在根尖肠模型中使用路西法黄测定肠通透性

摘要

本协议概述了一种在顶端肠模型中利用荧光花黄来确定肠道通透性的方法。该方法可用于确定模拟炎症性肠病（如坏死性小肠结肠炎）的肠样肠的细胞旁通透性。

摘要

类肠病是研究炎症性肠病（如坏死性小肠结肠炎（NEC））的新兴研究工具。它们传统上生长在基底外侧（BO）构象中，其中上皮细胞的顶端表面面向内腔。在该模型中，进入类肠的管腔表面进行治疗和实验具有挑战性，这限制了研究宿主 - 病原体相互作用的能力。为了规避这种情况，创建了用于坏死性小肠结肠炎的新生儿根尖排出（AO）模型。由于肠上皮细胞通透性变化是NEC的特异性变化，因此该协议概述了使用荧光素黄（LY）作为细胞旁通透性的标志物。LY 通过所有三种主要的细胞旁途径 穿过 肠上皮屏障:孔隙、渗漏和无限制。在AO模型中使用LY可以更广泛地研究NEC的渗透性。经IRB批准和父母同意，从人类早产新生儿中收集肠道组织的手术样本。通过隐窝分离 收获 肠道干细胞并用于培养类肠。肠样生长至成熟，然后转化AO或留在BO构象中。这些要么不处理（对照），要么用脂多糖（LPS）处理，并经受缺氧条件以诱导 体外 NEC。使用LY评估渗透率。顶端蛋白闭塞带-1 和基底外侧蛋白 β-连环蛋白的免疫荧光染色证实了 AO 构象。与对照组相比，用LPS和缺氧治疗的AO和BO类肠均表现出显着增加的细胞旁通透性。与对照组相比，AO和BO类肠均显示LY对治疗肠腔的摄取增加。在AO肠模型中利用LY可以研究细胞旁通透性的所有三种主要途径。它还允许研究宿主-病原体相互作用，以及与BO肠样模型相比，这可能如何影响通透性。

引言

肠样是源自器官受限的人肠道干细胞的三维 （3D） 结构^1，2。它们完全由上皮谱系组成，包含所有分化的肠上皮细胞类型²。肠样肠还维持由形成内隔室的顶端腔表面和面向周围介质的基底外侧表面组成的细胞极性。肠样是一种独特的模型，因为它们保留了产生它们的宿主的特征³.因此，早产儿产生的类肠病代表了一种模型，可用于研究主要影响该人群的疾病，例如坏死性小肠结肠炎（NEC）。

传统的肠样模型以基底外向外（BO）构象生长，其中肠被包裹在基底膜基质（BMM）的圆顶中。BMM诱导肠样保持3D结构，基底外侧表面在外面。BO类肠是NEC的合适模型，可弥合二维（2D）原代人细胞系与体内动物模型^2，4之间的差距。通过将LPS或细菌等病原体置于肠样蛋白周围的培养基中，然后暴露于缺^{氧条件下，}在肠中诱导NEC。BO肠样NEC模型的挑战在于它不允许有效研究宿主 - 病原体相互作用，这些相互作用发生在体内顶端表面。肠道通透性的变化是由于这些宿主-病原体相互作用。为了更好地了解通透性如何影响疾病的病理生理学基础，必须创建一个涉及处理顶端表面的模型。

Co等人首先证明，通过去除BMM圆顶并将其重新悬浮^在培养基5中，可以诱导成熟的BO肠形成顶端（AO）构象。本文证明AO肠保持正确的上皮极性，包含所有肠细胞类型，维持肠上皮屏障，并允许进入顶端表面⁵。使用AO肠作为NEC模型，实现了疾病过程的生理再现和宿主-病原体相互作用的研究。

NEC 病理生理学的一个主要因素是肠通透性增加⁶。已经提出了几种分子作为体外测试肠道通透性的^{一种方法7。}其中，荧光法黄（LY）是一种亲水染料，激发峰和发射峰分别为428 nm和540 nm，^分别为8。当它穿过所有主要的细胞旁途径时，它已被用于评估各种应用中的细胞旁通透性，包括血脑和肠上皮屏障^8，9。LY的传统应用使用在半透表面上单层生长的细胞¹⁰。LY应用于顶端表面，并通过细胞旁紧密连接蛋白在基底外侧聚集。基底外侧区室中较高的 LY 浓度表明紧密连接蛋白减少，随后肠上皮细胞屏障破裂和通透性增加¹⁰。在3D BO肠样模型中也有描述，其中将LY添加到培养基中，并对单个肠成像以将LY摄取到管腔¹¹中。虽然这允许通过可视化LY摄取进行定性分析，但定量分析是有限的。该协议概述了一种独特的技术，该技术使用 LY 在 AO 肠样中使用体外 NEC 肠样模型评估细胞旁通透性，同时保持 3D 方向。该方法可用于渗透率的定性和定量分析。

研究方案

本研究是根据俄克拉荷马大学机构审查委员会的批准（IRB，#11610，11611）进行的。在根据IRB规范收集人体手术标本之前，需要父母同意。在IRB批准和父母同意后，从接受NEC手术或其他肠切除术（如造口切除术或闭锁修复术）的婴儿（校正胎龄（GA）在样本采集时为36-41周，所有婴儿都有早产史，估计GA为25-34周，2:1 M:F）获得人类小肠组织。类肠是由从空肠或回肠获得的组织产生的。

1. 人婴源性肠培养:从整个组织中分离和接种隐窝

1. 按照上一份报告制备培养基、螯合缓冲液#1和螯合缓冲液#2（表1）⁴.将螯合缓冲液储存在4°C并在48小时内使用。
2. 制备人小肠培养基（表1）。将原液储存在-20°C，并在使用前在37°C水浴中加热。
3. 准备50%L-WRN条件培养基（CM）（表1）。将原液在4°C下储存长达1周。
   注意:条件培养基的100%L-WRN碱基在Miyoshi等人的协议中描述¹²。
4. 根据上一份报告从手术标本获得的小肠组织样本中生成肠样⁴.将四个肠样蛋白孔板在0.75-2.5g肠组织的24孔板中。
   注意:肠样可以从储存在30mL罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中的组织在4°C的50mL锥形管中成功生成长达48小时。
5. 将24孔板倒置在37°C，5%CO₂ 培养箱中倒置15-20分钟，以使BMM圆顶⁴聚合。
6. 向每个孔中加入 500 μL 50% L-WRN CM（如步骤 1.3 中所述）和 0.5 μL Y-27632 ROCK 抑制剂（RI，参见 材料表）。2-3 天后，用不含 RI 的 50% L-WRN CM 替换。

2. AO类肠的产生

1. 用 50% L-WRN CM^培养嵌入 BMM 中的肠样 7-10 天 4.
2. 取出培养基，向一个孔中加入 500 μL 细胞回收溶液（CRS，参见 材料表）。刮擦圆顶，上下移液几次，然后将CRS / 肠样/ BMM溶液添加到下一个孔中。
3. 刮圆顶，上下移液数次，然后将溶液放入微量离心管中。向第二个孔中加入 500 μL CRS，上下移液，然后将其添加到第一个孔中。将该溶液转移到相同的 1.5 mL 微量离心管中。
4. 重复步骤2.3，将两个孔汇集到一个微量离心管中，直到所有孔内容物都在CRS中。
   注意:如果产生大量AO肠样，可以将两个以上的孔汇集到一个更大的15 mL锥形管中。保持每孔500 μL CRS的比例对于确保BMM的完全溶解非常重要。
5. 将微量离心管（步骤2.3）与混合的CRS /肠样/ BMM溶液放在旋转器上，在4°C下溶解BMM1小时。
6. 在4°C下以200× g 离心溶液3分钟，然后用微量移液管除去上清液，留下沉淀。
7. 将肠样沉淀重悬于每个微量离心管的1mL 50%L-WRN CM（如步骤1.3中制备）中。将 500 μL 重悬的肠/培养基溶液轻轻移液到超低附着 24 孔组织培养板的每个孔中（参见 材料表）。
8. 在实验前在37°C与5%CO₂ 孵育3天。

3. 通过全安装免疫荧光染色 验证 AO肠构象

1. 在培养基悬浮液中孵育肠样3天后，将肠样/培养基悬浮液从一个孔移入微量离心管中。
2. 在4°C下以200× g 离心肠/培养基悬浮液5分钟。 用微量移液管除去上清液。
3. 将肠重悬于 20 μL BMM 中。将 10 μL 肠悬浮液移液到显微镜载玻片上，并将其铺在约 1 cm x 1 cm 见方的薄层中。在同一载玻片的单独部分重复剩余的 10 μL 肠悬浮液，以便有两次肠样/BMM 混悬液涂片。
4. 让肠/BMM涂片在室温（RT）下凝固15分钟。
5. 在通风橱中工作，将载玻片放入染色罐中并填充 4% 多聚甲醛，直到覆盖肠/BMM 涂片（如果使用容量为 10 张载玻片的玻璃染色罐，一张载玻片~30 mL）。允许30分钟（在室温下）进行固定。
   注意:4%的多聚甲醛是有害的，可能会引起眼睛损伤/刺激、皮肤刺激和癌症。使用时始终在通风橱下工作。处理时请戴防护手套和个人防护装备。将其丢弃在经批准的废物处理容器中。
6. 将4%的多聚甲醛丢弃在适当的废物容器中。向染色罐中加入 30 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或直到 PBS 覆盖肠/BMM 涂片。让它在室温下静置3分钟，然后将PBS丢弃在多聚甲醛废液瓶中。再重复此步骤两次，总共洗涤三次。
7. 用 30 mL 在 PBS 中稀释的 0.5% Triton X-100 填充新的染色罐。将带有肠样/ BMM涂片的载玻片置于Triton溶液中，并在室温下透化20分钟。
8. 丢弃在PBS中稀释的0.5%Triton X-100。向染色罐中加入 30 mL PBS，静置 3 分钟。通过倾析丢弃PBS。
9. 轻轻擦拭肠/BMM涂片周围的载玻片，注意不要破坏它们。使用疏水屏障笔（屏障PAP笔，见 材料表），在每个肠/BMM涂片周围画一个圆圈。制作20%血清，特异性于产生二抗的动物（见 材料表）。
10. 将显微镜载玻片平放在实验室工作台上。通过将步骤3.9中的100μL特异性20%血清移液到疏水屏障笔环的每个肠样/ BMM涂片上，在4°C下封闭载玻片1小时。
11. 制备 100 μL 溶液，分别用 PBS 稀释的 1:100 和 1:200 稀释的 β-连环蛋白和 ZO-1 一抗。
    注意:每种一抗必须来自不同的动物，以确保它们在成像时具有不同的免疫荧光通道。本研究利用小鼠β-连环蛋白抗体和兔ZO-1抗体（见 材料表）。
12. 轻拍计数器上的载玻片以取出 20% 的血清并轻轻擦干，注意不要破坏肠/BMM 涂片。将 100 μL β-连环蛋白/ZO-1 一抗溶液移液到肠样/BMM 涂片之一上。将 100 μL 不含一抗的 PBS 移液到另一条肠样/BMM 涂片上作为阴性对照。
13. 用湿纸巾在塑料容器的底部排成一条线，以形成一个加湿的容器。将载玻片放入容器中，注意不要破坏覆盖肠/BMM涂片的溶液。将盖子放在容器上密封，并在4°C下平放过夜。
    注意:不要让载玻片变干。确保容器关闭以避免干燥。
14. 准备好继续后，点击计数器上的载玻片以去除肠样/BMM 涂片中的一抗和 PBS。
15. 通过将载玻片放入染色罐中并填充 30 mL PBS 或直到 PBS 覆盖肠/BMM 涂片来执行洗涤步骤。让它在室温下静置3分钟。丢弃PBS并重复此步骤两次，总共洗涤三次。
16. 为两种不同的免疫荧光通道制备 200 μL 二抗，每种抗体在 PBS 中的稀释度为 1:1000（参见 材料表）。使溶液远离光线。
17. 将 100 μL 二抗溶液移液到每个肠样/BMM 涂片上。将其放在黑暗中，让它在室温下静置1小时。
18. 点击计数器上的载玻片以去除二抗。重复步骤 3.15 中概述的洗涤步骤，确保所有洗涤都在黑暗中进行。
19. 在每个肠/BMM 涂片中加入一滴 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（含 DAPI 的氟屏蔽，见 材料表）封片剂，并涂上盖玻片以确保充分覆盖两个涂片。避免在盖玻片下捕获气泡。将载玻片放在黑暗中，直到准备好在显微镜下观察。
    注意:载玻片的即时成像可产生最佳结果;然而，载玻片可以平放在4°C的加湿容器中，并在加入DAPI后成像长达1周。

4. 实验NEC的诱导

1. 确保AO肠类药物在使用前悬浮至少72小时。
2. 轻轻地将每个孔中的所有肠/培养基悬浮液移入微量离心管中。
   注意:如果处理大量孔，则可以将多个孔汇集到一个 15 mL 锥形管中。对于该方案，建议每个处理组至少三个孔。
3. 在室温下以300× g 离心3分钟，除去上清液。
4. 将 10 μL 的 5 mg/mL 脂多糖（LPS，参见 材料表）加入 500 μL 的 50% LWRN CM 中/孔（终浓度 100 μg/mL LPS）。
5. 将指定为治疗组的AO肠重悬于50%LWRN + LPS中，并将500μL悬浮液等分到24孔超低附着板上。将指定为未处理对照的AO类肠重悬于每孔500μL的50%LWRN CM中。将该悬浮液的 500 μL 等分到单独的 24 孔超低附着板中。
6. 根据制造商的说明，通过具有 1% O 2、5% CO 2 和 94% N ₂ 的模块化培养箱 （MIC） 诱导 LPS 处理的 AO 肠样蛋白缺氧（参见材料表）。用缺氧和LPS治疗肠样24小时。
7. 将未处理和LPS +缺氧处理的培养物（仍在MIC室中）置于37°C，5%CO₂ 培养箱中24小时。

5. 利用LY测量细胞旁通透性

1. 轻轻地将每个孔中的肠/培养基悬浮液移入微量离心管中。在37°C水浴中加热DPBS和50%LRWN CM。
2. 在室温下以300× g 离心肠/培养基悬浮液3分钟。
3. 取出介质。用温热的 500 μL DPBS 洗涤肠样。
4. 在室温下以300× g 离心3分钟。 用微量移液器除去上清液。
5. 再次重复步骤5.3-5.4，总共两次。
6. 洗涤后，加入 450 μL 温热的 50% LWRN CM（如步骤 1.3 中制备）。
7. 向每个孔中加入 50 μL 2.5 mg/mL LY（终浓度为 0.25 μg/μL，参见 材料表），轻轻旋转混合。置于37°C，5%CO 2培养箱中₂ 小时。
8. 轻轻地将每个孔中的肠/培养基悬浮液移入微量离心管中。
9. 在室温下以300× g 离心3分钟，然后除去上清液，留下肠样沉淀。
10. 用 500 μL 温热的 DPBS 洗涤肠样。
11. 在室温下以300× g 离心3分钟，然后除去上清液，留下肠样沉淀。
12. 再重复步骤5.10-5.11三次，总共洗涤四次。
13. 用 1，000 μL 冷 DPBS 重悬每个沉淀，并剧烈上下移液以解离肠样。
14. 为以DPBS稀释的LY标准曲线制备标准品（100 ng/mL;50 ng/mL;25 ng/mL;12.5 ng/mL;6.25 ng/mL;3.13 ng/mL;1.57 ng/mL;0 ng/mL）。
15. 在 96 孔板上每孔吸取 150 μL 每个样品，一式三份。
16. 在能够读取荧光的酶标仪上测量428nm激发峰和536nm发射峰处的荧光（参见 材料表）。使用统计软件（见 材料表），通过插值标准曲线和使用四参数曲线来计算浓度。

结果

AO 构象
肠样悬浮在50%LWRN培养基中72小时，假设AO构象（图1）。 这是通过使用 顶端蛋白闭塞带-1（ZO-1）和基底外侧蛋白β-连环蛋白的肠样全支架进行免疫荧光染色证实的（图1）。AO肠样在肠的外侧顶端表面显示ZO-1（绿色），而β-连环蛋白（红色）在内基底外侧表面（图1A）。BO肠样显示出相反的情况，外表面...

讨论

肠通透性复杂，反映上皮屏障功能。肠道屏障包括介导跨细胞和细胞旁转运的单层上皮细胞¹⁴。细胞旁通透性依赖于紧密连接蛋白，这些蛋白密封上皮细胞之间的空间¹⁴。在这种细胞旁运输中，分子可以通过三种不同的途径交叉:孔隙、泄漏和不受限制的¹⁵。孔通路允许对小带电离子的渗透性，而泄漏通路允许更大的不带电分子跨越^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254