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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wurden 3D-Netzhautorganoide generiert, die von Retinitis pigmentosa-Patienten induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) abgeleitet wurden. Diese Organoide rekapitulierten erfolgreich einige klinische Phänotypen der Retinitis pigmentosa-Krankheit.

Zusammenfassung

Die Retinitis pigmentosa (RP) ist eine seltene und erbliche degenerative Erkrankung der Netzhaut mit einer Prävalenz von etwa 1/4.000 Menschen weltweit. Die Mehrheit der RP-Patienten hat eine fortschreitende Photorezeptordegeneration, die zu peripherem Sehverlust, Nachtblindheit und schließlich zur völligen Erblindung führt. Bisher wurde berichtet, dass Tausende von Mutationen in mehr als 90 Genen mit RP in Verbindung gebracht werden. Derzeit gibt es nur wenige Tiermodelle für alle betroffenen Gene und verschiedene Arten von Mutationen, was die Entschlüsselung der Mechanismen, die der Gen-/Mutationspathologie zugrunde liegen, stark erschwert und die Behandlung und Medikamentenentwicklung einschränkt. Patienteninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), die aus 3D-Netzhautorganoiden (ROs) gewonnen werden, haben ein besseres System zur Modellierung der früh einsetzenden Krankheit beim Menschen als Zellen und Tiere bereitgestellt. Um RP zu untersuchen, wurden diese patienteneigenen 3D-Netzhautorganoide verwendet, um die klinischen Phänotypen von RP zu rekapitulieren. In den RP-Patienten-ROs war die Fehllokalisation von Rhodopsin deutlich zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Tiermodellen rekapitulierten iPS-abgeleitete Netzhaut-Organoidmodelle von Patienten die RP-Merkmale genauer und stellen einen idealen Ansatz für die Untersuchung der Krankheitspathogenese und für die Arzneimittelentwicklung dar.

Einleitung

Erkrankungen der menschlichen Netzhaut, wie z. B. Retinitis pigmentosa und altersbedingte Makuladegeneration, sind aufgrund des Mangels an geeigneten experimentellen Modellen nur unzureichend verstanden 1,2. Obwohl die Netzhaut der Maus der menschlichen Netzhaut sehr ähnlich ist und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Ätiologie der Netzhautdegeneration ist, gibt es große Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen 3,4. Zum Beispiel ist die Kernarchitektur der Photorezeptorzellen bei Mäusen und Menschen unterschiedlich, und die Netzhaut der Maus besitzt keine Makula 5,6. Die Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) ermöglicht es uns, die spezialisierten Zellen von Organismen durch die "Reprogrammierung" von Kombinationen von Transkriptionsfaktoren und/oder Verbindungen in den ursprünglichen pluripotenten Zustand zurückzuversetzen 7,8,9,10. Diese iPSCs haben eine nahezu unbegrenzte Teilungs- und Proliferationsfähigkeit und können sich zu verschiedenen Zelltypen entwickeln. In jüngster Zeit wurden iPSC-abgeleitete 3D-Netzhaut-Organoide entwickelt, um die frühen Ereignisse der menschlichen Netzhautentwicklung zu modellieren und die Pathophysiologie menschlicher Netzhauterkrankungen abzugrenzen 11,12,13,14,15. Netzhaut-Organoide haben viele Vorteile: (1) Sie können verwendet werden, um die Entwicklung der Netzhaut und die Pathogenese der Krankheit in vivo zu rekapitulieren; (2) Sie können für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings und präklinische Studien zur Gentherapie verwendet werden; und (3) sie können als präklinische Bewertung von Behandlungsoptionen für degenerative Netzhauterkrankungen verwendet werden16,17.

Ein Ziel dieses Projekts war es, die Pathogenese der retinalen Pigmentosa (RP) zu untersuchen, einer Erkrankung, die aufgrund ihrer extremen Heterogenität unheilbar ist18. Bisher wurden über 90 Gene identifiziert, die mit RPassoziiert sind 19,20. Das RPGR-Gen, das als eines der häufigsten ursächlichen Gene von RP15 gilt, macht etwa 16% aller RP 4,21,22 aus. iPSCs, die eine Frameshift-Mutation im RPGR-Gen tragen, wurden erfolgreich erzeugt und zu organisierten und geschichteten 3D-Netzhautorganoiden differenziert14. Durch die Verwendung dieser Organoide wurden eine abnormale Morphologie der Photorezeptorschicht und die Dislokation von Opsinen in Photorezeptoren beobachtet.

Insgesamt wird hier ein schrittweises und zugängliches Protokoll zur Erzeugung von patientenabgeleiteten 3D-Netzhautorganoiden ausführlich beschrieben23,24. Diese Organoide rekapitulierten erfolgreich einige klinische Phänotypen der Krankheit. Dies bietet ein ermutigendes Modell für die Untersuchung der Netzhautentwicklung und der Krankheitsmechanismen, für das therapeutische Screening und für die Evaluierung zukünftiger präklinischer Gentherapien.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Capital Medical University für die Humanforschung.

1. Zellkultur und Erzeugung von iPS-Zellen

  1. Wählen Sie RPGR-Patienten für diese Studie aus. Hier wurden drei Patienten, ein familiärer Träger und drei gesunde Kontrollpersonen, verwendet. Patient 1 besaß eine Mutation c.1685_1686delAT im Exon 14 des RPGR-Gens, Patient 2 besaß eine Mutation c.2234_2235delGA im Exon 15 des RPGR-Gens und Patient 3 hatte eine Mutation c.2403_2404delAG im Exon 15 des RPGR-Gens. Wählen Sie drei gesunde Freiwillige als Kontrollen14. Entnehmen Sie periphere Vollblutproben von den Patienten und gesunden Kontrollpersonen mit Venenpunktion und geben Sie sie in Blutentnahmeröhrchen (Materialtabelle).
  2. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) werden durch Dichtegradientenzentrifugation mit einem Dichtegradientenmedium25 isoliert. CD34+ PBMCs, die mit Zytokin aktiviert wurden, in 8 ml Wachstumsförderungsmedium (Tabelle 1) in einer Petrischale erweitern.
  3. Nach 1 Woche werden die mononukleären CD34-positiven Zellen des peripheren Blutes mit einem Transfektionssystem (Table of Materials) elektroporiert und die CD34-positiven Zellen und das eingebaute T-01-Programm ohne jegliche Modifikation ausgewählt. Transfizieren Sie einen Cocktail aus Reprogrammierungsplasmiden (2 μg), der humane OCT4-, SOX2-, NANOG-, LIN28-, c-MYC- und KLF4-Proteine produzieren könnte.
  4. Aussaat der transfizierten Zellen in humanen rekombinanten proteinbeschichteten Sechs-Well-Platten in 2 ml DMEM/F12, ergänzt mit B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng/ml), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) und hLIF (1000 U/ml), um das Wachstum der iPSCs aufrechtzuerhalten.
  5. 3 Wochen nach der Transduktion werden die Kolonien der iPS-Zellen manuell entnommen, anschließend in Sechs-Well-Platten überführt und zur Expansion in Reagenz B (Tabelle der Materialien) aufbewahrt.
    HINWEIS: Die Sechs-Well-Platten sollten mit humanem rekombinantem Protein aus vitronektin beschichtet werden. Verdünnen Sie die Vitronektinlösung in DPBS, um eine Endkonzentration von 10 μg/ml zu erreichen. Geben Sie das verdünnte Vitronektin in mit Gewebekulturen behandelte Sechs-Well-Platten. Schwenken Sie das Kulturgefäß, um die Vitronektinlösung gleichmäßig auf der Oberfläche der Sechs-Well-Platten zu verteilen. Die Platten bei 37 °C mindestens 1 h inkubieren.
  6. Stellen Sie sicher, dass die Zellen mit 0,5 mM EDTA disaggregiert werden, wenn die iPS-Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % bis 90 % erreichen, und dass das Teilungsverhältnis 1:8 oder 1:10 beträgt. Am Tag der Passage ist Blebbistatin (2,5 μM) zu Reagenz B hinzuzufügen (Tabelle 1).
    HINWEIS: Blebbistatin wurde verwendet, um die Zelladhäsion und die Lebensfähigkeit der Stammzellen zu fördern und die Apoptose der Stammzellen zu verhindern. 18 h später sollte das Medium mit Reagenz B aufgefrischt werden.

2. Erzeugung menschlicher ROs

HINWEIS: Die iPSCs müssen dissoziiert werden, wenn die iPSCs eine Konfluenz von etwa 80 % bis 90 % erreichen.

  1. Dissoziieren Sie die humanen iPSC (hiPSC)-Kolonien mit 0,5 mM EDTA bei 37 °C für 5 Minuten.
  2. Trennen Sie die hiPSC-Klumpen durch schonendes Pipettieren in einzelne Zellen. Zählen Sie die Zellen für die Erhaltungstherapie und züchten Sie sie in Reagenz B (Tabelle 1).
  3. An Tag 0 werden 12.000 Zellen/Well in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden für die Zellreaggregation in 100 μl Differenzierungsmedium ausgesät (Tabelle 1).
  4. An Tag 6 wird das Zellkulturmedium vorsichtig aspiriert und 100 μl des Differenzierungsmediums mit 20 μM Y 27632 und 1,5 nM (55 ng/ml) hBMP4 hinzugefügt.
  5. Ersetzen Sie an Tag 9 die Hälfte des Differenzierungsmediums, um die hBMP4-Konzentration bei etwa 0,75 nM zu halten.
  6. Aspirieren Sie 60 μl des Differenzierungsmediums aus jeder Vertiefung und fügen Sie 60 μl des frischen Differenzierungsmediums mit 20 μM Y-27632 in jede Vertiefung hinzu.
  7. Ersetzen Sie an Tag 12 die Hälfte des Differenzierungsmediums durch frisches Differenzierungsmedium, um 0,375 nM hBMP4 zu erreichen.
  8. Übertragen Sie an Tag 18 die Aggregate in eine neue Petrischale mit 10 ml-Spitzen und schneiden Sie jedes Aggregat mit einem mikrochirurgischen Messer unter einem inversen Mikroskop in 2-4 Stücke, um weitere Organoide zu erzeugen.
  9. Die Aggregate aus derselben Gruppe werden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Wenn sich die Aggregate am Boden der Rohre absetzen, wird der Überstand abgesaugt.
  10. Resuspendieren Sie die Aggregate mit 1 ml neuronalem Netzhautmedium (DMEM/F12, 10 % fötales Rinderserum, 1 % N-2-Supplement, 0,5 μM Retinsäure, 0,1 mM Taurin, 1 % Penicillin-Streptomycin) und überführen Sie sie in antihaftbeschichtete Petrischalen mit 15 ml neuralem Netzhautmedium. Geben Sie 10-15 Netzhautorganoide in eine Petrischale.
  11. Aktualisieren Sie das Kulturmedium alle 5 Tage. Halten Sie die Kultur im Dunkeln, da Retinsäure lichtempfindlich ist (Abbildung 1), und überprüfen Sie die Bildung des selbstorganisierenden menschlichen Netzhautgewebes mit einem inversen Mikroskop 26,27,28,29.

3. Analyse von Netzhaut-Organoiden

  1. Immunfluoreszenzfärbung von hiPSC-abgeleiteter 3D-Netzhaut
    1. Fixieren Sie die 3D-Netzhaut in 1 mL frischem 4%igem Paraformaldehyd in DPBS für 20 min bei 4 °C. Spülen Sie dann die Organoide mit 1 ml DPBS-Puffer aus.
    2. Messen Sie 0,5 g Agarose (Materialtabelle) und mischen Sie das Agarosepulver mit 100 ml DPBS in einem mikrowellengeeigneten Kolben. In der Mikrowelle die Agarose 1-3 Minuten lang auflösen, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Die Agaroselösung auf ca. 40 °C abkühlen lassen.
    3. Betten Sie sie in 2% in DPBS ein.
    4. Schneiden Sie die Proben mit einem Vibratom in Abschnitte mit einer Dicke von 50 μm. Legen Sie die geschnittenen Schnitte auf Adhäsionsmikroskop-Objektträger (Materialtabelle) und lagern Sie sie bei -80 °C.
    5. Tauen Sie die Scheiben 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf.
    6. Die Scheiben 5 Minuten lang mit DPBS waschen und 3x wiederholen.
    7. Verwenden Sie 0,5 % Triton X-100 in DPBS-Lösung, um die Scheiben 15 Minuten lang bei RT zu permeabilisieren.
    8. Entfernen Sie die Permeabilisierungslösung, waschen Sie die Scheiben 5 Minuten lang mit DPBS und wiederholen Sie den Vorgang 3x.
    9. Inkubieren Sie die Scheiben mit 1 % BSA und 0,5 % Triton X-100 in DPBS für 30 Minuten bei RT.
    10. Inkubieren Sie die Scheiben mit Anti-Rhodopsin-Antikörper (1:1000) und Anti-L/M-Opsin-Antikörper (1:1000), verdünnt in 1 % BSA und 0,1 % Triton X-100 für 16 Stunden bei 4 °C.
    11. Die Scheiben 5 Minuten lang mit DPBS waschen und 3x wiederholen.
    12. Inkubieren Sie die Scheiben mit Esels-Anti-Maus- und Kaninchen-Sekundärantikörpern (1:500), verdünnt in 1 % BSA und 0,1 % Triton X-100 für 1 h bei RT.
    13. 30 nM 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in DPBS für 15 min bei RT zur nuklearen Färbung hinzufügen.
    14. Die Scheiben 5 Minuten lang mit DPBS waschen und 5x wiederholen.
    15. Montieren Sie die Schichten mit Einbettmedium (Materialtabelle) und decken Sie die Objektträger ab (Materialtabelle). In einer dunklen Box aufbewahren und bis zu 4 Wochen bei 4 °C lagern.
  2. RNA-Extraktion und RNA-Sequenzierung
    1. Sammeln Sie 1-3 (je nach Größe) 3D-Netzhaut, die von jeder Kontrolle und jedem Patienten zu denselben Differenzierungszeitpunkten (Tag 0, Tag 47, Tag 91, Tag 121 und Tag 151) in 1 ml RNA-Extraktionsreagenz (Materialtabelle) auf Eis abgeleitet wurden.
    2. Verwenden Sie den Homogenisator (Materialtabelle), um die Proben zu zerkleinern, 1 min EIN, 30 s AUS, für drei Zyklen, und überprüfen Sie die Probe auf Störung.
    3. Stoppen Sie die Homogenisierung, wenn die Proben vollständig homogenisiert sind, und wirbeln Sie das Röhrchen 30 s lang kräftig durch.
    4. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang auf Eis.
    5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.800 x g für 15 min bei 4 °C und überführen Sie den Überstand in ein neues 2 mL RNase-freies Röhrchen.
    6. Geben Sie 0,4 ml Chloroform in das Röhrchen, den Vortex und zentrifugieren Sie es bei 13.800 x g für 10 Minuten bei 4 °C.
    7. Übertragen Sie einen Teil (ca. 2/3) der farblosen oberen Phase vorsichtig in ein neues RNase-freies Röhrchen. Aspirieren oder stören Sie die weiße Grenzfläche, die die DNA enthält, nicht.
    8. 0,5 mL kaltes Isopropanol zugeben, 30 s lang vortexen und 15 min bei 4 °C bei 13.800 x g zentrifugieren. An der Seite des Rohrbodens bildet sich ein Pellet.
    9. Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipettenspitze ab und bewahren Sie das Pellet auf.
      HINWEIS: Das RNA-Pellet ist geleeartig und transparent, wenn die Reinheit sehr hoch ist.
    10. 1 ml kaltes 70%iges Ethanol hinzufügen, die Proben 30 s lang kräftig vorziehen und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 13.800 x g zentrifugieren.
    11. Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipettenspitze an und trocknen Sie das Pellet in der Haube bei RT für 5-10 min an der Luft. Trocknen Sie das Pellet nicht zu stark.
    12. Fügen Sie 20-50 μl RNasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie es auf und ab pipettieren.
    13. 1 μl RNA auf ein Spektralphotometer auftragen (Materialtabelle). Insgesamt wurden rund 10 μg RNA von Kontrollen bzw. Patienten für die Erstellung der Illumina-Bibliothek verwendet30.
    14. Lagern Sie die RNA bei -80 °C.

Ergebnisse

Die schematische Darstellung beschreibt die Differenzierungsverfahren zur Erzeugung gesunder und von Patienten abgeleiteter iPSC-abgeleiteter Netzhautorganoide (Abbildung 1). Von iPSC bis hin zu ROs können Variationen aufgrund mehrerer Faktoren hervorgerufen werden. Der Status des iPSC ist der bestimmende Schritt der RO-Generierung. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, dass Forschende jeden Schritt, Katalog und jede Chargennummer aller Medien aufzeichne...

Diskussion

Netzhaut-Organoide sind 3D-laminierte Strukturen, die von hiPSCs oder embryonalen Stammzellen (ESCs) abgeleitet sind und ein sehr vielversprechendes Modell darstellen, um die räumlichen und zeitlichen Muster der menschlichen Netzhautentwicklung nachzuahmen31,32. Die ROs bestehen aus verschiedenen Arten von Netzhautzellen, darunter Photorezeptoren, Bipolarzellen, Ganglienzellen, Amakrinzellen, horizontale Zellen und Müller-Gliaz...

Offenlegungen

Alle Autoren legen keine Interessenkonflikte offen.

Danksagungen

Wir danken M.S. Yan-ping Li und Zhuo-lin Liu für ihre technische Unterstützung und hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise von der National Natural Science Foundation of China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), der Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014, 82125007) und dem National Key R&D Program of China (2017YFA0105300) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
Adhesion microscope slidesCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection system
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Blood collection tubeBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Cover slidesCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancement mediumSigma811292Growth enhancement medium
Fetal bovine serumGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Density gradient medium
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-glutamine supplement
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizerEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serum replacement media
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND2000Spectrophotometer
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Recombinant human BMP4R&D Systems314-BP
Retinoic acidSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Trizol reagentInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance knifeAlcon Surgical8065912001

Referenzen

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