Studio della patogenesi della mutazione MYH7 Gly823Glu nella cardiomiopatia ipertrofica familiare utilizzando un modello murino

Riepilogo

Sulla base della famiglia di cardiomiopatie ereditarie familiari trovata nel nostro lavoro clinico, abbiamo creato un modello murino C57BL / 6N con una mutazione puntiforme (G823E) nel locus MYH7 del topo attraverso l'ingegneria del genoma mediata da CRISPR / Cas9 per verificare questa mutazione.

Abstract

La cardiomiopatia ipertrofica familiare (HCM, OMIM: 613690) è la cardiomiopatia più comune in Cina. Tuttavia, l'eziologia genetica sottostante della CMI rimane elusiva.

Abbiamo precedentemente identificato una variante eterozigote del gene della miosina a catena pesante 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), in una grande famiglia Han cinese con HCM. In questa famiglia, la variante G823E cosegrega con una malattia autosomica dominante. Questa variante si trova nel dominio del braccio di leva della regione del collo della proteina MYH7 ed è altamente conservata tra le miosine e le specie omologhe. Per verificare la patogenicità della variante G823E, abbiamo prodotto un modello murino C57BL/6N con una mutazione puntiforme (G823E) nel locus del topo MYH7 con ingegneria genomica mediata da CRISPR / Cas9. Abbiamo progettato vettori bersaglio del gRNA e oligonucleotidi del donatore (con sequenze di targeting affiancate da 134 bp di omologia). Il sito p.G823E (da GGG a GAG) nell'oligonucleotide donatore è stato introdotto nell'esone 23 di MYH7 mediante riparazione diretta dall'omologia. È stato anche inserito un p.R819 silenziato (da AGG a CGA) per prevenire il legame del gRNA e la ri-scissione della sequenza dopo la riparazione diretta dall'omologia. L'ecocardiografia ha rivelato ipertrofia della parete posteriore ventricolare sinistra (LVPW) con sistole nei topi MYH7 G823E/- a 2 mesi di età. Anche questi risultati sono stati convalidati dall'analisi istologica (Figura 3).

Questi risultati dimostrano che la variante G823E svolge un ruolo importante nella patogenesi dell'HCM. I nostri risultati arricchiscono lo spettro delle varianti di MYH7 legate alla CMI familiare e possono fornire una guida per la consulenza genetica e la diagnosi prenatale in questa famiglia cinese.

Introduzione

La cardiomiopatia ipertrofica (HCM, OMIM: 613690) è la cardiomiopatia più comune in Cina, con un'incidenza stimata dello 0,2%, che colpisce 150.000 persone ^1,2.

La caratteristica anatomica patologica che caratterizza la CMI è l'ipertrofia ventricolare asimmetrica, che spesso coinvolge il tratto di efflusso ventricolare e/o il setto interventricolare³. La manifestazione clinica è dispnea da sforzo, affaticamento e dolore toracico. Il fenotipo individuale della CMI ha una variabilità che varia da clinicamente insidiosa a grave insufficienza cardiaca. I pazienti con CMI richiedono cure mediche, trapianto di cuore, attrezzature di supporto vitale e follow-up multidisciplinare⁴.

Nel secolo scorso, la tecnologia PCR ha cambiato il modo in cui studiamo il DNA⁵. Un metodo di sequenziamento del DNA per la diagnosi clinica è stato scoperto da Sanger e colleghi⁶. La tecnica Sanger è stata successivamente applicata al Progetto Genoma Umano, ma questo approccio è stato costoso e dispendioso in termini di tempo⁷. L'avvento del sequenziamento dell'intero genoma (WGS) ha portato le conoscenze sulle malattie genetiche umane a nuovi livelli, ma è rimasto proibitivo in termini di costi. La tecnologia di sequenziamento dell'intero esoma (WES) è stata a lungo utilizzata per rilevare le varianti germinali⁸ e ha avuto successo nell'identificare le mutazioni somatiche del driver nell'esoma di vari tumori⁹. La rilevazione di esoni di DNA o regioni codificanti mediante WES può essere utilizzata per rivelare varianti patogene nella maggior parte delle malattie mendeliane. Oggi, con la diminuzione del costo del sequenziamento, WGS dovrebbe diventare uno strumento importante nella ricerca genomica e può essere ampiamente utilizzato nella rilevazione di varianti patogene nel genoma.

La tecnologia WES è stata utilizzata anche nella cardiomiopatia ereditaria per identificare varianti patogene per chiarire ulteriormente l'eziologia. Prove emergenti hanno implicato che i geni che codificano le mutazioni genetiche della proteina strutturale del sarcomero, come MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3¹⁴, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 e^{TPM1 18} sono responsabili dell'eziologia genetica dell'HCM. La consapevolezza di varianti patogene in geni che causano malattie rare (ad esempio, oscurantina, calmodulina citoscheletrica e RhoGEF INTERAGENTE CON TITINA (OBSCN, OMIM: 608616)¹⁹, alfa 2 che agisce (ACTN2, OMIM: 102573)²⁰ e proteina ricca di cisteina e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)²¹) è stata anche associata all'HCM. Gli attuali studi genetici hanno identificato più varianti patogene distinte nel gene della proteina sarcomerica in circa il 40% -60% dei pazienti con HCM, e test genetici in pazienti con HCM hanno rivelato che la maggior parte delle varianti patogene si verificano nella catena pesante della miosina (MYH7) e nella proteina C legante la miosina (MYBPC3). Tuttavia, la base genetica per HCM rimane elusiva. Esplorare la patogenicità di queste variazioni che sono alla base dei pazienti umani con HCM rimane una grande sfida²².

In questo studio, riportiamo una variante patogena in MYH7 in una famiglia Han cinese con HCM di WES. Al fine di verificare la patogenicità di questa variante, abbiamo stabilito un topo knockin C57BL / 6N-Myh7^{em1 (G823E)} utilizzando il sistema CRISPR / Cas9. Discutiamo anche i meccanismi plausibili di questa variante.

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Protocollo

Le storie delle famiglie sono state ottenute intervistando i membri della famiglia. Lo studio è stato approvato dal Comitato etico dell'ospedale provinciale di medicina cinese del Guangdong (n. 2019074). Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i membri della famiglia. Tutti gli animali sono trattati in conformità con le linee guida etiche dell'Ospedale provinciale di medicina cinese del Guangdong (Guangzhou, Cina).

1. Materie di studio

NOTA: Il probando III-3 ha richiesto un parere medico nel Dipartimento di Chirurgia Cardiovascolare dell'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del Guangdong nel luglio 2019.

1. Ottenere una storia medica familiare dettagliata del probando. Avvisa e chiama tutti i membri della famiglia del probando. Tutti i membri della famiglia sono stati sottoposti a meticolosi esami fisici.
   1. Eseguire una revisione sistematica di tutti i dati clinici, tra cui cartelle cliniche, ECG, ecocardiogrammi e referti di cateterismo cardiaco.
   2. Riconfermare i fenotipi cardiaci in tutti i pazienti durante l'intervento o l'intervento chirurgico.
2. Selezionare un totale di 174 controlli integri basati sulla popolazione dal database locale. Raccogliere circa 4,0 ml di sangue venoso periferico da ciascun paziente.

2. Estrazione del DNA

NOTA: Il DNA viene estratto con un kit di sangue commerciale secondo le istruzioni del produttore.

1. Lisare le cellule del sangue con un detergente anionico in presenza di uno stabilizzatore del DNA seguendo il protocollo del produttore.
2. Aggiungere 10 μL di soluzione di RNasi A al lisato cellulare e mescolare capovolgendo il tubo 25 volte. Incubare a 37 °C per 15 minuti a 1 ora.
3. Rimuovere le proteine con la precipitazione del sale. Utilizzare una soluzione di precipitazione proteica (0,25 mg di albumina sierica bovina disciolta in 25 ml di acqua distillata) e isopropanolo al 100% per precipitare le proteine. Quindi, utilizzare 200 μL di etanolo al 70% ed eseguire la centrifugazione a 12.000 x g / min a 4 ° C per 15 minuti per lavare il pellet di DNA.
4. Recuperare il DNA genomico per precipitazione con 500 μL di etanolo al 70%. Centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Aspirare e quindi sciogliere il pellet in soluzione di idratazione (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
5. Utilizzare uno spettrofotometro (ad esempio, NanoDrop 2000) per determinare la purezza. Il DNA purificato ha tipicamente un rapporto A260/A280 tra 1,7 e 1,9 e ha una dimensione massima di 200 kb.
6. Conservare il DNA per un lungo periodo a 2-8, -20 o -80 °C.

3. Sequenziamento dell'intero esoma e analisi delle varianti

NOTA: Per cercare sistematicamente mutazioni genetiche che causano malattie, è stato eseguito il sequenziamento dell'esoma in individui affetti (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 e IV-3) e individui non affetti (III-2, III-5, IV-4).

1. Utilizzare la sonda dell'esoma secondo le istruzioni del produttore per eseguire l'acquisizione dell'esoma.
2. Applica le librerie qualificate al sequenziamento paired-end a 2 × 150 bp sulla piattaforma HiSeq X-ten. Si prega di consultare il file supplementare 1.
3. Allineare i file FASTQ al genoma di riferimento umano (hg19/GRCh37) con BWA v0.7.1318,19. Ordina i file allineati (file in formato sam/bam) con samtools, quindi contrassegna i duplicati usando Picard. Si prega di consultare il file supplementare 1.
4. Utilizzare GATK, riallineare le letture localmente e ricalibrare le qualità di base. Si prega di consultare il file supplementare 1.
5. Genera statistiche di mappatura che includono copertura e profondità dai file ricalibrati da BEDTools e script perl/python interni.
6. Varianti del genotipo (SNV e indel) da file BAM ricalibrati utilizzando la modalità di elaborazione multi-campione dello strumento HaplotypeCaller di GATK.
7. Utilizzare VQSR (variant quality score recalibration) per ridurre i falsi positivi delle chiamate alle varianti.
8. Annotare SNV e indels utilizzando il software ANNOVAR21 su più database, tra cui Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) e 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretare la patogenicità delle varianti di sequenza secondo le linee guida ACMG.

4. Sequenziamento con metodo Sanger

1. Eseguire il sequenziamento Sanger per confermare potenziali varianti causative e determinare la segregazione delle varianti nella famiglia utilizzando un sequenziatore ABI 3500²³.
2. Progettare sequenze di primer per la variante nel gene MYH7 (NM_000257) come segue: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' e 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
3. Confermare una variante, esaminare tutti i membri della famiglia disponibili per determinare la segregazione delle varianti all'interno della famiglia²³.

5. Generazione di topi knockin C57BL / 6N-MYH7^{em1 (G823E)}

1. Utilizzare il sistema CRISPR / Cas9 per generare topi knockin C57BL / 6N-Myh7^{em1 (G823E).} Il gene Myh7 del topo (numero di adesione GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) si trova sul cromosoma 14 del topo e ha 41 esoni. Il codone di partenza ATG nell'esone 4 e il codone di arresto TAG nell'esone 41, e il G823E si trova sull'esone 23. Selezionare l'esone 23 come sito di destinazione.
2. Progettare la sequenza del vettore bersaglio del gRNA e dell'oligo donatore (con sequenza di targeting, affiancata da sequenze omologhe a 134 bp combinate su entrambi i lati).
   1. Accedi al sito Web NCBI e fai clic sulla funzione di progettazione del primer online BLAST sulla destra.
   2. Fare clic sulla funzione Primer-BLAST nella parte inferiore della pagina per progettare i primer.
   3. Incollare il numero di sequenza di riferimento NCBI MYH7 NM_000257.4 nella casella del modello PCR.
   4. Amplificare il frammento bersaglio (MYH7 cDNA esone 23 e i suoi esoni adiacenti) in modo da progettare il primer a monte sull'esone 21 (2392-2528) e il primer a valle sull'esone 25 (3205-3350). Immettere il numero dell'esone dei primer a monte e a valle nella casella dell'intervallo a destra.
   5. Fare clic sul pulsante Ottieni primer in basso per generare automaticamente più coppie di primer .
3. Inserire il gene MYH7 nel database ZFIN, introdurre il sito di mutazione p.g823e (da GGG a GAG) nell'oligonucleotide del donatore e la mutazione silente p.r819 (AGG a CGA) nell'esone 23. La mutazione silenziosa impedisce il legame e il ritaglio della sequenza da parte del gRNA dopo la riparazione diretta dall'omologia.
   1. Progetta gRNA secondo la sequenza generale, le sequenze ad entrambe le estremità sono TAATACGACTCACTATA- e -GTTTTAGAGCTA. Il centro della sequenza è il sito di destinazione menzionato sopra.
4. Co-iniettare Cas9 mRNA, gRNA generato dalla trascrizione in vitro e oligo donatore in uova fecondate per la produzione di topi KI.
   1. Utilizzare il kit di rilevamento dell'efficienza del target Cas9/gRNA per trascrivere il bersaglio gRNA progettato in gRNA in vitro e rilevare l'attività del trascritto (vedere le istruzioni del kit VK007 per metodi di rilevamento specifici) secondo il protocollo del produttore.
   2. Scongelare i componenti del kit di mRNA T7 ARCA, mescolare e spingere l'impulso in un microfuge per raccogliere soluzioni sul fondo dei tubi. Assemblare la reazione a temperatura ambiente nel seguente ordine: 2x miscela ARCA/NTP a 10 μL, 1 μg di DNA modello, 2 μL di miscela di T7 RNA polimerasi e acqua priva di nucleasi a 20 μL.
   3. Mescolare accuratamente e centrifugare a impulsi in un microfuge. Incubare a 37 °C per 30 min.
   4. Rimuovere il DNA modello aggiungendo 2 μL di DNasi I, mescolare bene e incubare a 37 °C per 15 minuti per ottenere mRNA.
   5. Eseguire l'iniezione intraperitoneale di gonadotropina sierica e gonadotropina corionica umana in topi femmina C57BL/6 pre-preparati a circa 4 settimane di età con una siringa da 0,5 ml alla dose di circa 5 U per topo con un intervallo tra le due iniezioni di 48 ore.
   6. Diciotto ore dopo la somministrazione, sacrificare topi femmina C57BL/6 e un topo maschio C57BL/6 di 8-12 settimane mediante lussazione cervicale dopo iniezione ormonale. Raccogli le uova e lo sperma separatamente.
   7. Lo sperma è capacitato nel fluido capacitativo. Prendi e rilascia lo sperma sul bordo del fluido nelle cellule uovo di breve durata per la fecondazione in vitro per 3-4 ore.
   8. Diluire il gRNA trascritto con successo e l'mRNA Cas9 in vitro con acqua priva di RNasi a 25 ng/μL e 50 ng/μL. Introdurre nel citoplasma delle uova fecondate di topo mediante microiniezione. Trapiantare le uova fecondate in buone condizioni nell'ovidotto allargato dei topi femmina. Co-gabbia con topi maschi legati.
5. Genotipizzare i cuccioli mediante PCR. Utilizzare le seguenti condizioni PCR: 94 °C per 3 min, 35 cicli di 94 °C per 30 s, 60 °C per 35 s e 72 °C per 35 s; 72 °C per 5 min. Seguire con l'analisi della sequenza.
   1. Tagliare le code dei topi di 4 mesi con le forbici e metterle in un tubo EP da 1,5 ml. Aggiungere 180 μL di tampone GL, 20 μL di proteinasi K e 10 μL di RNasi A per pezzo di coda (2-5 mm) in una provetta da microcentrifuga. Fai attenzione a non tagliare troppa coda.
   2. Incubare il tubo a 56 °C durante la notte.
   3. Girare in un tubo di microcentrifuga a 1.000 x g per 2 minuti per rimuovere le impurità.
   4. Aggiungere 200 μL di Buffer GB e 200 μL di alcol etilico assoluto con una miscelazione sufficiente.
   5. Posizionate la colonna di rotazione in un tubo di raccolta. Applicare il campione allo spin e centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti. Eliminare il flusso in corso.
   6. Aggiungere 500 μL di Buffer WA alla colonna di centrifuga e centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto. Eliminare il flusso in corso.
   7. Aggiungere 700 μL di Buffer WB alla colonna di centrifuga e centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto. Eliminare il flusso in corso.
      NOTA: assicurarsi che il Buffer WB sia stato premiscelato con etanolo al 100%. Quando si aggiunge Buffer WB, aggiungere alla parete del tubo per lavare via il sale residuo.
   8. Ripetere il passaggio 5.5.7.
   9. Posizionare la colonna di centrifuga in un tubo di raccolta e centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti.
   10. Posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo da 1,5 ml. Aggiungere 50-200 μL di acqua sterilizzata o tampone di eluizione al centro della membrana della colonna e lasciare riposare la colonna per 5 minuti.
       NOTA: Il riscaldamento di acqua sterilizzata o tampone di eluizione fino a 65 °C può aumentare la resa di eluizione.
   11. Per eluire il DNA, centrifugare la colonna a 1.000 x g per 2 minuti. Per aumentare la resa del DNA, aggiungere il flusso continuo e/o 50-200 μL di acqua sterilizzata o tampone di eluizione al centro della membrana della colonna di spin e lasciare riposare la colonna per 5 minuti. Centrifugare a 1.000 x g per 2 min.
   12. Quantificare il DNA genomico eluito mediante elettroforesi.

6. Valutazione della morfologia e della funzione cardiaca

NOTA: Applicare l'ecocardiografia M-mode per valutare la morfologia e la funzione cardiaca dei topi knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E).

1. Mettere i topi knockin in una scatola acrilica chiusa collegata alla macchina per anestesia e regolare l'interfaccia a tre vie per consentire all'isoflurano (concentrazione: 3%) di fluire nella scatola acrilica. Dopo che i topi knockin cessano di muoversi autonomamente, rimuovere i topi knockin.
2. Posizionare i topi knockin sulla piattaforma di monitoraggio della vita della macchina per l'anestesia di piccoli animali e l'anestesia continua per inalazione miscelata con ossigeno (flusso: 0,8 L / min) e isoflurano (concentrazione: 3%). Applicare lubrificante per gli occhi ai topi anestetizzati per prevenire l'essiccazione della cornea.
3. Fissa i topi knockin orizzontalmente sulla piattaforma. Inclinare la piattaforma di 30° caudale rispetto al mouse knockin. Rimuovere i peli sulla parete toracica anteriore del topo bussatore usando una crema depilatoria.
4. Posizionare la sonda verticalmente con la protuberanza rivolta verso la testa dell'animale. Quindi, ruotare la sonda in senso antiorario, circa 45°.
5. Nella vista dell'asse lungo parasternale, ruotare la sonda di 90° in senso orario per osservare la vista dell'asse corto parasternale. Dopo aver ruotato la sonda di 90°, regolare lo spostamento dell'asse y per ottenere la fetta corretta.
6. Osservare l'immagine dell'asse lungo del cuore (Figura 1C), quindi selezionare i dati di misurazione in modalità M.
7. Acquisire dati ecografici da viste parasternali ad asse lungo di topi (Figura 1). Vengono misurati la frequenza cardiaca (HR), la frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF), la gittata cardiaca (CO), la dimensione diastolica ventricolare sinistra (LVDd), la dimensione ventricolare sinistra end-sistolica (LVSd), il setto interventricolare (IVS) e la parete posteriore ventricolare sinistra (LVPW).
8. Dopo la misurazione, fornire ossigeno ai topi e rimetterli nelle rispettive gabbie quando riacquistano l'attività autonoma.

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Risultati

Profilo clinico delle famiglie
I pedigree familiari di HCM sono stati ottenuti e sono mostrati nella Figura 2. Tutti i membri della famiglia documentati sono stati diagnosticati con HCM al momento dell'iscrizione.

Nella famiglia (Figura 2A), il probando era il paziente III-7, a cui è stata diagnosticata la CMI e l'ostruzione del tratto di efflusso ventricolare sinistro (LVOTO) a 46 anni e ha subito un intervento chirurgico cardiac...

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Discussione

In questo studio, descriviamo una famiglia Han cinese con HCM. L'analisi genetica ha rivelato che una mutazione eterozigote di MYH6 p.G823E co-segrega con la malattia nei membri della famiglia con trasmissione autosomica dominante. Per convalidare la patogenicità della mutazione G823E e discutere i meccanismi sottostanti, abbiamo creato un modello murino C57BL/6N con G823E nel locus Myh7 del topo mediante ingegneria genomica mediata da CRISPR / Cas9.

Le caratteristiche fenotipiche dei topi kn...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5×TBE	Shanghai Sangon
2× Taq Master Mix (Dye Plus)	Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.
Agarose	Regu
Anesthesia machine for small animals	Reward Life Technology Co., Ltd.	R500
BEDTools		2.16.1
Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit	Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.	VK007
DNA Marker	Thermo Fisher Scientific
DNA stabilizer	Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.	DNAstable LD	prevent DNA degradation
Electric paraffin microtome	Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.	HS-S7220-B
GATK		v3.5
Gentra Puregene blood kit	Santa Clara
Glass slide, coverslip	Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.
Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.	C0107-500ml, C0109
HiSeq X-ten platform	Illumina		perform sequencing on the captured libraries
Injection of chorionic gonadotropin	Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Injection of pregnant mare serum gonadotropin	Livzon Pharmaceutical Group Inc.
Isoflurane	Local suppliers		inhalation anesthesia
Microinjection microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000
Paraffin Embedding Machine	Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.	HS-B7126-B
Picard		(2.2.4) 20
Proteinase K	Merck KGaA
samtools		1.3
Sequencer	Applied Biosystems	ABI 3500
Stereomicroscope	Nikon	SMZ745T
SureSelect Human All Exon V6	Agilent Technology Co., Ltd.		exome probe
T7 ARCA mRNA Kit	New England BioLabs, Inc.	NEB-E2065S
Temperature box	BINDER GmbH	KBF-S Solid.Line
Trizma Hydrochloride Solution	Sigma, Merck KGaA	No. T2663
Veterinary ultrasound system	Royal Philips	CX50