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摘要

在该方案中，视网膜色素变性患者诱导的多能干细胞 （iPSC） 衍生的 3D 视网膜类器官产生。这些类器官成功地概括了视网膜色素变性病的一些临床表型。

摘要

视网膜色素变性 （RP） 是一种罕见的遗传性视网膜退行性疾病，全球患病率约为 1/4,000。大多数 RP 患者患有进行性光感受器变性，导致周边视力丧失、夜盲症，最后导致完全失明。迄今为止，据报道，90 多个基因中的数千个突变与 RP 有关。目前，很少有适用于所有受影响基因和不同类型突变的动物模型，这在很大程度上阻碍了对基因/突变病理学潜在机制的破译，并限制了治疗和药物开发。与细胞和动物相比，患者诱导的多能干细胞 （iPSC） 衍生的 3D 视网膜类器官 （ROs） 为模拟人类早发性疾病提供了更好的系统。为了研究 RP，利用那些患者来源的 3D 视网膜类器官来概括 RP 的临床表型。在 RP 患者来源的 RO 中，视紫红质错位清晰显示。与其他动物模型相比，患者 iPSC 来源的视网膜类器官模型更接近 RP 特征，是研究疾病发病机制和药物开发的理想方法。

引言

由于缺乏合适的实验模型，人们对视网膜色素变性和年龄相关性黄斑变性等人类视网膜疾病知之甚少 1,2。尽管小鼠视网膜与人类视网膜非常相似，并且是研究视网膜变性病因的有力工具，但小鼠和人类之间存在巨大的物种差异 3,4。例如，小鼠和人类感光细胞的核结构不同，小鼠视网膜不具有黄斑 5,6。诱导多能干细胞 （iPSC） 技术使我们能够通过转录因子和/或化合物的组合，通过“重编程”过程将生物体的特化细胞恢复到初始多能状态 7,8,9,10。这些 iPSC 具有几乎无限的分裂和增殖能力，可以发育成各种类型的细胞。最近，iPSC 衍生的 3D 视网膜类器官已被开发出来，用于模拟人类视网膜发育的早期事件并描绘人类视网膜疾病的病理生理学 11,12,13,14,15。视网膜类器官具有许多优点：（1） 它们可用于概括体内视网膜发育和疾病发病机制;（2） 可用于高通量药物筛选和基因治疗的临床前试验;（3） 它们可用作视网膜退行性疾病治疗方案的临床前评估16,17。

该项目的一个目标是研究视网膜色素变性 （RP） 的发病机制，这种疾病由于其极端异质性而仍然无法治愈18。迄今为止，已鉴定出 90 多个基因与 RP19,20 相关。RPGR 基因被认为是 RP15 最普遍的致病基因之一，约占所有 RP 的 16% 4,21,22。在 RPGR 基因中携带移码突变的 iPSC 已成功生成并分化为有组织和分层的 3D 视网膜类器官14。通过利用这些类器官，观察到异常的感光层形态和感光器中视蛋白的位错。

总而言之，这里详细描述了有关如何生成患者来源的 3D 视网膜类器官的循序渐进且易于使用的协议23,24。这些类器官成功地概括了该疾病的一些临床表型。这为研究视网膜发育和疾病机制、治疗筛选和评估未来的临床前基因治疗提供了一个令人鼓舞的模型。

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研究方案

该协议遵循首都医科大学人类研究伦理委员会的指导方针。

1. 细胞培养和 iPSC 的生成

  1. 为本研究选择 RPGR 患者。在这里，使用了 3 名患者，1 名家族携带者和 3 名健康对照者。患者 1 在 RPGR 基因的外显子 14 中具有c.1685_1686delAT突变，患者 2 在 RPGR 基因的外显子 15 中具有c.2234_2235delGA突变，患者 3 在 RPGR 基因的外显子 15 中具有c.2403_2404delAG突变。选择三名健康志愿者作为对照14.用静脉穿刺从患者和健康对照者那里收集外周全血样本，并将其放入采血管中（材料表）。
  2. 通过使用密度梯度培养基25 的密度梯度离心分离外周血单核细胞 （PBMC）。在培养皿中的 8 mL 生长促进培养基（表 1）中扩增用细胞因子激活的 CD34 + PBMC。
  3. 1 周后，用转染系统（材料表）对 CD34 阳性外周血单核细胞进行电穿孔，并选择 CD34 阳性细胞和内置的 T-01 程序，无需任何修改。转染重编程质粒混合物 （2 μg），该质粒可产生人 OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、c-MYC 和 KLF4 蛋白。
  4. 将转染细胞接种在玻连蛋白人重组蛋白包被的六孔板中，在 2 mL 补充有 B-27 （1x）、N-2 （1x）、PD0325901 （0.5 μM）、bFGF （100 ng/mL）、CHIR99021 （3 μM）、HA-100 （10 μM）、A-83-01 （0.5 μM） 和 hLIF （1000 U/mL） 的 DMEM/F12 中，以维持 iPSC 的生长。
  5. 转导后 3 周，手动挑选 iPSC 集落，随后将其转移到 6 孔板中，并将它们保存在试剂 B（材料表）中进行扩增。
    注：六孔板应涂有玻连蛋白人重组蛋白。在 DPBS 中稀释玻连蛋白溶液，使其终浓度达到 10 μg/mL。将稀释的玻连蛋白添加到经组织培养处理的六孔板中。旋转培养皿，使玻连蛋白溶液均匀地分布在六孔板的表面上。将板在 37 °C 下孵育至少 1 小时。
  6. 当 iPSC 达到约 80%-90% 汇合时，确保用 0.5 mM EDTA 解聚细胞，并且分裂比为 1：8 或 1：10。在传代当天，将 blebbistatin （2.5 μM） 添加到试剂 B 中（表 1）。
    注：Blebbistatin 用于促进细胞粘附和干细胞活力，并防止干细胞凋亡。18 小时后，应使用试剂 B 刷新培养基。

2. 人类 RO 的产生

注意：当 iPSC 达到约 80%-90% 汇合时，iPSC 必须解离。

  1. 在 37 ◦C 下使用 0.5 mM EDTA 解离人 iPSC （hiPSC） 菌落 5 分钟。
  2. 通过轻轻移液将 hiPSC 团块分离成单个细胞。计数细胞以进行维持并在试剂 B 中培养它们（表 1）。
  3. 第 0 天，将 12,000 个细胞/孔接种在 96 个 V 形底锥形孔中，以便在 100 μL 分化培养基中重新聚集细胞（表 1）。
  4. 第 6 天，小心吸出细胞培养基，并加入 100 μL 含有 20 μM Y 27632 和 1.5 nM （55 ng/mL） hBMP4 的分化培养基。
  5. 在第 9 天，更换一半的分化培养基以将 hBMP4 浓度维持在 0.75 nM 左右。
  6. 从每个孔中吸取 60 μL 的分化培养基，并向每个孔中加入 60 μL 含有 20 μM Y-27632 的新鲜分化培养基。
  7. 在第 12 天，用新鲜的分化培养基替换一半的分化培养基，以获得 0.375 nM hBMP4。
  8. 第 18 天，将聚集体转移到带有 10 mL 尖端的新培养皿中，并在倒置显微镜下用显微手术刀将每个聚集体切成 2-4 块，以产生更多的类器官。
  9. 将同一组的聚集体转移到一个 15 mL 离心管中。当聚集体沉降到试管底部时，吸出上清液。
  10. 用 1 mL 神经视网膜培养基（DMEM/F12、10% 胎牛血清、1% N-2 补充剂、0.5 μM 视黄酸、0.1 mM 牛磺酸、1% 青霉素-链霉素）重悬聚集体，并将它们转移到含有 15 mL 神经视网膜培养基的不粘培养皿中。将 10-15 个视网膜类器官放入一个培养皿中。
  11. 每 5 天刷新一次培养基。由于视黄酸对光敏感，因此将培养物保存在黑暗中（图 1），并用倒置显微镜检查自组织人视网膜组织的形成 26,27,28,29。

3. 视网膜类器官分析

  1. hiPSC 来源的 3D 视网膜的免疫荧光染色
    1. 在 4 °C 下将 3D 视网膜固定在 1 mL 新鲜的 4% 多聚甲醛中的 DPBS 中 20 分钟。 然后，用 1 mL DPBS 缓冲液冲洗类器官。
    2. 测量 0.5 g 琼脂糖（材料表），并在微波炉烧瓶中将琼脂糖粉末与 100 mL DPBS 混合。用微波炉将琼脂糖溶解 1-3 分钟，直至完全溶解。让琼脂糖溶液冷却至约 40 °C。
    3. 将它们嵌入 DPBS 的 2%。
    4. 使用振动切片机将样品切成厚度为 50 μm 的切片。将切片切片放在粘附显微镜载玻片（材料表）上，并将它们储存在 -80 °C。
    5. 在室温 （RT） 下解冻切片 15 分钟。
    6. 用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，然后重复 3 次。
    7. 在 DPBS 溶液中使用 0.5% Triton X-100 在 RT 下透化切片 15 分钟。
    8. 取出透化溶液，用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，然后重复 3 次。
    9. 将切片与 1% BSA 和 0.5% Triton X-100 的 DPBS 溶液在 RT 下孵育 30 分钟。
    10. 将切片与在 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 中稀释的抗视紫红质抗体 （1：1000） 和抗 L/M 视蛋白抗体 （1：1000） 在 4 °C 下孵育 16 小时。
    11. 用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，然后重复 3 次。
    12. 将切片与在 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 中稀释的驴抗小鼠和兔二抗 （1：500） 在 RT 下孵育 1 小时。
    13. 在 RT 下在 DPBS 中加入 30 nM 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 15 分钟以进行核染色。
    14. 用 DPBS 洗涤切片 5 分钟，然后重复 5 次。
    15. 用包埋介质安装切片（材料表）并覆盖载玻片（材料表）。保存在暗箱中，并在 4 °C 下储存长达 4 周。
  2. RNA 提取和 RNA 测序
    1. 在冰上的 1 mL RNA 提取试剂（材料表）中，在相同的分化时间点（第 0 天、第 47 天、第 91 天、第 121 天和第 151 天）收集来自每个对照和患者的 1-3 个（根据大小）3D 视网膜。
    2. 使用均质器（材料表）破碎样品，开 1 分钟，关 30 秒，持续三个循环，并检查样品是否被破坏。
    3. 当样品完全均质时停止均质化，并剧烈涡旋试管 30 秒。
    4. 将样品在冰上孵育 15 分钟。
    5. 将样品在 4 °C 下以 13,800 x g 离心 15 分钟，然后将上清液转移到新的 2 mL 无 RNase 管中。
    6. 向试管中加入 0.4 mL 氯仿，涡旋，并在 4 °C 下以 13,800 x g 离心 10 分钟。
    7. 小心地将一部分（约 2/3）无色上层相转移到新的无 RNase 试管中。请勿吸出或干扰含有 DNA 的白色界面。
    8. 加入 0.5 mL 冷异丙醇，涡旋 30 秒，然后在 4 °C 下以 13,800 x g 离心 15 分钟。 在管底的侧面形成颗粒。
    9. 用移液管吸头小心吸出上清液并保留沉淀。
      注：当纯度非常高时，RNA 沉淀呈果冻状且透明。
    10. 加入 1 mL 冷的 70% 乙醇，剧烈涡旋样品 30 秒，然后在 4 °C 下以 13,800 x g 离心 10 分钟。
    11. 用移液器吸头小心吸出上清液，并在 RT 下将引擎盖中的沉淀风干 5-10 分钟。不要过度干燥沉淀。
    12. 加入 20-50 μL 不含 RNase 的水，并通过上下吹打小心地重悬沉淀。
    13. 在分光光度计上涂抹 1 μL RNA（材料表）。分别使用来自对照组和患者的总共约 10 μg RNA 进行 Illumina 文库制备30。
    14. 将 RNA 储存在 -80 °C。

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结果

示意图描述了生成健康和患者 iPSC 衍生的视网膜类器官的分化程序（图 1）。从 iPSC 到 ROs，由于多种因素而会产生变化。iPSC 的状态是 RO 生成的决定性步骤。此外，强烈建议研究人员记录所有培养基的每个步骤、目录和批号，以便整个实验可跟踪。 在图 2A 中，显示了第 130 天健康和患者 iPSC 来源的视网膜类器官中杆状标志物?...

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讨论

视网膜类器官是源自 hiPSC 或胚胎干细胞 （ESC） 的 3D 层状结构，是一种非常有前途的模型，可以模拟人类视网膜发育的时空模式31,32。RO 由各种类型的视网膜细胞组成，包括光感受器、双极细胞、神经节细胞、无长突细胞、水平细胞和 Müller 胶质细胞33。2D 培养不能精确模拟感光细胞外段的方向和发育。虽然?...

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披露声明

所有作者均未披露任何利益冲突。

致谢

我们感谢 M.S. Yan-ping Li 和 Zhuo-lin Liu 对手稿的技术支持和有益的评论。这项工作得到了国家自然科学基金 （82171470， 31871497， 81970838， Z20J00122）、北京市自然科学基金 （Z200014， 82125007） 和国家重点研发计划 （2017YFA0105300） 的部分支持。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
Adhesion microscope slidesCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection system
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Blood collection tubeBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Cover slidesCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancement mediumSigma811292Growth enhancement medium
Fetal bovine serumGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Density gradient medium
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-glutamine supplement
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizerEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serum replacement media
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND2000Spectrophotometer
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Recombinant human BMP4R&D Systems314-BP
Retinoic acidSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Trizol reagentInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance knifeAlcon Surgical8065912001

参考文献

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