È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
In questo protocollo, sono stati generati organoidi retinici 3D derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) di pazienti con retinite pigmentosa. Questi organoidi hanno riassunto con successo alcuni fenotipi clinici della malattia da retinite pigmentosa.
La retinite pigmentosa (RP) è una malattia degenerativa retinica rara ed ereditaria con una prevalenza di circa 1/4.000 persone in tutto il mondo. La maggior parte dei pazienti con RP presenta una progressiva degenerazione dei fotorecettori che porta alla perdita della visione periferica, alla cecità notturna e, infine, alla cecità totale. Ad oggi, sono state riportate migliaia di mutazioni in più di 90 geni associate alla RP. Attualmente, sono disponibili pochi modelli animali per tutti i geni colpiti e per diversi tipi di mutazioni, il che ostacola in gran parte la decifrazione dei meccanismi alla base della patologia genetica/mutazione e limita il trattamento e lo sviluppo di farmaci. Gli organoidi retinici 3D derivati da cellule staminali pluripotenti (iPSC) derivate da pazienti hanno fornito un sistema migliore per modellare la malattia umana ad esordio precoce rispetto alle cellule e agli animali. Al fine di studiare la RP, sono stati utilizzati organoidi retinici 3D derivati da pazienti per ricapitolare i fenotipi clinici della RP. Nelle RO derivate da pazienti RP, l'errata localizzazione della rodopsina era chiaramente mostrata. Rispetto ad altri modelli animali, i modelli di organoidi retinici derivati da iPSC dei pazienti hanno riassunto più fedelmente le caratteristiche della RP e rappresentano un approccio ideale per lo studio della patogenesi della malattia e per lo sviluppo di farmaci.
Le malattie della retina umana, come la retinite pigmentosa e la degenerazione maculare legata all'età, sono scarsamente conosciute a causa della mancanza di modelli sperimentali appropriati 1,2. Sebbene la retina del topo sia molto simile alla retina umana e sia un potente strumento per studiare l'eziologia della degenerazione retinica, ci sono enormi differenze di specie tra topi e esseri umani 3,4. Ad esempio, l'architettura nucleare delle cellule fotorecettrici nei topi e negli esseri umani è diversa e la retina del topo non possiede una macula 5,6. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ci consente di riportare le cellule specializzate degli organismi allo stato pluripotente iniziale attraverso i processi di "riprogrammazione" mediante combinazioni di fattori di trascrizione e/o composti 7,8,9,10. Queste iPSC hanno una capacità di divisione e proliferazione quasi illimitata e potrebbero svilupparsi in vari tipi di cellule. Recentemente, sono stati sviluppati organoidi retinici 3D derivati da iPSC per modellare gli eventi precoci dello sviluppo retinico umano e per delineare la fisiopatologia delle malattie retiniche umane 11,12,13,14,15. Gli organoidi retinici hanno molti vantaggi: (1) possono essere utilizzati per ricapitolare in vivo lo sviluppo retinico e la patogenesi della malattia; (2) possono essere utilizzati per lo screening di farmaci ad alto rendimento e per gli studi preclinici di terapia genica; e (3) possono essere utilizzati come valutazioni precliniche delle opzioni di trattamento per le malattie degenerative della retina 16,17.
Uno degli obiettivi di questo progetto è stato quello di studiare la patogenesi della pigmentosa retinica (RP), una malattia che rimane incurabile a causa della sua estrema eterogeneità18. Ad oggi, sono stati identificati oltre 90 geni associati a RP19,20. Il gene RPGR, che è considerato uno dei geni causativi più diffusi di RP15, rappresenta circa il 16% di tutti i RP 4,21,22. Le iPSC portatrici di una mutazione frameshift nel gene RPGR sono state generate con successo e differenziate in organoidi retinici 3D organizzati e stratificati14. Utilizzando questi organoidi, sono state osservate una morfologia anomala dello strato dei fotorecettori e la dislocazione delle opsine nei fotorecettori.
Nel complesso, qui viene descritto in dettaglio un protocollo graduale e accessibile su come generare organoidi retinici 3D derivati da pazienti23,24. Questi organoidi hanno ricapitolato con successo alcuni fenotipi clinici della malattia. Ciò fornisce un modello incoraggiante per studiare lo sviluppo retinico e i meccanismi di malattia, per lo screening terapeutico e per valutare la futura terapia genica preclinica.
Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana della Capital Medical University.
1. Colture cellulari e generazione di iPSCs
2. Generazione di RO umani
NOTA: Le iPSC devono essere dissociate quando le iPSC raggiungono circa l'80%-90% di confluenza.
3. Analisi di organoidi retinici
L'illustrazione schematica descrive le procedure di differenziazione per generare organoidi retinici sani e pazienti derivati da iPSC (Figura 1). Dalle iPSC alle RO, le variazioni possono essere prodotte a causa di diversi fattori. Lo stato dell'iPSC è il passaggio determinante della generazione RO. Inoltre, si raccomanda vivamente ai ricercatori di registrare ogni fase, catalogo e numero di lotto di tutti i media in modo che l'intero esperimento sia tracci...
Gli organoidi retinici sono strutture laminate 3D derivate da hiPSC o cellule staminali embrionali (ESC) e rappresentano un modello molto promettente per imitare i modelli spaziali e temporali dello sviluppo retinico umano 31,32. Le RO sono costituite da vari tipi di cellule retiniche, tra cui fotorecettori, cellule bipolari, cellule ganglionari, cellule amacrine, cellule orizzontali e glia di Müller33. L...
Tutti gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamo M.S. Yan-ping Li e Zhuo-lin Liu per il loro supporto tecnico e gli utili commenti riguardanti il manoscritto. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), dalla Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014, 82125007) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelite | MS-9096VZ | |
A-83–01 | R&D Systems | 2939/10 | |
Adhesion microscope slides | CITOtest | 188105 | |
Agarose | Gene Tech | 111760 | |
Amaxa Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Transfection system |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 3718-FB | |
Blebbistatin | Nuwacell Biotechnologies | RP01008 | |
Blood collection tube | BD Vacutainer EDTA | 366643 | |
CHIR99021 | TOCRIS | 4423/10 | |
Cover slides | CITOGLAS | 10212440C | |
cTarget hPSC Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01020 | |
DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
DMEM/Ham’s F12 | Gibco | 10565-042 | |
Donkey anti-mouse 488 | Invitrogen | A-21202 | |
Donkey anti-rabbit 594 | Invitrogen | A-21207 | |
EDTA | Nuwacell Biotechnologies | RP01007 | |
Embedding medium | FluorSaveTM Reagent | 345789 | |
EX-CYTE growth enhancement medium | Sigma | 811292 | Growth enhancement medium |
Fetal bovine serum | Gibco | 04-002-1A | |
Ficoll | Sigma-Aldrich | 26873-85-8 | Density gradient medium |
FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-glutamine supplement |
HA-100 | STEMCELL Technologies | 72482 | |
Ham’s F12 | Gibco | 11765-054 | |
hLIF | Thermo Fisher Scientific | AF-250-NA | |
Homogenizer | EDEN lab | D-130 | |
IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Iscove’s Modified Dulbecco Medium | Gibco | 12440053 | |
KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Gibco | A3181502 | Serum replacement media |
L/M-opsin | Millipore | ab5405 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | Spectrophotometer |
ncEpic 125x Supplement | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-02 | 125x Supplement |
ncEpic Basal Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-01 | Basal hpsc medium |
ncLaminin511 human recombinant protein | Nuwacell Biotechnologies | RP01025 | |
PD0325901 | STEMCELL Technologies | 72182 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
Rhodopsin | Sigma | O4886 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
sIL6-R | Thermo Fisher Scientific | RP-75602 | |
StemSpan SFEM medium | STEMCELL Technologies | 09600 | |
Taurine | Sigma | T8691 | |
Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
Vitronectin | Nuwacell Biotechnologies | RP01002 | |
V-Lance knife | Alcon Surgical | 8065912001 |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon