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Resumo

Neste protocolo, foram gerados organoides retinianos 3D derivados de células-tronco pluripotentes (iPSC) induzidos por pacientes com retinite pigmentosa. Esses organoides recapitularam com sucesso alguns fenótipos clínicos da doença da retinite pigmentosa.

Resumo

A retinite pigmentosa (RP) é uma doença degenerativa da retina rara e hereditária com uma prevalência de aproximadamente 1/4.000 pessoas em todo o mundo. A maioria dos pacientes com RP apresenta degeneração progressiva dos fotorreceptores, levando à perda da visão periférica, cegueira noturna e, finalmente, cegueira total. Até o momento, milhares de mutações em mais de 90 genes foram relatadas como associadas à RP. Atualmente, existem poucos modelos animais disponíveis para todos os genes afetados e diferentes tipos de mutações, o que dificulta em grande parte a decifração dos mecanismos subjacentes à patologia gene/mutação e limita o tratamento e o desenvolvimento de medicamentos. Os organoides retinianos (ROs) 3D derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por pacientes (iPSC) forneceram um sistema melhor para modelar a doença humana de início precoce do que células e animais. Para estudar o RP, esses organoides retinianos 3D derivados do paciente foram utilizados para recapitular os fenótipos clínicos do RP. Nos ROs derivados de pacientes com RP, a localização incorreta da rodopsina foi claramente exibida. Em comparação com outros modelos animais, os modelos organoides retinianos derivados de iPSC do paciente recapitularam mais de perto as características do RP e representam uma abordagem ideal para investigar a patogênese da doença e para o desenvolvimento de medicamentos.

Introdução

As doenças retinianas humanas, como retinite pigmentosa e degeneração macular relacionada à idade, são pouco compreendidas devido à falta de modelos experimentais apropriados 1,2. Embora a retina do camundongo seja muito semelhante à retina humana e seja uma ferramenta poderosa para estudar a etiologia da degeneração da retina, existem enormes diferenças de espécies entre camundongos e humanos 3,4. Por exemplo, a arquitetura nuclear das células fotorreceptoras em camundongos e humanos é diferente, e a retina do camundongo não possui mácula 5,6. A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) nos permite retornar as células especializadas dos organismos ao estado pluripotente inicial por meio dos processos de "reprogramação" por combinações de fatores de transcrição e / ou compostos 7,8,9,10. Essas iPSCs têm capacidade de divisão e proliferação quase ilimitada e podem se desenvolver em vários tipos de células. Recentemente, organoides retinianos 3D derivados de iPSC foram desenvolvidos para modelar os eventos iniciais do desenvolvimento da retina humana e delinear a fisiopatologia das doenças da retina humana11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Os organoides retinianos têm muitas vantagens: (1) eles podem ser usados para recapitular in vivo o desenvolvimento da retina e a patogênese da doença; (2) eles podem ser usados para triagem de medicamentos de alto rendimento e ensaios pré-clínicos de terapia genética; e (3) podem ser usados como avaliações pré-clínicas de opções de tratamento para doenças degenerativas da retina 16,17.

Um dos objetivos deste projeto foi estudar a patogênese da retina pigmentosa (FR), uma doença que permanece incurável devido à sua extrema heterogeneidade18. Até o momento, mais de 90 genes foram identificados como associados ao RP19,20. O gene RPGR, que é considerado um dos genes causadores mais prevalentes do RP15, é responsável por aproximadamente 16% de todos os RP 4,21,22. As iPSCs portadoras de uma mutação frameshift no gene RPGR foram geradas e diferenciadas com sucesso em organoides retinianos 3D organizados e estratificados14. Com a utilização desses organoides, observou-se uma morfologia anormal da camada fotorreceptora e o deslocamento de opsinas nos fotorreceptores.

Ao todo, um protocolo passo a passo e acessível é descrito em detalhes aqui sobre como gerar organoides retinianos 3D derivados do paciente23,24. Esses organoides recapitularam com sucesso alguns fenótipos clínicos da doença. Isso fornece um modelo encorajador para estudar o desenvolvimento da retina e os mecanismos da doença, para triagem terapêutica e para avaliar a futura terapia gênica pré-clínica.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Capital Medical University.

1. Cultura celular e geração de iPSCs

  1. Escolha pacientes com RPGR para este estudo. Aqui, três pacientes, um portador familiar e três controles saudáveis, foram usados. O paciente 1 possuía uma mutação c.1685_1686delAT no éxon 14 do gene RPGR, o paciente 2 abrigava uma mutação c.2234_2235delGA no éxon 15 do gene RPGR e o paciente 3 tinha uma mutação c.2403_2404delAG no éxon 15 do gene RPGR. Escolha três voluntários saudáveis como controles14. Colete amostras de sangue total periférico dos pacientes e controles saudáveis com punção venosa e coloque-as em tubos de coleta de sangue (Tabela de Materiais).
  2. Isolar as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por centrifugação por gradiente de densidade com um meio de gradiente de densidade25. Expanda as PBMCs CD34+ ativadas com citocinas em 8 mL de meio de aumento de crescimento (Tabela 1) em uma placa de Petri.
  3. Após 1 semana, eletroporar as células mononucleares do sangue periférico CD34-positivas com um sistema de transfecção (Tabela de Materiais) e escolher células CD34-positivas e o Programa T-01 embutido sem qualquer modificação. Transfect um coquetel de plasmídeos de reprogramação (2 μg) que poderia produzir proteínas OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC e KLF4 humanas.
  4. Semeie as células transfectadas em placas de seis poços revestidas com proteína recombinante humana vitronectina em 2 mL de DMEM/F12 suplementado com B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0,5 μM), bFGF (100 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0,5 μM) e hLIF (1000 U/mL) para manter o crescimento das iPSCs.
  5. 3 semanas após a transdução, pegue as colônias de iPSCs manualmente, transfira-as posteriormente para placas de seis poços e mantenha-as no reagente B (Tabela de Materiais) para expansão.
    NOTA: As placas de seis poços devem ser revestidas com proteína recombinante humana vitronectina. Diluir a solução de vitronectina em DPBS para atingir uma concentração final de 10 μg/ml. Adicione a vitronectina diluída a placas de seis poços tratadas com cultura de tecidos. Agite o material de cultura para espalhar a solução de vitronectina uniformemente na superfície das placas de seis poços. Incubar as placas a 37 °C durante pelo menos 1 h.
  6. Certifique-se de que as células sejam desagregadas com EDTA 0,5 mM quando as iPSCs atingirem cerca de 80% -90% de confluência e que a taxa de divisão seja de 1:8 ou 1:10. No dia da passagem, adicione blebistatina (2,5 μM) ao reagente B (Tabela 1).
    NOTA: A blebbitatina foi usada para promover a adesão celular e a viabilidade das células-tronco e prevenir a apoptose das células-tronco. 18 h depois, o meio deve ser atualizado com o reagente B.

2. Geração de ROs humanos

NOTA: As iPSCs devem ser dissociadas quando atingirem cerca de 80% -90% de confluência.

  1. Dissocie as colônias de iPSC humano (hiPSC) usando 0,5 mM de EDTA a 37 ◦C por 5 min.
  2. Separe os aglomerados de hiPSC em células únicas por pipetagem suave. Conte as células para manutenção e cultive-as no reagente B (Tabela 1).
  3. No dia 0, semear 12.000 células/poço em 96 poços cônicos de fundo em V para reagregação celular em 100 μL de meio de diferenciação (Tabela 1).
  4. No dia 6, aspire cuidadosamente o meio de cultura celular e adicione 100 μL do meio de diferenciação contendo 20 μM Y 27632 e 1,5 nM (55 ng/mL) hBMP4.
  5. No dia 9, substitua metade do meio de diferenciação para manter a concentração de hBMP4 em torno de 0,75 nM.
  6. Aspirar 60 μL do meio de diferenciação de cada alvéolo e adicionar 60 μL do meio de diferenciação fresco contendo 20 μM de Y-27632 a cada alvéolo.
  7. No dia 12, substitua metade do meio de diferenciação por meio de diferenciação fresco para atingir 0,375 nM hBMP4.
  8. No dia 18, transfira os agregados para uma nova placa de Petri com pontas de 10 mL e corte cada agregado em 2-4 pedaços com uma faca microcirúrgica sob um microscópio invertido para gerar mais organoides.
  9. Transferir os agregados do mesmo grupo para um tubo de centrífuga de 15 ml. Quando os agregados se depositarem no fundo dos tubos, aspire o sobrenadante.
  10. Ressuspenda os agregados com 1 mL de meio de retina neural (DMEM/F12, 10% de soro fetal bovino, 1% de suplemento de N-2, 0,5 μM de ácido retinóico, 0,1 mM de taurina, 1% de penicilina-estreptomicina) e transfira-os para placas de Petri antiaderentes com 15 mL de meio de retina neural. Coloque 10-15 organoides retinianos em uma placa de Petri.
  11. Atualize o meio de cultura a cada 5 dias. Mantenha a cultura no escuro, pois o ácido retinóico é sensível à luz (Figura 1) e verifique a formação do tecido retiniano humano auto-organizado com microscópio invertido 26,27,28,29.

3. Análise de organoides retinianos

  1. Coloração por imunofluorescência de retinas 3D derivadas de hiPSC
    1. Fixe as retinas 3D em 1 mL de paraformaldeído fresco a 4% em DPBS por 20 min a 4 ° C. Em seguida, enxágue os organoides com 1 mL de tampão DPBS.
    2. Meça 0,5 g de agarose (Tabela de Materiais) e misture o pó de agarose com 100 mL de DPBS em um frasco para micro-ondas. Use um micro-ondas para dissolver a agarose por 1-3 min até que esteja completamente dissolvida. Deixe a solução de agarose arrefecer até cerca de 40 °C.
    3. Incorpore-os em 2% no DPBS.
    4. Corte as amostras em seções com uma espessura de 50 μm usando um vibratoma. Coloque as seções cortadas em lâminas de microscópio de adesão (Tabela de Materiais) e armazene-as a -80 ° C.
    5. Descongele as fatias por 15 min em temperatura ambiente (RT).
    6. Lave as fatias com DPBS por 5 min e repita 3x.
    7. Use Triton X-100 a 0,5% em solução de DPBS para permeabilizar as fatias por 15 min em RT.
    8. Remova a solução de permeabilização, lave as fatias com DPBS por 5 min e repita 3x.
    9. Incube as fatias com 1% de BSA e 0,5% de Triton X-100 em DPBS por 30 min em RT.
    10. Incubar as fatias com anticorpo anti-rodopsina (1:1000) e anticorpo anti-L/M opsina (1:1000) diluídos em 1% BSA e 0,1% Triton X-100 por 16 h a 4 °C.
    11. Lave as fatias com DPBS por 5 min e repita 3x.
    12. Incubar as fatias com anticorpo secundário de rato e coelho (1:500) diluído em 1% de BSA e 0,1% de Triton X-100 por 1 h em RT.
    13. Adicione 30 nM 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em DPBS por 15 min em RT para coloração nuclear.
    14. Lave as fatias com DPBS por 5 min e repita 5x.
    15. Monte as fatias com meio de incorporação (Tabela de Materiais) e cubra as lâminas (Tabela de Materiais). Conservar numa caixa escura e conservar a 4 °C até 4 semanas.
  2. Extração de RNA e sequenciamento de RNA
    1. Colete 1-3 (de acordo com os tamanhos) retinas 3D derivadas de cada controle e paciente nos mesmos pontos de tempo de diferenciação (dia 0, dia 47, dia 91, dia 121 e dia 151) em 1 mL de reagente de extração de RNA (Tabela de Materiais) no gelo.
    2. Use o homogeneizador (Tabela de Materiais) para interromper as amostras, 1 min LIGADO, 30 s DESLIGADO, por três ciclos, e verifique se a amostra está quebrada.
    3. Pare a homogeneização quando as amostras estiverem totalmente homogeneizadas e vortex o tubo vigorosamente por 30 s.
    4. Incube as amostras no gelo por 15 min.
    5. Centrifugar as amostras a 13.800 x g durante 15 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 ml sem RNase.
    6. Adicione 0,4 mL de clorofórmio ao tubo, vórtice e centrifugue a 13.800 x g por 10 min a 4 ° C.
    7. Transfira cuidadosamente uma porção (cerca de 2/3) da fase superior incolor para um novo tubo livre de RNase. Não aspire ou perturbe a interface branca que contém o ADN.
    8. Adicione 0,5 mL de isopropanol frio, vórtice por 30 s e centrifugue a 13.800 x g por 15 min a 4 ° C. Um pellet se forma na lateral do fundo do tubo.
    9. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com uma ponta de pipeta e guarde o pellet.
      NOTA: O pellet de RNA é gelatinoso e transparente quando a pureza é muito alta.
    10. Adicione 1 mL de etanol frio a 70%, vortex as amostras vigorosamente por 30 s e centrifugue a 13.800 x g por 10 min a 4 ° C.
    11. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com uma ponta de pipeta e seque ao ar o pellet no exaustor em RT por 5-10 min. Não seque demais o pellet.
    12. Adicione 20-50 μL de água livre de RNase e ressuspenda o pellet com cuidado, pipetando para cima e para baixo.
    13. Aplique 1 μL de RNA em um espectrofotômetro (Tabela de Materiais). Um total de cerca de 10 μg de RNA de controles e pacientes, respectivamente, foi usado para a preparação da biblioteca Illumina30.
    14. Armazene o RNA a -80 °C.

Resultados

A ilustração esquemática descreve os procedimentos de diferenciação para gerar organoides retinianos derivados de iPSC saudáveis e pacientes (Figura 1). De iPSC a ROs, variações podem ser produzidas devido a vários fatores. O status do iPSC é a etapa determinante da geração de RO. Além disso, é altamente recomendável que os pesquisadores registrem todas as etapas, catálogos e números de lote de todas as mídias para que todos os experimentos...

Discussão

Os organoides retinianos são estruturas laminadas 3D derivadas de hiPSCs ou células-tronco embrionárias (ESCs) e apresentam um modelo muito promissor para imitar os padrões espaciais e temporais do desenvolvimento da retina humana31,32. As ROs consistem em vários tipos de células da retina, incluindo fotorreceptores, células bipolares, células ganglionares, células amácrinas, células horizontais e glia de Müller

Divulgações

Todos os autores não divulgam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a M.S. Yan-ping Li e Zhuo-lin Liu por seu apoio técnico e comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (Z200014, 82125007) e Programa Nacional de P&D da China (2017YFA0105300).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakeliteMS-9096VZ
A-83–01R&D Systems2939/10
Adhesion microscope slidesCITOtest188105
AgaroseGene Tech111760
Amaxa Nucleofector 2b DeviceLonzaAAB-1001Transfection system
B-27Thermo Fisher Scientific17504044
bFGFR&D Systems3718-FB
BlebbistatinNuwacell BiotechnologiesRP01008
Blood collection tubeBD Vacutainer EDTA366643
CHIR99021TOCRIS4423/10
Cover slidesCITOGLAS10212440C
cTarget hPSC MediumNuwacell BiotechnologiesRP01020
DAPIInvitrogenD-1306
DMEM/Ham’s F12Gibco10565-042
Donkey anti-mouse 488InvitrogenA-21202
Donkey anti-rabbit 594InvitrogenA-21207
EDTANuwacell BiotechnologiesRP01007
Embedding mediumFluorSaveTM Reagent345789
EX-CYTE growth enhancement mediumSigma811292Growth enhancement medium
Fetal bovine serumGibco04-002-1A
FicollSigma-Aldrich26873-85-8Density gradient medium
FLT3LPeprotech300-19
GlutaMAXLife Technologies35050-061L-glutamine supplement
HA-100STEMCELL Technologies72482
Ham’s F12Gibco11765-054
hLIFThermo Fisher ScientificAF-250-NA
HomogenizerEDEN labD-130
IL-3Peprotech213-13
IL-6Peprotech200-06
Iscove’s Modified Dulbecco MediumGibco12440053
KnockOut Serum Replacement - Multi-SpeciesGibcoA3181502Serum replacement media
L/M-opsinMilliporeab5405
MonothioglycerolSigmaM6145
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nanodrop SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND2000Spectrophotometer
ncEpic 125x SupplementNuwacell BiotechnologiesRP01001-02125x Supplement
ncEpic Basal MediumNuwacell BiotechnologiesRP01001-01Basal hpsc medium
ncLaminin511 human recombinant proteinNuwacell BiotechnologiesRP01025
PD0325901STEMCELL Technologies72182
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Recombinant human BMP4R&D Systems314-BP
Retinoic acidSigmaR2625
RhodopsinSigmaO4886
RNeasy Mini KitQiagen74104
RNeasy Mini KitQiagen74104
sIL6-RThermo Fisher ScientificRP-75602
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL Technologies09600
TaurineSigmaT8691
Trizol reagentInvitrogen15596026
VitronectinNuwacell BiotechnologiesRP01002
V-Lance knifeAlcon Surgical8065912001

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