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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo protocollo, sono stati generati organoidi retinici 3D derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) di pazienti con retinite pigmentosa. Questi organoidi hanno riassunto con successo alcuni fenotipi clinici della malattia da retinite pigmentosa.

Abstract

La retinite pigmentosa (RP) è una malattia degenerativa retinica rara ed ereditaria con una prevalenza di circa 1/4.000 persone in tutto il mondo. La maggior parte dei pazienti con RP presenta una progressiva degenerazione dei fotorecettori che porta alla perdita della visione periferica, alla cecità notturna e, infine, alla cecità totale. Ad oggi, sono state riportate migliaia di mutazioni in più di 90 geni associate alla RP. Attualmente, sono disponibili pochi modelli animali per tutti i geni colpiti e per diversi tipi di mutazioni, il che ostacola in gran parte la decifrazione dei meccanismi alla base della patologia genetica/mutazione e limita il trattamento e lo sviluppo di farmaci. Gli organoidi retinici 3D derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) derivate da pazienti hanno fornito un sistema migliore per modellare la malattia umana ad esordio precoce rispetto alle cellule e agli animali. Al fine di studiare la RP, sono stati utilizzati organoidi retinici 3D derivati da pazienti per ricapitolare i fenotipi clinici della RP. Nelle RO derivate da pazienti RP, l'errata localizzazione della rodopsina era chiaramente mostrata. Rispetto ad altri modelli animali, i modelli di organoidi retinici derivati da iPSC dei pazienti hanno riassunto più fedelmente le caratteristiche della RP e rappresentano un approccio ideale per lo studio della patogenesi della malattia e per lo sviluppo di farmaci.

Introduzione

Le malattie della retina umana, come la retinite pigmentosa e la degenerazione maculare legata all'età, sono scarsamente conosciute a causa della mancanza di modelli sperimentali appropriati 1,2. Sebbene la retina del topo sia molto simile alla retina umana e sia un potente strumento per studiare l'eziologia della degenerazione retinica, ci sono enormi differenze di specie tra topi e esseri umani 3,4. Ad esempio, l'architettura nucleare delle cellule fotorecettrici nei topi e negli esseri umani è diversa e la retina del topo non possiede una macula 5,6. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ci consente di riportare le cellule specializzate degli organismi allo stato pluripotente iniziale attraverso i processi di "riprogrammazione" mediante combinazioni di fattori di trascrizione e/o composti 7,8,9,10. Queste iPSC hanno una capacità di divisione e proliferazione quasi illimitata e potrebbero svilupparsi in vari tipi di cellule. Recentemente, sono stati sviluppati organoidi retinici 3D derivati da iPSC per modellare gli eventi precoci dello sviluppo retinico umano e per delineare la fisiopatologia delle malattie retiniche umane 11,12,13,14,15. Gli organoidi retinici hanno molti vantaggi: (1) possono essere utilizzati per ricapitolare in vivo lo sviluppo retinico e la patogenesi della malattia; (2) possono essere utilizzati per lo screening di farmaci ad alto rendimento e per gli studi preclinici di terapia genica; e (3) possono essere utilizzati come valutazioni precliniche delle opzioni di trattamento per le malattie degenerative della retina 16,17.

Uno degli obiettivi di questo progetto è stato quello di studiare la patogenesi della pigmentosa retinica (RP), una malattia che rimane incurabile a causa della sua estrema eterogeneità18. Ad oggi, sono stati identificati oltre 90 geni associati a RP19,20. Il gene RPGR, che è considerato uno dei geni causativi più diffusi di RP15, rappresenta circa il 16% di tutti i RP 4,21,22. Le iPSC portatrici di una mutazione frameshift nel gene RPGR sono state generate con successo e differenziate in organoidi retinici 3D organizzati e stratificati14. Utilizzando questi organoidi, sono state osservate una morfologia anomala dello strato dei fotorecettori e la dislocazione delle opsine nei fotorecettori.

Nel complesso, qui viene descritto in dettaglio un protocollo graduale e accessibile su come generare organoidi retinici 3D derivati da pazienti23,24. Questi organoidi hanno ricapitolato con successo alcuni fenotipi clinici della malattia. Ciò fornisce un modello incoraggiante per studiare lo sviluppo retinico e i meccanismi di malattia, per lo screening terapeutico e per valutare la futura terapia genica preclinica.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana della Capital Medical University.

1. Colture cellulari e generazione di iPSCs

  1. Scegli i pazienti RPGR per questo studio. Qui sono stati utilizzati tre pazienti, un portatore familiare e tre controlli sani. Il paziente 1 possedeva una mutazione c.1685_1686delAT nell'esone 14 del gene RPGR, il paziente 2 presentava una mutazione c.2234_2235delGA nell'esone 15 del gene RPGR e il paziente 3 aveva una mutazione c.2403_2404delAG nell'esone 15 del gene RPGR. Scegli tre volontari sani come controlli14. Raccogliere campioni di sangue intero periferico dai pazienti e controlli sani con la venipuntura e metterli in provette per la raccolta del sangue (Tabella dei materiali).
  2. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) mediante centrifugazione a gradiente di densità con un mezzo a gradiente di densità25. Espandere le PBMC CD34+ attivate con citochine in 8 mL di terreno di miglioramento della crescita (Tabella 1) in una piastra di Petri.
  3. Dopo 1 settimana, elettroporare le cellule mononucleate del sangue periferico CD34-positive con un sistema di trasfezione (Tabella dei materiali) e scegliere le cellule CD34-positive e il programma T-01 integrato senza alcuna modifica. Trasfettare un cocktail di plasmidi di riprogrammazione (2 μg) in grado di produrre proteine umane OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC e KLF4.
  4. Seminare le cellule trasfettate in piastre a sei pozzetti rivestite di proteine umane ricombinanti con vitronectina in 2 mL di DMEM/F12 integrate con B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) e hLIF (1000 U/mL) per mantenere la crescita delle iPSC.
  5. 3 settimane dopo la trasduzione, prelevare manualmente le colonie di iPSC, trasferirle successivamente in piastre a sei pozzetti e mantenerle nel reagente B (Table of Materials) per l'espansione.
    NOTA: Le piastre a sei pozzetti devono essere rivestite con la proteina ricombinante umana vitronectina. Diluire la soluzione di vitronectina in DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 10 μg/mL. Aggiungere la vitronectina diluita alle piastre a sei pozzetti trattate con coltura tissutale. Agitare il coltura per distribuire uniformemente la soluzione di vitronectina sulla superficie delle piastre a sei pozzetti. Incubare le piastre a 37 °C per almeno 1 ora.
  6. Assicurarsi che le celle siano disaggregate con EDTA 0,5 mM quando le iPSC raggiungono circa l'80%-90% di confluenza e che il rapporto di divisione sia 1:8 o 1:10. Il giorno del passaggio, aggiungere blebbistatina (2,5 μM) al reagente B (Tabella 1).
    NOTA: La blebbistatina è stata utilizzata per promuovere l'adesione cellulare e la vitalità delle cellule staminali e prevenire l'apoptosi delle cellule staminali. 18 ore dopo, il terreno deve essere rinfrescato con il reagente B.

2. Generazione di RO umani

NOTA: Le iPSC devono essere dissociate quando le iPSC raggiungono circa l'80%-90% di confluenza.

  1. Dissociare le colonie di iPSC umane (hiPSC) utilizzando 0,5 mM di EDTA a 37 °C per 5 minuti.
  2. Segregate i grumi di hiPSC in singole cellule mediante pipettaggio delicato. Contare le cellule per il mantenimento e farle crescere nel reagente B (Tabella 1).
  3. Il giorno 0, seminare 12.000 cellule/pozzetto in 96 pozzetti conici con fondo a V per la riaggregazione cellulare in 100 μL di terreno di differenziazione (Tabella 1).
  4. Il giorno 6, aspirare con cura il terreno di coltura cellulare e aggiungere 100 μL del terreno di differenziazione contenente 20 μM Y 27632 e 1,5 nM (55 ng/mL) hBMP4.
  5. Il giorno 9, sostituire metà del mezzo di differenziazione per mantenere la concentrazione di hBMP4 a circa 0,75 nM.
  6. Aspirare 60 μl del terreno di differenziazione da ciascun pozzetto e aggiungere 60 μl del terreno di differenziazione fresco contenente 20 μM di Y-27632 a ciascun pozzetto.
  7. Il giorno 12, sostituire metà del mezzo di differenziazione con un mezzo di differenziazione fresco per ottenere 0,375 nM hBMP4.
  8. Il giorno 18, trasferire gli aggregati in una nuova piastra di Petri con punte da 10 ml e tagliare ogni aggregato in 2-4 pezzi con un coltello microchirurgico al microscopio invertito per generare più organoidi.
  9. Trasferire gli aggregati dello stesso gruppo in una provetta da centrifuga da 15 mL. Quando gli aggregati si depositano sul fondo dei tubi, aspirare il surnatante.
  10. Risospendere gli aggregati con 1 mL di terreno neurale della retina (DMEM/F12, 10% siero fetale bovino, 1% integratore di N-2, 0,5 μM di acido retinoico, 0,1 mM di taurina, 1% penicillina-streptomicina) e trasferirli in piastre di Petri antiaderenti contenenti 15 mL di terreno neurale della retina. Mettere 10-15 organoidi retinici in una capsula di Petri.
  11. Aggiornare il terreno di coltura ogni 5 giorni. Mantenere la coltura al buio poiché l'acido retinoico è sensibile alla luce (Figura 1) e controllare la formazione del tessuto retinico umano auto-organizzante con un microscopio invertito 26,27,28,29.

3. Analisi di organoidi retinici

  1. Colorazione in immunofluorescenza di retine 3D derivate da hiPSC
    1. Fissare la retina 3D in 1 mL di paraformaldeide fresca al 4% in DPBS per 20 minuti a 4 °C. Quindi, sciacquare gli organoidi con 1 mL di tampone DPBS.
    2. Misurare 0,5 g di agarosio (Tabella dei materiali) e mescolare la polvere di agarosio con 100 ml di DPBS in un pallone per microonde. Usa un forno a microonde per sciogliere l'agarosio per 1-3 minuti fino a quando non è completamente sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio a circa 40 °C.
    3. Incorporali nel 2% in DPBS.
    4. Tagliare i campioni in sezioni con uno spessore di 50 μm utilizzando un vibratomo. Posizionare le sezioni affettate sui vetrini del microscopio ad adesione (Tabella dei materiali) e conservarle a -80 °C.
    5. Scongelare le fette per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
    6. Lavare le fette con DPBS per 5 minuti e ripetere 3 volte.
    7. Utilizzare Triton X-100 allo 0,5% nella soluzione DPBS per permeabilizzare le fette per 15 minuti a RT.
    8. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione, lavare le fette con DPBS per 5 minuti e ripetere 3 volte.
    9. Incubare le fette con l'1% di BSA e lo 0,5% di Triton X-100 in DPBS per 30 minuti a RT.
    10. Incubare le fette con anticorpo anti-rodopsina (1:1000) e anticorpo anti-L/M opsina (1:1000) diluiti in 1% BSA e 0,1% Triton X-100 per 16 ore a 4 °C.
    11. Lavare le fette con DPBS per 5 minuti e ripetere 3 volte.
    12. Incubare le fette con anticorpo secondario anti-topo d'asino e coniglio (1:500) diluito in BSA all'1% e Triton X-100 allo 0,1% per 1 ora a RT.
    13. Aggiungere 30 nM di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in DPBS per 15 minuti a RT per la colorazione nucleare.
    14. Lavare le fette con DPBS per 5 minuti e ripetere 5 volte.
    15. Montare le fette con il mezzo di inclusione (Tabella dei materiali) e coprire le diapositive (Tabella dei materiali). Conservare in una scatola scura e conservare a 4 °C per un massimo di 4 settimane.
  2. Estrazione dell'RNA e sequenziamento dell'RNA
    1. Raccogliere 1-3 (in base alle dimensioni) retine 3D derivate da ciascun controllo e paziente negli stessi punti temporali di differenziazione (giorno 0, giorno 47, giorno 91, giorno 121 e giorno 151) in 1 ml di reagente per l'estrazione dell'RNA (Tabella dei materiali) su ghiaccio.
    2. Utilizzare l'omogeneizzatore (Tabella dei materiali) per interrompere i campioni, 1 min ON, 30 s OFF, per tre cicli, e controllare che il campione non sia disturbato.
    3. Interrompere l'omogeneizzazione quando i campioni sono completamente omogeneizzati e agitare vigorosamente la provetta per 30 s.
    4. Incubare i campioni su ghiaccio per 15 minuti.
    5. Centrifugare i campioni a 13.800 x g per 15 minuti a 4 °C e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 mL priva di RNasi.
    6. Aggiungere 0,4 mL di cloroformio alla provetta, agitare e centrifugare a 13.800 x g per 10 minuti a 4 °C.
    7. Trasferire con cura una porzione (circa 2/3) della fase superiore incolore in una nuova provetta priva di RNasi. Non aspirare o disturbare l'interfaccia bianca contenente il DNA.
    8. Aggiungere 0,5 mL di isopropanolo freddo, agitare per 30 s e centrifugare a 13.800 x g per 15 min a 4 °C. Un pellet si forma sul lato del fondo del tubo.
    9. Aspirare con cura il surnatante con la punta di una pipetta e conservare il pellet.
      NOTA: Il pellet di RNA è gelatinoso e trasparente quando la purezza è molto elevata.
    10. Aggiungere 1 mL di etanolo freddo al 70%, agitare energicamente i campioni per 30 s e centrifugare a 13.800 x g per 10 min a 4 °C.
    11. Aspirare con cura il surnatante con la punta di una pipetta e asciugare all'aria il pellet nella cappa a RT per 5-10 minuti. Non asciugare eccessivamente il pellet.
    12. Aggiungere 20-50 μl di acqua priva di RNasi e risospendere accuratamente il pellet pipettandolo su e giù.
    13. Applicare 1 μL di RNA su uno spettrofotometro (Tabella dei materiali). Per la preparazione della libreria Illumina30 sono stati utilizzati un totale di circa 10 μg di RNA rispettivamente da controlli e pazienti.
    14. Conservare l'RNA a -80 °C.

Risultati

L'illustrazione schematica descrive le procedure di differenziazione per generare organoidi retinici sani e pazienti derivati da iPSC (Figura 1). Dalle iPSC alle RO, le variazioni possono essere prodotte a causa di diversi fattori. Lo stato dell'iPSC è il passaggio determinante della generazione RO. Inoltre, si raccomanda vivamente ai ricercatori di registrare ogni fase, catalogo e numero di lotto di tutti i media in modo che l'intero esperimento sia tracci...

Discussione

Gli organoidi retinici sono strutture laminate 3D derivate da hiPSC o cellule staminali embrionali (ESC) e rappresentano un modello molto promettente per imitare i modelli spaziali e temporali dello sviluppo retinico umano 31,32. Le RO sono costituite da vari tipi di cellule retiniche, tra cui fotorecettori, cellule bipolari, cellule ganglionari, cellule amacrine, cellule orizzontali e glia di Müller33. L...

Divulgazioni

Tutti gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Ringraziamo M.S. Yan-ping Li e Zhuo-lin Liu per il loro supporto tecnico e gli utili commenti riguardanti il manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), dalla Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014, 82125007) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
Adhesion microscope slidesCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection system
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Blood collection tubeBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Cover slidesCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancement mediumSigma811292Growth enhancement medium
Fetal bovine serumGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Density gradient medium
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-glutamine supplement
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizerEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serum replacement media
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND2000Spectrophotometer
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Recombinant human BMP4R&D Systems314-BP
Retinoic acidSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Trizol reagentInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance knifeAlcon Surgical8065912001

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