Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Resumen

El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.

Resumen

Los enteroides son una herramienta de investigación emergente en el estudio de enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante (ECN). Tradicionalmente se cultivan en la conformación basolateral hacia fuera (BO), donde la superficie apical de la célula epitelial se enfrenta a la luz interna. En este modelo, el acceso a la superficie luminal de los enteroides para el tratamiento y la experimentación es un desafío, lo que limita la capacidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno. Para evitar esto, se creó un modelo de salida apical neonatal (AO) para la enterocolitis necrosante. Dado que los cambios en la permeabilidad de las células epiteliales intestinales son patognomónicos para la ECN, este protocolo describe el uso del amarillo lucifer (LY) como marcador de permeabilidad paracelular. LY atraviesa la barrera epitelial intestinal a través de las tres vías paracelulares principales: poro, fuga y sin restricciones. El uso de LY en un modelo AO permite un estudio más amplio de la permeabilidad en ECN. Después de la aprobación del IRB y el consentimiento de los padres, se recolectaron muestras quirúrgicas de tejido intestinal de neonatos prematuros humanos. Las células madre intestinales se cosecharon mediante aislamiento de cripta y se utilizaron para cultivar enteroides. Los enteroides se cultivaron hasta la madurez y luego se transformaron AO o se dejaron en conformación BO. Estos no fueron tratados (control) o fueron tratados con lipopolisacáridos (LPS) y sometidos a condiciones hipóxicas para la inducción de ECN in vitro . LY se utilizó para evaluar la permeabilidad. La tinción inmunofluorescente de la proteína apical zonula occludens-1 y la proteína basolateral β-catenina confirmaron la conformación AO. Tanto los enteroides AO como BO tratados con LPS e hipoxia demostraron un aumento significativo de la permeabilidad paracelular en comparación con los controles. Tanto los enteroides AO como BO mostraron una mayor captación de LY en la luz de los enteroides tratados en comparación con los controles. La utilización de LY en un modelo enteroide AO permite la investigación de las tres vías principales de permeabilidad paracelular. Además, permite la investigación de las interacciones huésped-patógeno y cómo esto puede afectar la permeabilidad en comparación con el modelo enteroide BO.

Introducción

Los enteroides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas de células madre intestinales humanas con órganos restringidos ^1,2. Están formados enteramente por linaje epitelial y contienen todos los tipos de células epiteliales intestinales diferenciadas². Los enteroides también mantienen la polaridad celular formada por una superficie luminal apical que forma un compartimento interno y una superficie basolateral frente al medio circundante. Los enteroides son un modelo único en el sentido de que conservan las características del huésped a partir del cual se generaron

Protocolo

La presente investigación se realizó de conformidad con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB, # 11610, 11611) en la Universidad de Oklahoma. Se requirió el consentimiento de los padres antes de recolectar muestras quirúrgicas humanas según las especificaciones del IRB. Tras la aprobación del IRB y el consentimiento de los padres, se obtuvo tejido del intestino delgado humano de lactantes (edad gestacional corregida [AG] que oscilaba entre 36 y 41 semanas en el momento de la recolección de la muestra, todos con antecedentes de parto prematuro con una AG estimada de 25 a 34 semanas, 2:1 M:F) sometidos a cirugía para ECN u otra resección intestinal, c....

Resultados

Conformación AO
Los enteroides suspendidos en medios LWRN al 50% durante 72 h asumen una conformación AO (Figura 1). Esto se confirmó mediante tinción inmunofluorescente utilizando monturas enteroides enteroides de la proteína apical, zonula occludens-1 (ZO-1), y la proteína basolateral, β-catenina (Figura 1). Los enteroides AO muestran ZO-1 (verde) en la superficie externa y apical del enteroide, mientras que la β-catenina (.......

Discusión

La permeabilidad intestinal es compleja y refleja la función de barrera epitelial. La barrera intestinal comprende una sola capa de células epiteliales que media el transporte transcelular y paracelular¹⁴. La permeabilidad paracelular depende de proteínas de unión estrecha que sellan el espacio entre las células epiteliales¹⁴. Dentro de este transporte paracelular, hay tres vías distintas por las cuales las moléculas pueden cruzar: poro, fuga y sin restricciones

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
[leu] 15-gastrin 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm sterile cell strainer	Corning	431752
100% LWRN conditioned media	Made in-house following Miyoshi et al.12
24-well tissue culture plate	Corning	3526
96-well black, clear bottom plate	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000	Invitrogen	A-11032
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200	Cell Signaling	#D6L1E
Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 supplement minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Barrier PAP pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM (Matrigel)	Corning	CB-40230C
Cell Recovery Solution	Corning	354270
Dissecting scissors
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
Epidermal Growth Factor (EGF)	Millipore Sigma	GF144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 Imaging system	Invitrogen	AMF7000
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-Products	100-525
Fluoroshield with DAPI	Millipore Sigma	F6057-20mL
Forceps
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
Glass coverslips
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
Lipopolysaccharide (LPS)	Millipore Sigma	L2630-25MG
Lucifer Yellow CH, Lithium Salt	Invitrogen	L453
Modular incubator chamber	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-Acetylcysteine	Millipore Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Millipore Sigma	N0636-100G
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148
Refrigerated swinging bucket centrifuge
Refrigerated tabletop microcentrifuge
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 microplate reader	Molecular devices
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate	Corning	3473
Y-27632, ROCK inhibitor (RI)	Tocris	1254