדסת גנום בתיווך CRISPR/Cas9. עיצבנו וקטורים המכוונים ל-gRNA ולאוליגונוקלאוטידים של תורמים (עם רצפי מיקוד עם 134 bp של הומולוגיה). אתר p.G823E (GGG to GAG) באוליגונוקלאוטיד התורם הוכנס לאקסון 23 של MYH7 על ידי תיקון מכוון הומולוגיה. p.R819 מושתק (AGG ל-CGA) הוכנס גם הוא כדי למנוע קשירת gRNA וביקוע מחדש של הרצף לאחר תיקון מכוון הומולוגיה. אקוקרדיוגרפיה חשפה היפרטרופיה של דופן אחורית של החדר השמאלי (LVPW) עם סיסטולה בעכברי MYH7 G823E/- בגיל חודשיים. תוצאות אלה אומתו גם על ידי ניתוח היסטולוגי (איור 3).

תוצאות אלה מראות כי וריאנט G823E ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של HCM. הממצאים שלנו מעשירים את הספקטרום של וריאנטים MYH7 הקשורים ל- HCM משפחתי ועשויים לספק הדרכה לייעוץ גנטי ואבחון טרום לידתי במשפחה סינית זו.

Introduction

קרדיומיופתיה היפרטרופית (HCM, OMIM: 613690) היא הקרדיומיופתיה הנפוצה ביותר בסין, עם שכיחות מוערכת של 0.2%, המשפיעה על 150,000 אנשים 1,2.

התכונה האנטומית הפתולוגית המאפיינת את HCM היא היפרטרופיה חדרית אסימטרית, שלעתים קרובות מערבת את מערכת היציאה של החדר ו / או מחיצה בין-חדרית3. הביטוי הקליני הוא קוצר נשימה במאמץ, עייפות וכאבים בחזה. לפנוטיפ האינדיבידואלי של HCM יש שונות הנעה בין חתרני קלינית לאי ספיקת לב חמורה. חולים עם HCM זקוקים לטיפול רפואי, השתלת לב, ציוד תומך חיים ומעקב רב-תחומי4.

במאה האחרונה, טכנולוגיית PCR שינתה את האופן שבו אנו חוקרים דנ"א5. שיטת ריצוף DNA לאבחון קליני התגלתה על ידי סנגר ועמיתיו6. טכניקת סנגר יושמה לאחר מכן בפרויקט הגנום האנושי, אך גישה זו הייתה יקרה וגוזלת זמן7. הופעתו של ריצוף גנום שלם (WGS) הביאה את התובנות על מחלות גנטיות אנושיות לגבהים חדשים, אך היא נותרה אסורה מבחינת עלות. טכנולוגיית ריצוף אקסום שלם (WES) שימשה זה מכבר לאיתור גרסאות גרמלין8 והצליחה לזהות מוטציות של נהגים סומטיים באקסום של סוגי סרטן שונים9. ניתן להשתמש בזיהוי של אקסונים של דנ"א או אזורי קידוד על ידי WES כדי לחשוף גרסאות פתוגניות ברוב המחלות המנדליאניות. כיום, עם העלות הפוחתת של ריצוף, WGS צפוי להפוך לכלי חשוב בחקר הגנומיקה וניתן להשתמש בו באופן נרחב באיתור וריאנטים פתוגניים בגנום.

טכנולוגיית WES שימשה גם בקרדיומיופתיה תורשתית לזיהוי וריאנטים פתוגניים כדי להבהיר עוד יותר את האטיולוגיה. עדויות חדשות מצביעות על כך שגנים המקודדים מוטציות בגנים של חלבונים מבניים של סרקומרה, כגון MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 ו-TPM1 18 אחראים לאטיולוגיה הגנטית של HCM. מודעות לווריאנטים פתוגניים בגנים הגורמים למחלות נדירות (למשל, אובסקורין, קלמודולין ציטוסקטלי ו-RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, משחק אלפא 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, וחלבון עשיר בציסטאין וגליצין 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) נקשרה גם היא ל-HCM. מחקרים גנטיים עדכניים זיהו מספר גרסאות פתוגניות שונות בגן החלבון הסרקומרי בכ-40%-60% מחולי HCM, ובדיקות גנטיות בחולי HCM גילו כי רוב הווריאנטים הפתוגניים מתרחשים בשרשרת הכבדה של מיוזין (MYH7) ובחלבון קושר מיוזין C (MYBPC3). עם זאת, הבסיס הגנטי ל-HCM נותר חמקמק. חקירת הפתוגניות של וריאציות אלה העומדות בבסיס חולי HCM אנושיים נותרה אתגר גדול22.

במחקר זה אנו מדווחים על וריאנט פתוגני ב-MYH7 במשפחת האן הסינית עם HCM על ידי WES. על מנת לאמת את הפתוגניות של גרסה זו, הקמנו עכברי נוקין C57BL/6N-Myh7em1(G823E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. אנו דנים גם במנגנונים מתקבלים על הדעת של גרסה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ההיסטוריה של המשפחות הושגה על ידי ראיונות עם בני המשפחה. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המחוזי לרפואה סינית בגואנגדונג (מס '2019074). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל בני המשפחה. כל בעלי החיים מטופלים בהתאם להנחיות האתיות של בית החולים המחוזי לרפואה סינית גואנגדונג (גואנגג'ואו, סין).

1. נושאי הלימוד

הערה: הפרובנד III-3 ביקש ייעוץ רפואי במחלקה לניתוחי לב וכלי דם של בית החולים המחוזי לרפואה סינית בגואנגדונג ביולי 2019.

  1. קבל היסטוריה רפואית משפחתית מפורטת של הפרובנד. הודע והתקשר לכל בני המשפחה של הפרובנד. כל בני המשפחה עברו בדיקות גופניות קפדניות.
    1. בצע סקירה שיטתית של כל הנתונים הקליניים, כולל רשומות רפואיות, א.ק.ג., אקו-לב ודוחות צנתור לב.
    2. אשר מחדש פנוטיפים לבביים בכל החולים במהלך התערבות או ניתוח.
  2. בחר בסך הכל 174 פקדים בריאים מבוססי אוכלוסייה ממסד הנתונים המקומי. לאסוף כ 4.0 מ"ל של דם ורידי היקפי מכל חולה.

2. מיצוי דנ"א

הערה: דנ"א מופק עם ערכת דם מסחרית בהתאם להוראות היצרן.

  1. Lyse תאי דם עם דטרגנט אניוני בנוכחות מייצב DNA בהתאם לפרוטוקול של היצרן.
  2. הוסף 10 μL של RNase A תמיסה לתזאט התא ומערבב על ידי היפוך הצינור 25 פעמים. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד שעה.
  3. הסר חלבונים על ידי משקעי מלח. השתמש בתמיסת משקעי חלבון (0.25 מ"ג של אלבומין בסרום בקר מומס ב -25 מ"ל של מים מזוקקים) ו 100% איזופרופנול כדי לזרז חלבונים. לאחר מכן, השתמש ב-200 μL של 70% אתנול ובצע צנטריפוגה ב-12,000 x g/min ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לשטוף את גלולת הדנ"א.
  4. לשחזר את הדנ"א הגנומי על ידי משקעים עם 500 μL של 70% אתנול. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 30 שניות. יש לשאוף ולאחר מכן להמיס את הכדור בתמיסת הידרציה (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7.5).
  5. השתמש בספקטרופוטומטר (לדוגמה, NanoDrop 2000) כדי לקבוע טוהר. לדנ"א מטוהר יש בדרך כלל יחס A260/A280 בין 1.7 ל-1.9 וגודלו עד 200 קילובייט.
  6. אחסן את הדנ"א לטווח ארוך בטמפרטורה של 2-8, -20 או -80 מעלות צלזיוס.

3. ריצוף אקסום שלם וניתוח וריאנטים

הערה: כדי לחפש באופן שיטתי מוטציות גנטיות הגורמות למחלות, בוצע ריצוף אקסום באנשים מושפעים (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 ו- IV-3) ובאנשים לא מושפעים (III-2, III-5, IV-4).

  1. השתמש בבדיקת exome בהתאם להוראות היצרן כדי לבצע את לכידת האקסום.
  2. החל את הספריות המאושרות על רצף זוגי של 2 × 150 bp בפלטפורמת HiSeq X-ten. ראה קובץ משלים 1.
  3. יישר קבצי FASTQ לגנום הייחוס האנושי (hg19/GRCh37) עם BWA v0.7.1318,19. מיין את הקבצים המיושרים (קבצים בפורמט sam/bam) עם samtools ולאחר מכן סמן כפילויות באמצעות Picard. ראה קובץ משלים 1.
  4. השתמש ב- GATK, יישר מחדש את הקריאות באופן מקומי וכייל מחדש את איכויות הבסיס. ראה קובץ משלים 1.
  5. צור סטטיסטיקות מיפוי הכוללות כיסוי ועומק מקבצים מכוילים מחדש על ידי BEDTools וסקריפטים פנימיים של perl/python.
  6. גרסאות גנוטיפ (SNVs ו- indels) מקבצי BAM מכוילים מחדש באמצעות מצב העיבוד מרובה הדגימות של הכלי HaplotypeCaller מ- GATK.
  7. השתמש ב-VQSR (כיול מחדש של ציוני איכות הווריאנטים) כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות של קריאות וריאנטים.
  8. הוסף ביאורים ל-SNVs ול-indels באמצעות תוכנת ANNOVAR21 כנגד מסדי נתונים מרובים, כולל קונסורציום הצבירה של Exome (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), פרויקט הריצוף של Exome (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) ו-1,000 G (http://www.1000genomes.org). לפרש את הפתוגניות של גרסאות הרצף על פי הנחיות ACMG.

4. רצף סנגר

  1. בצע ריצוף סנגר כדי לאשר וריאנטים סיבתיים פוטנציאליים ולקבוע הפרדת משתנים במשפחה באמצעות רצף ABI 350023.
  2. תכנן רצפי פריימר עבור הווריאנט בגן MYH7 (NM_000257) כדלקמן: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' ו-5'- CGGACTTCTCTCTCGCCTCTT -3'.
  3. אשר וריאנט, סנן את כל בני המשפחה הזמינים כדי לקבוע את הפרדת הווריאנטים בתוך המשפחה23.

5. דור של עכברי C57BL/6N-MYH7em1(G823E)

  1. השתמש במערכת CRISPR/Cas9 כדי ליצור עכברי C57BL/6N-Myh7em1(G823E). הגן Myh7 של העכבר (מספר ההצטרפות של GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) ממוקם על כרומוזום 14 של עכבר ויש לו 41 אקסונים. קודון ההתחלה ATG באקסון 4 וקודון עצירת TAG באקסון 41, וה- G823E ממוקם באקסון 23. בחר את exon 23 כאתר היעד.
  2. תכנן את הרצף של וקטור מיקוד gRNA ואוליגו תורם (עם רצף מיקוד, מוקף על ידי 134 bp רצפים הומולוגיים משולבים משני הצדדים).
    1. היכנס לאתר NCBI ולחץ על פונקציית עיצוב הפריימר המקוונת של BLAST מימין.
    2. לחץ על פונקציית Primer-BLAST בתחתית הדף כדי לעצב פריימרים.
    3. הדבק את מספר רצף ההפניות MYH7 NCBI NM_000257.4 בתיבת תבנית ה-PCR.
    4. הגבירו את מקטע המטרה (MYH7 cDNA exon 23 והאקסונים הסמוכים לו) לכן תכננו את הפריימר במעלה הזרם באקסון 21 (2392-2528) ואת הפריימר במורד הזרם באקסון 25 (3205-3350). הזן את מספר האקסון של הפריימרים במעלה ובמורד הזרם בתיבת הטווח הימנית.
    5. לחץ על הלחצן קבל פריימרים בתחתית כדי ליצור באופן אוטומטי זוגות מרובים של פריימרים .
  3. הזן את הגן MYH7 למסד הנתונים של ZFIN, הכנס את אתר המוטציה p.g823e (GGG to GAG) באוליגונוקלאוטיד התורם ואת המוטציה השקטה p.r819 (AGG עד CGA) לאקסון 23. המוטציה השקטה מונעת קשירה וחיתוך מחדש של הרצף על ידי gRNA לאחר תיקון מכוון הומולוגיה.
    1. תכנון gRNA על פי הרצף הכללי, הרצפים בשני הקצוות הם TAATACGACTCACTATA- ו-GTTTTAGAGCTA. אמצע הרצף הוא אתר היעד שהוזכר לעיל.
  4. הזרקה משותפת של Cas9 mRNA, gRNA שנוצר על ידי שעתוק חוץ גופי ואוליגו תורם לביציות מופרות לייצור עכברי KI.
    1. השתמש בערכת זיהוי יעילות היעד Cas9/gRNA כדי לתמלל את יעד ה-gRNA המתוכנן ל-gRNA במבחנה ולזהות את פעילות התעתיק (עיין בהוראות ערכת VK007 לשיטות זיהוי ספציפיות) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    2. הפשירו את רכיבי ערכת ה-mRNA T7 ARCA, ערבבו וסובבו פולסים במיקרופוגה כדי לאסוף תמיסות לתחתית הצינורות. הרכיבו את התגובה בטמפרטורת החדר בסדר הבא: 2x תערובת ARCA/NTP ל-10 μL, 1 מיקרוגרם דנ"א של תבנית, 2 μL של תערובת T7 RNA פולימראז, ומים נטולי נוקלאז ל-20 μL.
    3. מערבבים היטב ומסובבים את הדופק במיקרופוגה. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות.
    4. הסר את הדנ"א של התבנית על ידי הוספת 2 μL של DNase I, ערבב היטב, ודגרה ב 37 °C במשך 15 דקות כדי לקבל mRNA.
    5. בצע הזרקה תוך-צפקית של גונדוטרופין בסרום וגונדוטרופין כוריוני אנושי לתוך נקבות C57BL/6 מוכנות מראש בגיל 4 שבועות בערך עם מזרק של 0.5 מ"ל במינון של כ-5 U לעכבר עם מרווח בין שתי הזריקות של 48 שעות.
    6. שמונה עשרה שעות לאחר המינון, יש להקריב C57BL/6 עכברים נקבות ועכבר זכר C57BL/6 אחד בן 8-12 שבועות על ידי נקע צוואר הרחם לאחר הזרקת הורמונים. לאסוף את הביציות והזרע בנפרד.
    7. הזרע הוא קיבולי בנוזל הקיבול . קח ושחרר את הזרע בקצה הנוזל לתוך תאי הביצית קצרי הימים להפריה חוץ גופית למשך 3-4 שעות.
    8. דלל את ה-gRNA וה-Cas9 mRNA במבחנה שהועתקו בהצלחה עם מים נטולי RNase ל-25 ng/μL ו-50 ng/μL. הכנס לתוך הציטופלסמה של ביציות מופרות עכבר על ידי מיקרו הזרקה. השתלת ביציות מופרות במצב טוב לתוך oviduct מוגדל של נקבת העכברים. כלוב משותף עם עכברים זכרים קשורים.
  5. גנוטיפ הגורים על ידי PCR. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: 94 °C למשך 3 דקות, 35 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות, 60 °C למשך 35 שניות ו- 72 °C למשך 35 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. המשך עם ניתוח רצף.
    1. חותכים את הזנבות של עכברים בני 4 חודשים עם מספריים ומניחים אותם לתוך צינור EP של 1.5 מ"ל. הוסף 180 μL של Buffer GL, 20 μL של פרוטאינאז K, ו-10 μL של RNase A לכל חתיכת זנב (2-5 מ"מ) בצינור מיקרוצנטריפוגה. היזהר לא לחתוך יותר מדי זנב.
    2. לדגום את הצינור ב 56 מעלות צלזיוס לילה.
    3. סובב בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם למשך 2 דקות כדי להסיר זיהומים.
    4. הוסף 200 μL של Buffer GB ו- 200 μL של אלכוהול אתילי מוחלט עם ערבוב מספיק.
    5. מניחים את עמודת הסיבוב בצינור איסוף. החל את הדגימה על הספין והצנטריפוגה בגודל 1,000 x g למשך 2 דקות. בטל את הזרימה.
    6. הוסף 500 μL של Buffer WA לעמוד הספין וצנטריפוגה ב- 1,000 x g למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
    7. הוסף 700 μL של Buffer WB לעמוד הספין וצנטריפוגה ב- 1,000 x g למשך דקה אחת. בטל את הזרימה.
      הערה: ודא שה-Buffer WB עורבב מראש עם 100% אתנול. בעת הוספת Buffer WB, יש להוסיף לדופן הצינור כדי לשטוף את שאריות המלח.
    8. חזור על שלב 5.5.7.
    9. מניחים את עמוד הספין בצינור איסוף וצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם למשך 2 דקות.
    10. מקם את עמודת הספין בצינור חדש של 1.5 מ"ל. הוסיפו 50-200 μL של מים מעוקרים או חיץ אלוציוני למרכז קרום העמוד ותנו לעמוד במשך 5 דקות.
      הערה: חימום מים מעוקרים או חיץ מעוקר עד 65 מעלות צלזיוס יכול להגדיל את תפוקת ההארה.
    11. כדי לרומם את הדנ"א, צנטריפוגה של העמודה ב-1,000 x g למשך 2 דקות. כדי להגדיל את תפוקת הדנ"א, הוסיפו את הזרימה ו/או 50-200 μL של מים מעוקרים או חיץ אלוטיון למרכז קרום עמוד הספין ותנו לעמוד במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות.
    12. לכמת את הדנ"א הגנומי המלוטש על ידי אלקטרופורזה.

6. הערכת המורפולוגיה והתפקוד הלבביים

הערה: החל אקוקרדיוגרפיה במצב M כדי להעריך את המורפולוגיה והתפקוד של עכברי C57BL/6N-Myh7em1(G823E) של הלב.

  1. הכניסו את עכברי הנוקין לקופסת אקריליק סגורה המחוברת למכונת ההרדמה והתאימו את הממשק התלת-כיווני כדי לאפשר לאיזופלורן (ריכוז: 3%) לזרום לתוך קופסת האקריליק. לאחר שעכברי הנוקין מפסיקים לנוע באופן אוטונומי, הסר את עכברי הנוקין.
  2. הניחו את עכברי הנוקין שטוחים על פלטפורמת ניטור החיים של מכונת ההרדמה של בעלי חיים קטנים, והרדמה בשאיפה מתמשכת מעורבבת עם חמצן (זרימה: 0.8 ליטר לדקה) ואיזופלורן (ריכוז: 3%). יש למרוח חומר סיכה לעיניים על העכברים המורדים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
  3. תקן את עכברי הנוקין אופקית על הרציף. הטה את הפלטפורמה בזווית של 30° לעכבר הנוק-אין. הסר שיער על דופן החזה הקדמית של העכבר דופק באמצעות קרם depilatory.
  4. מקם את הבדיקה אנכית כאשר הבליטה פונה לראש החיה. לאחר מכן, סובב את הבדיקה נגד כיוון השעון, בערך 45°.
  5. בתצוגת הציר הארוך הפאראסטרנלי, סובב את הגשושית ב-90° בכיוון השעון כדי לצפות בתצוגת הציר הקצר הפאראסטרנלית. לאחר סיבוב הבדיקה ב-90°, התאימו את תזוזת ציר ה-y כדי לקבל את הפרוסה הנכונה.
  6. שימו לב לתמונת הציר הארוך של הלב (איור 1C), ולאחר מכן בחרו נתוני מדידה במצב M.
  7. קבל נתוני אולטרסאונד מתצוגות פאראסטרנליות ארוכות צירים של עכברים (איור 1). מדידת דופק (HR), שבר פליטה של חדר שמאל (LVEF), תפוקת לב (CO), ממד אנד-דיאסטולי של חדר שמאל (LVDd), ממד סופי של החדר השמאלי (LVSd), מחיצה בין-חדרית (IVS) ודופן אחורית של החדר השמאלי (LVPW).
  8. לאחר המדידה, ספקו לעכברים חמצן, והחזירו אותם לכלובים שלהם כשהם יחזרו לפעילות אוטונומית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרופיל קליני של המשפחות
אילן היוחסין המשפחתי של HCM התקבלו והם מוצגים באיור 2. כל בני המשפחה המתועדים אובחנו עם HCM בעת ההרשמה.

במשפחה (איור 2A), הפרובנד היה חולה III-7, שאובחן עם HCM וחסימת דרכי היציאה של החדר השמאלי (LVOTO) בגיל 46 ועבר ניתוח לב. לחולה III-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה אנו מתארים משפחה סינית אחת של בני האן עם HCM. ניתוח גנטי גילה כי מוטציה הטרוזיגוטית MYH6 p.G823E מפרידה יחד עם המחלה אצל בני משפחה עם תורשה אוטוזומלית דומיננטית. כדי לאמת את הפתוגניות של מוטציית G823E ולדון במנגנונים הבסיסיים, יצרנו מודל עכבר C57BL/6N עם G823E בלוקוס Myh7 של עכבר על ידי הנדסת גנום בת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים כספיים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט קרן המחקר הרפואי של מחוז גואנגדונג (A2022363) והפרויקט הגדול של ועדת גואנגדונג למדע וטכנולוגיה, סין (מענק מס '2022).

ברצוננו להודות לצ'ינגג'יאן צ'ן מאוניברסיטת מרילנד, קולג ' פארק על העזרה במהלך הכנת כתב יד זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5×TBEShanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus)Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
AgaroseRegu
Anesthesia machine for small animalsReward Life Technology Co., Ltd.R500
BEDTools2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kitViewsolid Biotechnology Co., Ltd.VK007
DNA MarkerThermo Fisher Scientific
DNA stabilizerShanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.DNAstable LDprevent DNA degradation
Electric paraffin microtomeShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-S7220-B
GATKv3.5
Gentra Puregene blood kitSanta Clara
Glass slide, coverslipJiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solutionShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platformIlluminaperform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropinLivzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropinLivzon Pharmaceutical Group Inc.
IsofluraneLocal suppliersinhalation anesthesia
Microinjection microscopeNikonECLIPSE Ts2
NanoDropThermo Fisher Scientific2000
Paraffin Embedding MachineShenyang Hengsong Technology Co., Ltd.HS-B7126-B
Picard(2.2.4) 20
Proteinase KMerck KGaA
samtools1.3
SequencerApplied BiosystemsABI 3500
StereomicroscopeNikonSMZ745T
SureSelect Human All Exon V6Agilent Technology Co., Ltd.exome probe
T7 ARCA mRNA KitNew England BioLabs, Inc.NEB-E2065S
Temperature boxBINDER GmbHKBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride SolutionSigma, Merck KGaANo. T2663
Veterinary ultrasound systemRoyal PhilipsCX50

References

  1. Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
  2. Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
  3. Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
  4. Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
  5. Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
  6. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  7. Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
  8. Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
  9. Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
  10. Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
  11. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).
  12. Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
  13. Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
  14. Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
  15. McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473(2020).
  16. Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
  17. Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
  18. Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
  19. Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478(2020).
  20. Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  21. Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079(2020).
  22. Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878(2019).
  23. Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
  24. Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
  25. Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
  26. Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
  27. Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
  28. Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974(2015).
  29. García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
  30. Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
  31. Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved